Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

كفاءة والخاصة بالموقع الأجسام المضادة وصفها من قبل Cycloaddition-أزيد آلكاين-روجت سلالة

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54922
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Abstract

هناك حاليا الكثير من الأدوات الكيميائية المتاحة لتقديم تحقيقات الكيميائية إلى بروتينات لدراسة بنيتها ووظيفتها. وهناك طريقة مفيدة هو بروتين الاقتران عن طريق إدخال وراثيا من الأحماض الأمينية غير طبيعي يحتوي على مجموعة وظيفية bioorthogonal. ويصف هذا التقرير بروتوكول مفصلة لجسم تصريف للموقع المحدد. ويتضمن البروتوكول تفاصيل التجريبية لدمج الجيني للحمض الأميني التي تحتوي على أزيد، ورد فعل الاقتران قبل cycloaddition-أزيد آلكاين-روجت سلالة (SPAAC). هذا رد فعل روجت سلالة العائدات عن طريق خلط بسيط من جزيئات التفاعل في درجة الحموضة الفسيولوجية ودرجة الحرارة، و لا يتطلب الكواشف إضافية مثل النحاس (I) أيونات وبروابط-مخلبية النحاس. ولذلك، فإن هذا الأسلوب سيكون مفيدا للاقتران البروتين العام وتطوير تقارن المخدرات الأجسام المضادة (ADCS).

Introduction

منذ الابلاغ عن التأسيس الجيني لل-methoxyphenylalanine ص في القولونية، وأدرجت 1 أكثر من 100 الأحماض الأمينية غير طبيعية (UAAs) بنجاح في البروتينات المختلفة. 1-3 ومن بين هذه UAAs، والأحماض الأمينية التي تحتوي على المجموعات الوظيفية bioorthogonal وقد درس على نطاق واسع وتمثل النسبة الأكبر. وتشمل المجموعات الوظيفية bioorthogonal المستخدمة في UAAs كيتون، 4 أزيد، 5 آلكاين، 6 cyclooctyne، 7 tetrazine، 8 α، β-أميد غير المشبعة، 9 norbonene، 10 transcyclooctene و 11 و bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 على الرغم من كل مجموعة وظيفية مزاياه وعيوبه، وقد استخدمت في الأحماض الأمينية التي تحتوي على أزيد أكثر على نطاق واسع لتصريف البروتين. ص -Azidophenylalanine (AF)، واحد من الأحماض الأمينية التي تحتوي على azido وغير متوفرة بسهولة، وeffic تأسيسهاiency ممتازة. بروتينات متحولة تحتوي على هذه الأحماض الأمينية يمكن أن يكون رد فعل مع أمكانيات التي كتبها cycloaddition المحفز النحاس أو مع cyclooctynes ​​التي كتبها SPAAC. 12-20

في الآونة الأخيرة، المستحضرات الصيدلانية البيولوجية قد تجتذب اهتماما كبيرا في مجال الصناعات الدوائية. والمترافقة الأجسام المضادة المخدرات (ADC) هو فئة من الأجسام المضادة العلاجية التي هي مفيدة نظرا لقدرتها على العلاج الموجه لعلاج السرطانات البشرية 21 و أمراض أخرى. أكثر من 50 ADCS حاليا في التجارب السريرية، وعدد يتزايد بسرعة. في تطور ADCS، تحتاج إلى النظر فيها لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة وتقليل الآثار الجانبية العديد من العوامل. ومن بين هذه العوامل، وهي فعالة وخاصة بالموقع رد فعل الاقتران لتشكيل الرابطة التساهمية بين الأجسام المضادة والمخدرات أمر بالغ الأهمية. كفاءة المطلوبة والدقة في رد فعل الاقتران يمكن أن يتحقق عن طريق الاقتران مع مجموعة وظيفية bioorthogonal فيالأحماض الأمينية غير طبيعي أن يتم تضمينها على وجه التحديد إلى الضد. 22-26 هنا، ونحن التقرير بروتوكول لموقع على وجه التحديد دمج AF إلى جزء الأجسام المضادة وتصريف جزء الأجسام المضادة متحولة مع التحقيق الذي تجريه والكيمياء الحيوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. البلازميد البناء

  1. بناء على التعبير البلازميد (pBAD-HerFab-L177TAG) التي من شأنها التعبير عن الجين الضد المستهدف (pBAD-HerFab-WT) مع صاحب 6 -tag، واستبدال رامزة لوسين-177 مع كودون العنبر (TAG) 27، وذلك باستخدام التقليدية تقنية الطفرات موقع الموجه.
    انظر الجدول المواد.
  2. بناء التعبير البلازميد آخر (pEVOL-AFRS) التي تحتوي على جينات الحمض الريبي النووي النقال صور تطورت وأمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال مخلقة (AARS) زوج. استخدام ناقلات البلازميد المصممة خصيصا، pEVOL، لإدراجها كفاءة UAAs. يتم وصف البروتوكولات المعلومات البلازميد والاستنساخ مفصلة في التقرير السابق. 28
  3. الحصول على جودة عالية DNA البلازميد باستخدام المتاحة تجاريا مجموعات إعداد البلازميد. نسبة 260/280 من ~ 1.8 هو الأمثل لالحمض النووي المنقى. إذا لزم الأمر، نفذ 1٪ هلام الاغاروز الكهربائي للتحقق من نقاء الحمض النووي.

الصورة = "jove_title"> 2. إعداد ثقافة

  1. Electroporation لل
    1. إضافة كل DNA 1 ميكرولتر من pEVOL-AFRS 28 و pBAD-HerFab-L177TAG إلى 20 ميكرولتر كولاي DH10β سلالة. المزيج بلطف، وذلك باستخدام ماصة. البلازميدات يمكن أن تتحول معا أو في ردود الفعل مستقلة.
    2. 0.1 سم cuvettes، تعيين إعدادات Electroporation لل25 μF و 2.5 كيلو فولت.
    3. إدراج كفيت في الشريحة الغرفة المروعة. دفع الشريحة في غرفة حتى كفيت يجعل اتصال ثابت مع الأقطاب غرفة.
    4. نبض مرة واحدة عن طريق الضغط على زر نبض حتى الصفافير آلة Electroporation لل.
    5. إضافة 1 مل مرق السوبر الأمثل مع مقيضة القمع (SOC) متوسطة تحتوي على 2٪ (ث / ت) تريبتون، 0.5٪ (ث / ت) خلاصة الخميرة، 10 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 10 ملي MgCl 2 و 20 ملي الجلوكوز لكفيت بسرعة ونقل الخليط إلى أنبوب اختبار. احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز.
    6. انتشار تتحول خلايا القولونية E. على استذابة مرق (LB) أجار لوحات تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (35 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول و 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين لاختيار pEVOL-AFRS وpBAD-HerFab-L177TAG، على التوالي). احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
  2. إعداد ثقافة
    1. تطعيم مستعمرة تحولت واحدة في 5 مل LB المضادات الحيوية المتوسط ​​تحتوي على. احتضان لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز.

3. التعبير وتنقية HerFab-L177AF

  1. التعبير عن HerFab-L177AF
    1. نقل الثقافة الأساسية (5 مل) إلى 200 مل LB المتوسطة التي تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) وAF (1 ملم)، تليها الحضانة عند 37 درجة مئوية مع الهز.
      ملاحظة: تم 100 ملم AF حل سهم (10 مل) عن طريق إذابة 206 ملغ AF في 100 ملي حمض الهيدروكلوريك (10 مل، الحجم النهائي) التي أعدت.
    2. إضافة 2 مل من 1.6 M الارابينوز (16ملي تركيز النهائي) عندما تصل إلى ثقافة المرحلة السجل (OD 550 = 0.8، OD = الكثافة البصرية). احتضان لمدة 12 ساعة عند 30 درجة مئوية مع الهز.
    3. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 11000 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وتجميد بيليه في -20 درجة مئوية.
  2. تحلل الخلية
    1. Resuspend والكريات خلية في 20 مل العازلة تحلل محيط بالجبلة تحتوي على 30 ملي تريس (8.0 درجة الحموضة)، 1 ملم EDTA، 20٪ سكروز، و 0.2 ملغ / مل الليزوزيم، واحتضان الخليط لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. الطرد المركزي الخلايا المحللة في 18000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. طاف لنقل أنبوب جديد وتجاهل بيليه.
  3. ني NTA تقارب اللوني
    1. إضافة ني NTA تعليق الراتنج إلى كل أنبوب الطرد المركزي (400 الراتنج ميكرولتر للثقافة 200 مل)، وتخلط بلطف عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. صب تعليق في عمود البولي بروبلين ويغسل الراتنج ثلاث مرات مع 5 بو غسل ملffer يحتوي على 50 ملي ناه 2 ص 4 (درجة الحموضة 8.0)، 20 ملي ايميدازول، و 300 ملي مول كلوريد الصوديوم.
    3. أزل الضد المستهدف مع 300 ميكرولتر شطف العازلة التي تحتوي على 50 ملي ناه 2 ص 4 (درجة الحموضة 8.0)، و 250 ملي ايميدازول، و 300 ملي مول كلوريد الصوديوم.
    4. تحديد تركيز البروتين متحولة من برادفورد البروتين فحص 29 أو عن طريق قياس الامتصاصية في 280 نانومتر. حساب معامل الانقراض (75866 م -1 سم -1) لHerFab-L177AF عند 280 نانومتر البروتين الانقراض معامل الحاسبة باستخدام معامل الانقراض (2471 م -1 سم -1) لAF.
      ملاحظة: تسلسل الأحماض الأمينية من HerFab يمكن العثور عليها في موقع NCBI (GI: 783282791 وGI: 783282792).

4. الإقتران من تنقية HerFab-L177AF مع آلكاين تحقيقات عن طريق-أزيد آلكاين Cycloaddition-روجت سلالة (SPAAC)

  1. إضافة 20 ميكرولتر من Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) في H 2 O (20081؛ M تركيز النهائي) إلى محلول 10 ميكرولتر من HerFab-L177AF (10 ميكرومتر تركيز النهائي) في العازلة الفوسفات التي تحتوي على 10 ملي نا 2 هبو 4 (7.0 درجة الحموضة) و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم.
    ملاحظة: كما بدائل، cyclooctyne difluorinated (DIFO) وbicyclo [6.1.0] nonyne (BCN) المشتقات متوفرة لنفس التطبيق أيضا.
  2. السماح للتفاعل cycloaddition-روجت سلالة المضي قدما لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية. إذا تم استخدام مسبار حساسة للضوء (على سبيل المثال، Cy5.5)، تغطية وعاء التفاعل مع رقائق الألومنيوم.
  3. تنقية HerFab المسمى وفقا لالخطوة 5.

5. تنقية HerFab إعتبر

  1. إضافة 500 ميكرولتر من عينة إلى عمود مرشح تدور الطرد المركزي.
  2. أجهزة الطرد المركزي لعمود الدوران في 14000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. تخلصي من خلال تدفق ونقل تنقية عينة من عمود الدوران إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  4. كبديل للخطوة 5.1- 5.3، نفذ purificaنشوئها قبل غسيل الكلى ضد المخزن نفسه.
  5. تخزين HerFab المسمى المنقى في 4 درجات مئوية.

6. SDS-PAGE تحليل HerFab إعتبر

  1. إضافة 5 ميكرولتر LDS عينة العازلة التي تحتوي على البروتينات 106 ملي تريس · حمض الهيدروكلوريك، و 141 ملي تريس قاعدة (الرقم الهيدروجيني 8.5)، 2٪ LDS، و 10٪ الجلسرين، 0.51 ملي EDTA، 0.22 ملي SERVA الأزرق G250، و0.175 ملي الفينول الأحمر إلى 13 ميكرولتر من النقاء وصفت HerFab (7.8 ميكرومتر أو 0.38 ملغ / مل) في وجود (+) أو غياب (-) من 2 ميكرولتر dithiothreitol (DTT و 100 ملي تركيز النهائي). احتضان الخليط في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  2. إرفاق 4-12٪ مكرر تريس هلام SDS-PAGE كاسيت إلى الخلية الكهربائي وإضافة العازلة على التوالي. تحميل عينات البروتين مترافق وقبل الملون الوزن الجزيئي علامة. أداء هلام الكهربائي لمدة 35 دقيقة في 200 V.
    ملاحظة: حافظ على خلية الكهربائي في الظلام خلال كامل الفترة لتقليل الصور التبييض من fluorophore.
  3. بعد الكهربائي، ونقلهلام إلى ماسح ضوئي هلام الفلورسنت، وبالبحث عن الانبعاثات مضان في الطول الموجي المناسب. لCy5.5، استخدم وضع Cy5 في برنامج الماسح الضوئي.
  4. وصمة عار الجل مع وصمة عار البروتين التجارية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه الدراسة، كان جزء الأجسام المضادة مترافق مع fluorophore من خلال دمج الأحماض الأمينية التي تحتوي على أزيد في جزء والرد جزء الأجسام المضادة متحولة مع cyclooctyne متوترة على وجه التحديد الموقع (الشكل 1). وقد تم اختيار HerFab باعتبارها جزء الضد المستهدف إلى التي تأسست AF كما من الأحماض الأمينية التي تحتوي على أزيد. لاختيار بقايا في HerFab لاستبدال مع AF، تم تحليل التركيب البلوري للأشعة السينية من HerFab. وتشمل 30 المتطلبات الهامة لبقايا مسافة كافية من موقع الضد ملزمة للحد من الانخفاض في تقارب ملزمة والوصول مذيب للكفاءة رد فعل اقتران. كان ليسين في موقف 177 مرشحا لائق لأن بقايا يتعرض أيضا إلى خارج الجسم المضاد وتقع بالقرب من واجهة اثنين من المجالات المناعي، والتي هي بعيدة من موقع الضد ملزم.

محتوى "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> في البداية، تم بناء البلازميد التعبير عن HerFab مع C-محطة له 6 -tag، وأدخلت إلى كودون العنبر في المركز 177 لAF التأسيس من قبل الموقع الطفرات -directed. وأعرب عن HerFab متحولة تحتوي AF بحضور 1 ملم AF عن طريق المشاركة في التعبير عن الحمض الريبي النووي النقال صور وأمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال زوج مخلقة تطورت. تم تنفيذ 27 ني NTA تنقية تقارب للبروتينات متحولة أعرب بحضور و أظهر غياب AF، وتحليل SDS-PAGE بعد أن الأجسام المضادة جزء كامل طول تم الحصول عليها إلا في وجود AF (الشكل 2). وبعد ذلك، تم تقييم جزء الأجسام المضادة متحولة تحتوي AF عن رد فعل الاقتران مع Cy5.5 -linked عزة-dibenzocyclooctyne مشتق. وكان رد فعل (Cy5.5-ADIBO) وجزء الأجسام المضادة وCy5.5-ADIBO في منطقة عازلة الفوسفات لمدة 6 ساعات، وجرى تحليل خليط التفاعل من قبل SDS-PAGE في وجود (+) و غياب (-) من DTT (الشكل 3A). 25 تم تنفيذ رد فعل مع البرية جزء نوع الأجسام المضادة أيضا وتحليلها كمجموعة تحكم. وأظهرت الصور مضان بوضوح تصريف جزء الأجسام المضادة متحولة مع Cy5.5-ADIBO، في حين لم يلاحظ أي اقتران في التفاعل مع نوع جزء البرية. أظهر رذاذ التأين تحليل الإلكترون الطيفي الشامل (ESI-MS) اقتران الكمي مع أي جزء اللامقترن كشفها (الشكل 3B). وبوجه عام، وأظهرت هذه النتائج أن HerFab متحولة تحتوي AF يمكن أن يكون مترافق بكفاءة وسهولة مع cyclooctynes ​​التي توترت بسبب SPAAC دون أي كاشف إضافي.

شكل 1
الشكل 1: توضيح تخطيطي من الأجسام المضادة وضع العلامات الخاصة بالموقع من قبل SPAAC.على بياض "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: التعبير عن HerFab متحولة تحتوي AF في موقف 177 (L177) في وجود الزوج الحمض الريبي النووي النقال / AARS تطورت. التعبير عن HerFab-L177AF في LB المتوسط ​​تحتوي على تطور الزوج الحمض الريبي النووي النقال / AFRS و1 ملم AF. وقد تم تحليل عينات تنقيتها من SDS-PAGE في وجود (+) أو غياب (-) من التلفزيون الرقمي الأرضي، وكانت ملطخة الجل مع وصمة عار البروتين التجارية. شخصية مقتبسة من كو، دبليو وآخرون. 27. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): الإقتران الردأيون من HerFab-L177AF مع Cy5.5-ADIBO. (أ) تحليل SDS-PAGE من رد فعل تصريف الافعال من النوع البري HerFab وHerFab-L177AF مع Cy5.5-ADIBO. وقد تم تحليل مخاليط رد فعل في وجود (+) وغياب (-) من التلفزيون الرقمي الأرضي، وكانت تصور العصابات البروتين وصمة عار البروتين التجارية (يسار) والتصوير مضان (يمين). (ب) تحليل ESI-MS من HerFab-L177AF (يسار) وHerFab-L177AF المسمى مع Cy5.5-ADIBO (يمين): الفرق الشامل المرتقب بين HerFab- L177AF والأجسام المضادة مترافق = 1190 دا، لاحظ الفرق الشامل = 1190 دا . شخصية مقتبسة من كو، دبليو وآخرون. 27. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إدراج الجيني للالأحماض الأمينية غير طبيعية في البروتينات ديها العديد من المزايا مقارنة مع الطرق الأخرى المستخدمة لتعديل البروتين. 1-3 احدة من المزايا الهامة هو تطبيق العام لأي نوع من البروتين. من حيث المبدأ، لا يوجد أي قيود في اختيار البروتين المستهدف والموقع المستهدف من البروتين. ومع ذلك، واستبدال بقايا أهمية هيكليا أو وظيفيا مع UAA قد يؤدي إلى تغيير بنية ووظيفة البروتين المستهدف. عموما، يتم اختيار المخلفات التي تتعرض لالمذيبات ولا تتفاعل مع المخلفات الأخرى لإدماج UAAs. لذلك، يتم استخدام المعلومات الهيكلية من التركيب البلوري عالية الدقة لاختيار المواقع المثلى لUAA التأسيس. 30 لأن إدماج UAAs من السهل من الناحية الفنية ويتطلب الطفرات بسيطة، مواقع متعددة ويمكن فحص بسهولة لتحديد بقايا المثلى لالوظيفة المطلوبة من البروتين المستهدف. </ P>

في هذا البروتوكول، وأدرج AF وراثيا إلى جزء الأجسام المضادة، وجزء متحولة يسمى الموقع على وجه التحديد مع fluorophore، وذلك باستخدام SPAAC. العائد اقتران هذا الأسلوب هو الكمي دون أي رد فعل غير مرغوب فيها، وهو ما يعتبر تحسنا ملحوظا خلال التقرير السابق. وقد تحقق ذلك من خلال 25 التحليل البنيوي الدقيق لاختيار موقع الأمثل وزيادة في وقت رد الفعل. ولذلك، فإن اختيار الموقع لUAA التأسيس هو أمر حاسم لاقتران سريع والكمي. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام نظم UAA التأسيس كفاءة (على سبيل المثال، pEvol-AFRS) هو أمر حاسم لمحصول البروتين وكفاءة التأسيس أيضا. 28

ويمكن أيضا UAAs الآخر إدراجها في البروتينات بواسطة طريقة التأسيس الجيني لتصريف بروتين أن تستخدم لتصريف الأجسام المضادة. 4-11 من حيث معدل التفاعل، المحفز النحاس رد فعل cycloaddition،وكذلك معكوس الإلكترون الطلب ديلز-ألدر تفاعل باستخدام tetrazines 8 و الألكينات توتر أو الألكاينات، 7 سيكون أفضل من SPAAC المستخدمة في هذه الدراسة. ومع ذلك، فإن رد فعل cycloaddition المحفز النحاس يتطلب النحاس (I) أيون وبروابط و 31 و الأحماض الأمينية للتفاعل ديلز-ألدر غالبا ما تكون صعبة صناعيا، وغير مستقرة بما فيه الكفاية لتصريف الكمي. ويمكن أيضا أن تستخدم-كيتون hydroxyamine التكثيف 4 لنفس الغرض. ومع ذلك، فإنه يتطلب الظروف الحمضية بشكل معتدل، ومعدل رد فعلها أبطأ من ذلك من SPAAC. وبالنظر إلى عوامل مثل إمكانية الوصول التجاري والصناعي من الأحماض الأمينية غير طبيعية، ومعدل التفاعل، والحيوية التعامد، توافق مع الحياة من ظروف التفاعل، وكفاءة دمج الأحماض الأمينية غير طبيعية، وطريقة استخدام SPAAC وراثيا للإعلام أن AF يكون من المفيد لتطوير المعدلة البروتينات العلاجية مثل ADCS، فضلا عن عامةالبروتين وضع العلامات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRS Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10B Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture Preparation
2.1 Electroporation
Micro pulser BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF) Bachem F-3075.0001 1 g
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
3.2 Cell Lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% SAMCHUN E0064 1 kg
Sucrose Sigma S9378 500 g
Lysozyme Siyaku 126-0671 1 g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1 kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1 mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500 μL capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12-well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
Typhoon 9210 variable mode imager Amersham Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
  2. Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
  3. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  4. Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
  5. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  6. Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
  7. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  8. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
  9. Lee, Y. -J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
  10. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
  11. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  12. Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
  13. Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
  14. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
  15. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
  16. Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
  17. Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
  18. Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
  19. Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
  20. Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
  21. Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
  22. Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
  23. Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
  24. Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
  25. Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  26. Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
  27. Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
  28. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
  31. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 118، الجسم المضاد، البروتين الإقتران، أزيد، آلكاين، مصطنعة الأحماض الأمينية، Cycloaddition
كفاءة والخاصة بالموقع الأجسام المضادة وصفها من قبل Cycloaddition-أزيد آلكاين-روجت سلالة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H.… More

Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H. S. Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition. J. Vis. Exp. (118), e54922, doi:10.3791/54922 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter