Abstract
Ci sono attualmente molti strumenti chimici a disposizione per introdurre sonde chimiche in proteine per studiare la loro struttura e funzione. Un metodo utile è la coniugazione di proteine geneticamente introducendo un amminoacido non naturale contenente un gruppo funzionale bioorthogonal. Questo rapporto descrive un protocollo dettagliato per site-specific anticorpi coniugazione. Il protocollo comprende dettagli sperimentali per la costituzione genetica di un aminoacido azide contenenti, e la reazione di coniugazione per cicloaddizione azide-alchino strain-promosso (SPAAC). Questa reazione strain-promosso procede per semplice miscelazione delle molecole reagenti a pH fisiologico e temperatura, e non richiede reagenti aggiuntivi come rame (I) ioni e leganti rame-chelanti. Pertanto, questo metodo sarebbe utile per la coniugazione di proteine generale e sviluppo di anticorpi coniugati farmaco (ADC).
Introduction
Dal momento che la costituzione genetica di p -methoxyphenylalanine in Escherichia coli è stato segnalato, 1 più di 100 amminoacidi non naturali (UAAs) sono stati inseriti con successo in varie proteine. 1-3 Tra questi UAAs, gli aminoacidi contenenti gruppi funzionali bioorthogonal sono stati ampiamente studiati e rappresentano la percentuale più elevata. I gruppi funzionali bioorthogonal utilizzati nei UAAs includono chetone, 4 azide, 5 alchino, 6 cyclooctyne, 7 tetrazina, 8 α, β-insaturo ammide, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 e biciclo [6.1.0] -nonyne. 11 Sebbene ogni gruppo funzionale ha i suoi vantaggi e svantaggi, gli amminoacidi azide contenenti più sono stati ampiamente utilizzati per la coniugazione di proteine. p -Azidophenylalanine (AF), uno degli amminoacidi azido-contenente, è prontamente disponibile, e la sua incorporazione efficiency è eccellente. proteine mutanti contenenti questo aminoacido può essere fatto reagire con alchini di cicloaddizione di rame-catalizzata o con cyclooctynes di SPAAC. 12-20
Recentemente, biofarmaceutici hanno attratto grande attenzione nel settore farmaceutico. Il coniugato anticorpo-farmaco (ADC) è una classe di anticorpi terapeutici che sono vantaggiosi per la loro capacità di terapia mirata per il trattamento dei tumori umani 21 e altre malattie. Più di 50 ADC sono attualmente in sperimentazione clinica, e il numero è in rapido aumento. Nello sviluppo di ADC, molti fattori devono essere considerati per massimizzare l'efficacia e minimizzare gli effetti collaterali. Tra questi fattori, una reazione di coniugazione efficiente e sito-specifica per formare un legame covalente tra un anticorpo ed un farmaco è critica. L'efficienza desiderata e specificità nella reazione di coniugazione può essere ottenuto mediante coniugazione con un gruppo funzionale in un bioorthogonalamminoacido non naturale che è specificamente incorporata in un anticorpo. 22-26 Qui, si segnala un protocollo al sito-specifico incorporano AF in un frammento di anticorpo e coniugare il frammento di anticorpo mutante con una sonda biochimico.
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Protocol
1. Costruzione plasmide
- Costruire un plasmide di espressione (pBAD-HerFab-L177TAG) che esprimesse il gene bersaglio degli anticorpi (pBAD-HerFab-WT) con il suo 6 -tag, e sostituire il codone per la leucina-177 con il codone ambra (TAG) 27, utilizzando convenzionale tecnica di mutagenesi sito-diretta.
Vedere la Tabella dei Materiali. - Costruire un altro plasmide di espressione (pEVOL-AFRS) contenente i geni per il tRNA evoluta Tyr e-tRNA sintetasi coppia (AARS). Utilizzare il vettore plasmide appositamente progettato, pEVOL, per un efficiente incorporazione di UAAs. Le dettagliate protocolli di informazione plasmide e la clonazione sono descritti nella relazione precedente. 28
- Ottenere DNA plasmidico di alta qualità utilizzando kit di preparazione plasmide disponibili in commercio. Il rapporto di 260/280 di ~ 1.8 è ottimale per il DNA purificato. Se richiesto, eseguire 1% elettroforesi su gel di agarosio per verificare la purezza del DNA.
- elettroporazione
- Aggiungere ogni DNA 1 ml di pEVOL-AFRS 28 e pBAD-HerFab-L177TAG a 20 microlitri ceppo di Escherichia coli DH10β. Mescolare delicatamente, con una pipetta. I plasmidi possono essere trasformati insieme o in reazioni indipendenti.
- Per 0,1 cm cuvette, configurare le impostazioni di elettroporazione a 25 mF e 2,5 kV.
- Inserire la cuvetta nella diapositiva della camera di scioccante. Spingere la slitta nella camera fino a quando la provetta entra in contatto costante con gli elettrodi da camera.
- Pulse una volta premendo il pulsante di impulso fino a quando il segnale acustico della macchina elettroporazione.
- Aggiungere 1 ml di brodo eccellente ottimale con catabolite rimozione (SOC) mezzo contenente 2% (w / v) triptone, 0,5% (w / v) di estratto di lievito, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl 2, e 20 mM di glucosio alla cuvetta rapidamente e trasferire il composto in una provetta. Incubare le cellule per 1 ora a 37 ° C con agitazione.
- Le cellule di E. coli diffusione trasformato in lisogenia brodo (LB) piastre di agar contenenti antibiotici appropriati (35 mg / ml cloramfenicolo e 100 mg / ml ampicillina per la selezione pEVOL-AFRS e pBAD-HerFab-L177TAG, rispettivamente). Incubare le piastre a 37 ° C per 12 h.
- preparazione Cultura
- Inoculare una singola colonia trasformata in 5 ml LB medie contenenti antibiotici. Incubare per 12 ore a 37 ° C con agitazione.
3. Espressione e purificazione di HerFab-L177AF
- L'espressione di HerFab-L177AF
- Trasferire la coltura primaria (5 mL) in 200 mL LB contenente ampicillina media (100 ug / mL) e AF (1 mM), seguita da incubazione a 37 ° C con agitazione.
NOTA: soluzione madre 100 mM AF (10 mL) è stata preparata sciogliendo 206 mg AF in 100 mM di acido cloridrico (10 mL, volume finale). - Aggiungere 2 ml di 1,6 M arabinosio (16mM concentrazione finale) quando la cultura raggiunge il log-fase (OD 550 = 0,8, OD = densità ottica). Incubare per 12 ore a 30 ° C con agitazione.
- Celle di raccolta per centrifugazione a 11.000 xg per 5 min. Gettare il surnatante e congelare il pellet a -20 ° C.
- Trasferire la coltura primaria (5 mL) in 200 mL LB contenente ampicillina media (100 ug / mL) e AF (1 mM), seguita da incubazione a 37 ° C con agitazione.
- La lisi cellulare
- Risospendere il pellet di cellule in 20 mL di tampone di lisi periplasmic contenente 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% di saccarosio e 0,2 mg / ml di lisozima e incubare la miscela per 1 ora a 37 ° C.
- Centrifugare il lisato cellulare a 18.000 xga 4 ° C per 15 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e scartare il pellet.
- Ni-NTA cromatografia di affinità
- Aggiungere sospensione resina Ni-NTA ad ogni provetta da centrifuga (400 microlitri di resina per una cultura 200 mL), e mescolare delicatamente a 4 ° C per 1 h.
- Versare la sospensione in una colonna polipropilene e lavare la resina tre volte con 5 mL bu lavaggioffer contenente 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 20 mM imidazolo, e 300 mm NaCl.
- Eluire l'anticorpo bersaglio con 300 microlitri di tampone di eluizione contenente 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 250 mm imidazolo, e 300 mm NaCl.
- Determinare la concentrazione della proteina mutante Metodo di Bradford 29 o misurando l'assorbanza a 280 nm. Calcolare il coefficiente di estinzione (75.866 M -1 cm -1) per HerFab-L177AF a 280 nm da proteine estinzione calcolatrice coefficiente utilizzando il coefficiente di estinzione (2.471 M -1 cm -1) per AF.
NOTA: La sequenza aminoacidica del HerFab può essere trovata sul sito NCBI (GI: 783.282.791 e GI: 783.282.792).
4. Coniugazione purificata HerFab-L177AF con Acetilene sonde Utilizzando cicloaddizione azide-alchino Strain-promossa (SPAAC)
- Aggiungere 20 ml di Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) in H 2 O (20081; M concentrazione finale) ad una soluzione di 10 ml di HerFab-L177AF (10 mM concentrazione finale) in tampone fosfato contenente 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7,0) e 100 mM NaCl.
NOTA: Come alternative, cyclooctyne difluorinated (DIFO) e biciclo [6.1.0] nonyne (BCN) derivati sono disponibili per la stessa applicazione anche. - Lasciare che la reazione di cicloaddizione strain-promosso procedere per 6 ore a 37 ° C. Se viene utilizzata una sonda fotosensibile (ad esempio, Cy5.5), coprire il recipiente di reazione con un foglio di alluminio.
- Purificare il HerFab etichettati in base al punto 5.
5. Purificazione di etichetta HerFab
- Aggiungere 500 ml di campione in una colonna di filtro rotativo centrifugo.
- Centrifugare la colonna di spin a 14000 g a 4 ° C per 15 min.
- Gettare flusso continuo e il trasferimento purificati campione dalla colonna di selezione per una provetta da microcentrifuga da 1,5.
- In alternativa al passo 5.1 5.3, eseguire purificazione mediante dialisi contro lo stesso tampone.
- Conservare il purificato etichettato HerFab a 4 ° C.
6. SDS-PAGE analisi di etichetta HerFab
- Aggiungere 5 ml LDS tampone proteica contenente 106 mm Tris · HCl, 141 mm di base Tris (pH 8,5), 2% LDS, 10% glicerolo, 0,51 mm EDTA, di 0,22 mm SERVA Blu G250, e 0,175 mm Rosso fenolo a 13 ml di purificato etichettati HerFab (7.8 mM o 0,38 mg / ml) in presenza (+) o in assenza (-) di 2 microlitri ditiotreitolo (DTT, 100 mM concentrazione finale). Incubare la miscela a 95 ° C per 10 min.
- Fissare il 4-12% Bis-Tris gel SDS-PAGE cassette alla cella di elettroforesi e aggiungere tampone di corsa. Caricare i campioni di proteine coniugate e il marcatore di peso molecolare pre-colorato. Eseguire l'elettroforesi su gel per 35 minuti a 200 V.
Nota: Mantenere la cella di elettroforesi al buio durante l'intero periodo per ridurre al minimo fotometabolismo del fluoroforo. - Dopo l'elettroforesi, trasferireil gel ad uno scanner gel fluorescenti, e scansione per l'emissione di fluorescenza alla lunghezza d'onda appropriata. Per Cy5.5, utilizzare la modalità Cy5 nel software dello scanner.
- Macchia il gel con una macchia proteine commerciale.
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Representative Results
In questo studio, un frammento di anticorpo era sito-specifico coniugato con un fluorocromo incorporando un aminoacido azide contenente nel frammento e reagire il frammento di anticorpo mutante con un cyclooctyne teso (Figura 1). HerFab è stato selezionato come il frammento di anticorpo di destinazione in cui AF è stato accolto come un aminoacido azide contenenti. Per scegliere il residuo in HerFab per la sostituzione con AF, la struttura cristallina ai raggi X del HerFab stato analizzato. 30 requisiti importanti per il residuo includono una distanza sufficiente dal sito di legame dell'anticorpo per minimizzare la diminuzione della sua affinità di legame e accessibilità solvente per reazione di coniugazione efficiente. Leucina alla posizione 177 era candidato accettabile perché il residuo è ben esposta all'esterno dell'anticorpo e situato vicino all'interfaccia di due domini di immunoglobulina, che è distante dal sito di legame dell'anticorpo.
contenuti "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Inizialmente, il plasmide di espressione per HerFab con un C-terminale suo 6 -tag è stato costruito, e un codone di ambra è stato introdotto nella posizione 177 per AF incorporazione dal sito mutagenesi -directed. il HerFab mutante contenente AF era espresso in presenza di 1 mM AF mediante co-esprimono la coppia sintetasi tRNA Tyr e-tRNA evoluto. 27 Ni-NTA purificazione per affinità è stato eseguito per le proteine mutanti espressi in presenza e assenza di AF, e la seguente analisi SDS-PAGE ha mostrato che il frammento di anticorpo integrale è stata ottenuta solo in presenza di AF (Figura 2). Successivamente, il frammento di anticorpo mutante contenente AF è stata valutata per la reazione di coniugazione con Cy5.5 linked aza-dibenzocyclooctyne derivato (Cy5.5-ADIBO). il frammento anticorpale e Cy5.5-ADIBO sono stati reagito in un tampone fosfato per 6 ore, e la miscela di reazione è stata analizzata mediante SDS-PAGE in presenza (+) e assenza (-) Di DTT (figura 3a). 25 La reazione con un frammento anticorpale tipo selvatico è stata effettuata anche e analizzato come controllo. Le immagini di fluorescenza hanno mostrato chiaramente coniugazione del frammento di anticorpo mutante con Cy5.5-ADIBO, mentre nessun coniugazione è stata osservata nella reazione con il frammento wild type. Electron spruzzo di ionizzazione spettrometria di massa (ESI-MS) analisi ha mostrato coniugazione quantitativa senza frammento non coniugato rilevabile (Figura 3b). Nel complesso, questi risultati hanno mostrato che il mutante HerFab contenente AF può essere efficiente e conveniente coniugato con cyclooctynes tesi di SPAAC senza alcun reagente aggiuntivo.
Figura 1: Rappresentazione schematica di etichettatura degli anticorpi site-specific di SPAAC.blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Espressione dei HerFab mutante contenente AF alla posizione 177 (L177) in presenza della coppia tRNA / AARS evoluto. L'espressione di HerFab-L177AF in terreno LB contenente la coppia di tRNA / AFRS evoluta e 1 mm AF. campioni purificati sono stati analizzati mediante SDS-PAGE in presenza (+) o in assenza (-) di DTT, e il gel è stato colorato con un colorante proteico commerciale. Figura adattato da Ko, W. et al. 27. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Coniugazione reagireioni di HerFab-L177AF con Cy5.5-ADIBO. (A) analisi SDS-PAGE di reazione di coniugazione di tipo selvaggio HerFab e HerFab-L177AF con Cy5.5-ADIBO. Le miscele di reazione sono stati analizzati in presenza (+) e assenza (-) di DTT e bande proteiche sono state visualizzate mediante una macchia proteica commerciale (sinistra) e fluorescenza (destra). (B) ESI-MS analisi di HerFab-L177AF (a sinistra) e HerFab-L177AF marcato con Cy5.5-ADIBO (a destra): differenza di massa prevista tra HerFab- L177AF e l'anticorpo coniugato = 1.190 Da, osservata differenza di massa = 1.190 Da . Figura adattato da Ko, W. et al. 27. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'incorporazione genetica di aminoacidi non naturali in proteine ha diversi vantaggi rispetto ad altri metodi utilizzati per la modifica della proteina. 1-3 Uno dei vantaggi importanti è la sua applicabilità generale a qualsiasi tipo di proteina. In linea di principio, non vi è alcuna limitazione nella scelta di una proteina bersaglio e un sito target della proteina. Tuttavia, la sostituzione di un residuo strutturalmente o funzionalmente importante con SAU può comportare alterando la struttura e la funzione della proteina bersaglio. In generale, i residui che sono esposti al solvente e non interagiscono con altri residui sono scelti per incorporazione di UAAs. Pertanto, informazioni strutturali da una struttura cristallina ad alta risoluzione viene usato per scegliere siti ottimali per SAU incorporazione. 30 Poiché l'incorporazione di UAAs è tecnicamente semplice e richiede un semplice mutagenesi, più siti possono essere facilmente proiettati per selezionare un residuo ottimale per una funzione desiderata di una proteina bersaglio. </ P>
In questo protocollo, AF è geneticamente incorporato in un frammento di anticorpo, e il frammento mutante è il sito-specifico marcato con un fluoroforo, utilizzando SPAAC. La resa coniugazione di questo metodo è quantitativo senza alcuna reazione indesiderata, che è un miglioramento importante sopra il rapporto precedente. 25 Questo è stato ottenuto da una attenta analisi strutturale per la selezione di un sito ottimale e un aumento del tempo di reazione. Pertanto, la scelta del sito per SAU incorporazione è critica per la coniugazione veloce e quantitativa. Inoltre, l'uso di sistemi SAU incorporazione efficienti (ad esempio, pEvol-AFRS) è essenziale anche per la resa di proteine e l'efficienza di incorporazione. 28
Altri UAAs incorporati in proteine mediante metodo di incorporazione genetica per la coniugazione di proteine possono anche essere utilizzati per la coniugazione di anticorpi. 4-11 In termini di velocità di reazione, reazione di cicloaddizione rame catalizzata,così come inverso di elettroni-demand di reazione di Diels-Alder usando tetrazines 8 e alcheni tesi o alchini, 7 sarà migliore rispetto al SPAAC utilizzato in questo studio. Tuttavia, la reazione di cicloaddizione di rame catalizzata richiede di rame (I) e ioni leganti, 31 e gli aminoacidi per la reazione di Diels-Alder sono spesso sinteticamente impegnativo e non abbastanza stabile per coniugazione quantitativa. Chetone-Idrossilammina condensazione 4 può essere utilizzato anche per lo stesso scopo. Tuttavia, richiede condizioni moderatamente acide, e la sua velocità di reazione è più lenta di quella del SPAAC. Considerando i fattori quali l'accessibilità commerciale e sintetiche di aminoacidi non naturali, la velocità di reazione, bio-ortogonalità, biocompatibilità di condizioni di reazione, e l'efficienza di incorporazione di aminoacidi non naturali, il metodo di utilizzo SPAAC e geneticamente Incorporated AF sarebbe utile per sviluppare modificata proteine terapeutiche come ADC, nonché per generalietichettatura proteine.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture Preparation | |||
| 2.1 Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Cell Lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500 μL capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences | ||
References
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