Abstract
Derzeit gibt es viele chemische Werkzeuge zur Verfügung, chemische Sonden in Proteine einzuführen ihrer Struktur und Funktion zu untersuchen. Ein geeignetes Verfahren ist Proteinkonjugation durch genetisch eine unnatürliche Aminosäure Einführen einer bioorthogonale funktionelle Gruppe enthalten. Dieser Bericht beschreibt ein detailliertes Protokoll für die ortsspezifische Antikörper-Konjugation. Das Protokoll umfasst die experimentelle Details für die genetische Einbau eines azidhaltigen Aminosäure und die Konjugationsreaktion durch dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo (SPAAC). Dieser Stamm-vermittelte Reaktion verläuft durch einfaches Mischen der reagierenden Moleküle bei physiologischem pH-Wert und Temperatur, und erfordert keine zusätzlichen Reagenzien wie Kupfer (I) -Ionen und Kupfer-Chelat-Liganden. Daher würde diese Methode für die allgemeine Proteinkonjugation und Entwicklung von Antikörper-Arzneimittel-Konjugate (ADCs) nützlich sein.
Introduction
Da der genetische Einbau von p -methoxyphenylalanine in Escherichia coli wurde berichtet, 1 mehr als 100 unnatürliche Aminosäuren (UAAs) wurden in verschiedene Proteine erfolgreich eingebaut. 1-3 Unter diesen UAAs die Aminosäuren bioorthogonale funktionellen Gruppen wurden intensiv untersucht und stellen den größten Anteil enthält. Die bioorthogonale funktionellen Gruppen in den UAAs verwendet werden , umfassen Ketone, 4 Azid, 5 Alkin, 6 Cyclooctin, 7 Tetrazin, 8 α, β-ungesättigten Amids, 9 Norbonen, 10 transcyclooctene, 11 und Bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 Obwohl jede funktionelle Gruppe ihre Vor- und Nachteile hat, die azidhaltigen Aminosäuren am intensivsten wurden für die Protein Konjugation verwendet. p -Azidophenylalanine (AF), eine der Azido-enthaltenden Aminosäuren, ist leicht verfügbar, und ihre Inkorporation efficiency ist ausgezeichnet. Mutant Proteine diese Aminosäure enthalten, können mit Alkinen durch Kupfer-katalysierte Cyclo oder mit Cyclooctenen von SPAAC umgesetzt werden. 12-20
In letzter Zeit wurden Biopharmazeutika große Aufmerksamkeit in der pharmazeutischen Industrie zu gewinnen. Der Antikörper-Arzneimittel - Konjugat (ADC) ist eine Klasse von therapeutischen Antikörpern , die aufgrund ihrer Fähigkeit zur gezielten Therapie für die Behandlung von menschlichen Krebserkrankungen 21 vorteilhaft sind und anderen Krankheiten. Mehr als 50 ADCs sind derzeit in klinischen Studien, und die Zahl steigt schnell. In Entwicklung von ADCs, müssen viele Faktoren berücksichtigt werden, um die Wirksamkeit zu maximieren und die Nebenwirkungen zu minimieren. Unter diesen Faktoren eine effiziente und stellenspezifische Konjugationsreaktion zu einer kovalenten Bindung zwischen einem Antikörper bilden, und ein Medikament ist kritisch. Die gewünschte Effizienz und Spezifität in der Konjugationsreaktion kann in eine durch Konjugation mit einem bioorthogonale funktionelle Gruppe erreicht werden,unnatürliche Aminosäure, die in einem Antikörper, der spezifisch eingeschlossen ist. Hier 22-26 berichten wir über ein Protokoll zur ortsspezifisch integrieren AF in einem Antikörper-Fragment und konjugieren das mutierte Antikörperfragment mit einer biochemischen Sonde.
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Protocol
1. Plasmidkonstruktion
- Konstruieren eines Expressionsplasmids (pBAD-HerFab-L177TAG) , die das Ziel - Antikörper - Gen (pBAD-HerFab-WT) mit einem His 6 -tag zum Ausdruck bringen würde, und ersetzen Sie das Codon für Leucin-177 mit dem Amber - Codon (TAG) 27, unter Verwendung von herkömmliche ortsspezifische Mutagenese-Technik.
Siehe Tabelle der Materialien. - Konstruieren Sie ein anderes Expressionsplasmid (pEVOL-AFRS) , um die Gene für die entwickelte tRNA Tyr und Aminoacyl-tRNA - Synthetase (aaRS) Paar enthält. Verwenden Sie die speziell entwickelten Plasmidvektor, pEVOL, für einen effizienten Einbau von UAAs. Die detaillierten Informationen Plasmid und das Klonen Protokolle werden im vorherigen Bericht beschrieben. 28
- Erhalten Sie qualitativ hochwertige Plasmid-DNA durch kommerziell erhältliche Plasmid Vorbereitungs-Kits verwenden. Das 260/280 Verhältnis von ~ 1,8 ist optimal für die gereinigte DNA. Bei Bedarf durchführen 1% Agarose-Gelelektrophorese, die Reinheit der DNA zu überprüfen.
- Elektroporation
- Fügen Sie jede 1 & mgr; l DNA von pEVOL-AFRS 28 und pBAD-HerFab-L177TAG bis 20 & mgr; l Escherichia coli DH10β Stamm. Vorsichtig mischen, mit einer Pipette. Die Plasmide können zusammen oder in unabhängigen Reaktionen umgewandelt werden.
- Für 0,1 cm Küvetten, stellen Sie die Elektroporation Einstellungen bis 25 uF und 2,5 kV.
- Setzen Sie die Küvette in die Folie von der schockierenden Kammer. Schieben Sie den Schlitten in die Kammer, bis die Küvette einen festen Kontakt mit den Kammerelektroden macht.
- Pulse einmal durch den Puls-Taste, bis die Elektroporation Gerät einen Signalton drücken.
- 1 ml SOB-Medium mit Katabolitrepression (SOC) Medium , enthaltend 2% (w / v) Trypton, 0,5% (w / v) Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 und 20 mM Glucose in die Küvette um die Mischung in ein Reagenzglas schnell und übertragen. Inkubieren der Zellen für 1 h bei 37 ° C unter Schütteln.
- Spread transformierte E. coli - Zellen auf LB-Medium (LB) Agarplatten , die entsprechenden Antibiotika (35 ug / ml Chloramphenicol und 100 ug / ml Ampicillin zur Selektion pEVOL-AFRS und pBAD-HerFab-L177TAG, respectively). Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 12 h.
- Kultur Vorbereitung
- Impfen eine einzelne transformierte Kolonie in 5 ml LB-Medium mit Antibiotika. Inkubieren für 12 h bei 37 ° C unter Schütteln.
3. Expression und Reinigung von HerFab-L177AF
- Die Expression von HerFab-L177AF
- Übertragung der Primärkultur (5 ml) in 200 ml LB-Medium, das Ampicillin (100 ug / ml) und AF (1 mM), gefolgt von Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln.
HINWEIS: 100 mM AF-Stammlösung (10 ml) wurde durch Auflösen von 206 mg AF in 100 mM Salzsäure (10 ml, Endvolumen) hergestellt. - In 2 ml 1,6 M Arabinose (16mM Endkonzentration) , wenn die Kultur der log-Phase erreicht (OD 550 = 0,8, OD = optische Dichte). Inkubieren für 12 h bei 30 ° C unter Schütteln.
- Ernte die Zellen durch Zentrifugieren bei 11.000 xg für 5 min. Überstand verwerfen und gefrier das Pellet bei -20 ° C.
- Übertragung der Primärkultur (5 ml) in 200 ml LB-Medium, das Ampicillin (100 ug / ml) und AF (1 mM), gefolgt von Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln.
- Zelllyse
- die Mischung 1 h bei 37 ° C Resuspendieren der Zellpellets in 20 ml Puffer periplasmatischen Lyse, enthaltend 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% Sucrose und 0,2 mg / ml Lysozym und inkubieren.
- Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 18.000 × g bei 4 ° C für 15 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen und verwerfen das Pellet.
- Ni-NTA - Affinitätschromatographie
- Hinzufügen Ni-NTA-Harz Suspension zu jedem Zentrifugenröhrchen (400 & mgr; l Harz für eine 200 ml-Kultur) und vorsichtig mischen bei 4 ° C für 1 h.
- Gießen Sie die Suspension in eine Polypropylensäule und wäscht das Harz dreimal mit 5 ml Wasch buffer enthaltend 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 20 mM Imidazol und 300 mM NaCl.
- Eluieren des Zielantikörpers mit 300 & mgr; l Elutionspuffer, der 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 250 mM Imidazol und 300 mM NaCl.
- Bestimmen Konzentration des mutierten Proteins durch Bradford-Test 29 oder durch die Absorption bei 280 nm gemessen wird . Berechnen Sie den Extinktionskoeffizienten (75.866 M -1 cm -1) für HerFab-L177AF bei 280 nm durch Protein - Extinktionskoeffizient Rechner unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten (2471 M -1 cm -1) für AF.
HINWEIS: Die Aminosäuresequenz von HerFab kann in der NCBI-Website (: 783.282.791 und GI: 783282792 GI) zu finden.
4. Konjugation von Purified HerFab-L177AF mit Alkin-Sonden mit Dehnungs geförderten Azid-Alkin-Cyclo (SPAAC)
- Geben Sie 20 & mgr; l Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) in H 2 O (20081; M Endkonzentration) wurde zu einer Lösung von 10 & mgr; l-HerFab L177AF (10 uM Endkonzentration) in Phosphatpuffer 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7,0) und 100 mM NaCl enthält.
HINWEIS: Als Alternativen difluoriert Cyclooctin (DIFO) und Bicyclo [6.1.0] Nonin (BCN) Derivate sind für die gleiche Anwendung ebenfalls zur Verfügung. - Lassen Sie die dehnungs gefördert Cycloadditionsreaktion für 6 h bei 37 ° C fortzufahren. Wenn eine lichtempfindliche Sonde (zB Cy5.5) verwendet wird, umfassen das Reaktionsgefäß mit einer Aluminiumfolie.
- Man reinige den markierten HerFab gemäß Schritt 5.
5. Reinigung von Beschriftete HerFab
- Fügen 500 ul Probe einem Zentrifugalfilter Spinsäule.
- Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 14.000 × g bei 4 ° C für 15 min.
- Durchfluss verwerfen und Transferprobe aus dem Spin-Säule in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gereinigt.
- Als Alternative 5.1- 5.3 zu Schritt, führen Purification durch Dialyse gegen den gleichen Puffer.
- Lagern Sie die gereinigte markierte HerFab bei 4 ° C.
6. SDS-PAGE-Analyse von Beschriftete HerFab
- Werden 5 & mgr; l LDS Proteinprobenpuffer mit 106 mM Tris · HCl, 141 mM Tris-Base (pH 8,5), 2% LDS, 10% Glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blau G250 und 0,175 mM Phenolrot bis 13 & mgr; l (-) von 2 & mgr; l Dithiothreitol (DTT, 100 mM Endkonzentration) HerFab (7,8 uM bzw. 0,38 mg / ml) in Gegenwart (+) oder Abwesenheit markierter gereinigt. Inkubieren der Mischung bei 95 ° C für 10 min.
- Bringen Sie die 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE-Gel-Kassette in die Elektrophorese-Zelle und fügen Puffer läuft. Laden Sie die konjugierte Proteinproben und die vorgefärbten Molekulargewichtsmarker. Führen Gelelektrophorese für 35 min bei 200 V.
Hinweis: Halten Sie die Elektrophorese-Zelle im Dunkeln während des gesamten Zeitraums Photobleaching des Fluorophors zu minimieren. - Nach der Elektrophorese übertragendas Gel mit einem Fluoreszenz-Gel-Scanners und Scannen für die Fluoreszenzemission bei der entsprechenden Wellenlänge. Für Cy5.5, verwenden Sie die Cy5-Modus in der Scanner-Software.
- Beflecken das Gel mit einem handelsüblichen Proteinfleck.
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Representative Results
In dieser Studie wurde ein Antikörperfragment ortsspezifisch mit einem Fluorophor konjugiert durch ein Azid enthaltenden Aminosäure in dem Fragment enthält , und das mutante Antikörperfragment mit einem gespannten Cyclooctin Umsetzung von (Abbildung 1). HerFab wurde als Zielantikörperfragment ausgewählt ist, in die AF als Azid-enthaltende Aminosäure eingebaut wurde. Zu dem Rückstand in HerFab für den Ersatz mit AF, die Röntgenkristallstruktur von HerFab wählen, wurde analysiert. 30. Wichtige Voraussetzungen für den Rest umfassen in ausreichender Entfernung von der Bindungsstelle Antikörper die Abnahme seiner Bindungsaffinität und Lösungsmittelzugänglichkeit für effiziente Konjugationsreaktion zu minimieren. Leucin an Position 177 war ein ordentliches Kandidat, weil der Rückstand gut außerhalb des Antikörpers und in der Nähe der Grenzfläche von zwei Immunglobulin-Domänen freigelegt ist, die sich von der Antikörperbindungsstelle entfernt ist.
Inhalt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Zunächst wird das Expressionsplasmid für HerFab mit einem C-terminalen wurde His 6 -tag aufgebaut, und ein Amber - Codon wurde an der Position 177 für AF - Einbau durch Stelle eingeführt -dirigierten Mutagenese. die Mutante HerFab AF enthält , wurde in Gegenwart von 1 mM AF durch Co-exprimieren der entwickelten tRNA Tyr und Aminoacyl-tRNA - Synthetase - Paar , ausgedrückt. 27 Ni-NTA Affinitätsreinigung wurde für die mutierten Proteine in Gegenwart ausgedrückt durchgeführt und Abwesenheit von AF, und die folgende SDS-PAGE Analyse zeigte , dass das Antikörperfragment in voller Länge nur in Gegenwart von AF erhalten (Abbildung 2). Als nächstes wird das mutante Antikörperfragment enthält , wurde für AF Konjugationsreaktion mit Cy5.5 ausgewertet -verknüpften aza-dibenzocyclooctyne Derivat (Cy5.5-ADIBO). das Antikörperfragment und Cy5.5-ADIBO wurden in einem Phosphatpuffer für 6 h umgesetzt und das Reaktionsgemisch wurde durch SDS-PAGE in Gegenwart analysiert (+) und Abwesenheit (-) Von DVB - T (Abbildung 3a). 25 Die Reaktion mit einem Wildtyp - Antikörper - Fragment wurde ebenfalls als Kontrolle durchgeführt und analysiert. Die Fluoreszenzbilder zeigten deutlich, Konjugation des mutierten Antikörperfragment mit Cy5.5-ADIBO, während keine Konjugation in der Reaktion mit dem Wildtyp-Fragment beobachtet wurde. Durch Elektronenspray Ionisation Massenspektrometrie (ESI-MS) Analyse zeigte quantitative Konjugation ohne nachweisbare unconjugated Fragment (Abbildung 3b). Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass die Mutante HerFab AF enthält, effizient sein kann und bequem konjugiert mit gespannten Cyclooctenen durch SPAAC ohne zusätzliches Reagenz.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der ortsspezifischen Antikörpermarkierung von SPAAC.blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Expression von mutierten HerFab enthält AF an Position 177 (L177) in Gegenwart des entwickelten tRNA / aaRS Paar. Die Expression von HerFab-L177AF in LB-Medium, das entwickelt tRNA / AFRS Paar und 1 mM AF enthält. (-) Gereinigten Proben wurden durch SDS-PAGE in der Gegenwart (+) oder Abwesenheit von DTT analysiert, und das Gel wurde mit einem handelsüblichen Protein-Färbung gefärbt. Abbildung von Ko angepasst, W. et al. 27. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Konjugation reagierenIon HerFab-L177AF mit Cy5.5-ADIBO. (A) SDS-PAGE - Analyse der Konjugationsreaktion von Wildtyp HerFab und HerFab-L177AF mit Cy5.5-ADIBO. (-) Die Reaktionsgemische wurden in Gegenwart (+) und Abwesenheit von DTT analysiert, und die Proteinbanden wurden mit einem kommerziellen Protein-Färbung (links) und Fluoreszenz-Bildgebung (rechts) sichtbar gemacht. (B) ESI-MS - Analysen von HerFab-L177AF (links) und HerFab-L177AF markiert mit Cy5.5-ADIBO (rechts): erwartete Massendifferenz zwischen HerFab- L177AF und dem konjugierten Antikörper = 1.190 Da, Massendifferenz = 1.190 Da beobachtet . Abbildung von Ko angepasst, W. et al. 27. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die genetische Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Verfahren zur Proteinmodifikation verwendet. 1-3 Einer der wichtigen Vorteile ist die allgemeine Anwendbarkeit auf jede Art von Protein. Im Prinzip gibt es keine Begrenzung für ein Zielprotein und eine Zielstelle des Proteins in der Auswahl. Jedoch Ersetzen eines strukturell oder funktionell wichtigen Rückstand mit einem UAA resultieren, die die Struktur und Funktion des Zielproteins in verändern. Im Allgemeinen Reste, die ausgesetzt sind Lösungsmittel und keine Wechselwirkung mit anderen Reste sind für den Einbau von UAAs ausgewählt. Daher wird strukturellen Informationen von einer hochaufgelöste Kristallstruktur verwendet, um eine optimale Stellen für UAA Inkorporation wählen. Da 30 die Einarbeitung von UAAs technisch einfach und erfordert eine einfache Mutagenese können mehrere Seiten leicht einen optimalen Rest ausgewählt für eine gewünschte Funktion eines Zielproteins gescreent werden. </ P>
In diesem Protokoll wird AF genetisch in ein Antikörperfragment, eingearbeitet und das mutierte Fragment ist ortsspezifisch mit einem Fluorophor markiert, unter Verwendung SPAAC. Die Konjugation Ausbeute dieses Verfahren ist quantitativ ohne unerwünschte Reaktion, die eine wichtige Verbesserung gegenüber dem vorherigen Bericht. 25 Dies wurde durch sorgfältige Strukturanalyse für die Auswahl eines optimalen Standort und eine Erhöhung der Reaktionszeit erreicht. Daher ist die Wahl des Aufstellungsortes für die UAA Inkorporation kritisch für die schnelle und quantitative conjugation. Darüber hinaus ist die Verwendung von effizienten UAA Inkorporation Systemen (zB pEvol-AFRS) auch entscheidend für die Proteinausbeute und Einbaueffizienz. 28
Andere UAAs Einbau in Proteine durch genetische Verfahren zur Inkorporation Proteinkonjugation kann auch für die Antikörper-Konjugation verwendet werden. 11.04 Im Hinblick auf die Reaktionsgeschwindigkeit, Kupfer-katalysierte Cycloaddition,sowie inverse Elektronenbedarf Diels-Alder - Reaktion Tetrazinen 8 und gespannte Alkene oder Alkine verwenden, werden 7 besser sein als die SPAAC in dieser Studie verwendet. Jedoch erfordert die Kupfer-katalysierte Cycloadditionsreaktion Kupfer (I) ion und Liganden, 31 und die Aminosäuren , für die Diels-Alder - Reaktion sind oft synthetisch anspruchsvoll , und nicht stabil genug für quantitative conjugation. Keton- Hydroxyamin Kondensations 4 kann auch für den gleichen Zweck verwendet werden. Es erfordert jedoch mäßig sauren Bedingungen, und ihre Reaktionsgeschwindigkeit ist langsamer als die des SPAAC. Unter Berücksichtigung der Faktoren wie kommerzielle und synthetische Zugänglichkeit von nichtnatürlichen Aminosäuren, die Reaktionsgeschwindigkeit, Bio-Orthogonalität, Biokompatibilität von Reaktionsbedingungen und Einbaueffizienz von nichtnatürlichen Aminosäuren, die Methode der SPAAC mit und genetisch mischte AF wäre nützlich für die Entwicklung modifizierter therapeutische Proteine, wie ADCs sowie für allgemeineProteinmarkierung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture Preparation | |||
| 2.1 Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Cell Lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500 μL capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences | ||
References
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