Abstract
Er zijn veel chemische instrumenten waarover scheikundige probes introduceren in proteïnen om hun structuur en functie te bestuderen. Een bruikbare methode is eiwitconjugatie door genetisch inbrengen van een niet-natuurlijk aminozuur dat een functionele groep bioorthogonal. Dit rapport beschrijft een gedetailleerd protocol voor site-specific antilichaam vervoeging. Het protocol bevat experimentele details voor de genetische incorporatie van een azide-aminozuur, en de vervoeging reactie by-stam bevorderde azide-alkyn cycloadditie (SPAAC). Deze stam bevorderde reactie verloopt door eenvoudig mengen van de reagerende moleculen bij fysiologische pH en temperatuur, en geen extra reagentia zoals koper (I) ionen en koper-chelerende liganden vereisen. Daarom zou deze methode bruikbaar voor algemene eiwitconjugatie en ontwikkeling van antilichamen geneesmiddelconjugaten (ADCs) zijn.
Introduction
Aangezien de genetische incorporatie van p -methoxyphenylalanine in Escherichia coli werd gemeld, zijn meer dan 1 100 onnatuurlijke aminozuren (UAAs) met succes opgenomen in diverse eiwitten. 1-3 Onder deze UAAs, de aminozuren met bioorthogonal functionele groepen zijn uitgebreid bestudeerd en vormen het grootste deel. De bioorthogonal functionele groepen die in de UAAs omvatten keton, 4 azide, alkyn 5, 6 cyclooctyne, tetrazine 7, 8 α, β-onverzadigd amide, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 en bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 Hoewel elke functionele groep heeft zijn voor- en nadelen, hebben de azide aminozuren het meest intensief gebruikt voor het eiwit conjugatie. p -Azidophenylalanine (AF), een van de azido-aminozuren, gemakkelijk beschikbaar, en de opneming efficiency is uitstekend. Mutante eiwitten die dit aminozuur worden omgezet met alkynen door koper gekatalyseerde cycloadditie of cyclooctynes door SPAAC. 12-20
Recent zijn biofarmaceutische het aantrekken van veel aandacht in de farmaceutische industrie. Het antilichaam-geneesmiddel conjugaat (ADC) is een klasse van therapeutische antilichamen die voordelig zijn vanwege hun vermogen voor gerichte therapie voor de behandeling van humane kankers en 21 andere ziekten. Meer dan 50 ADC's zijn momenteel in klinische studies, en het aantal neemt snel toe. Bij ontwikkeling van ADCs moeten vele factoren worden beschouwd om de efficiëntie te maximaliseren en de bijwerkingen te minimaliseren. Onder deze factoren een efficiënte en plaatsspecifieke conjugatie reactie op een covalente binding tussen een antilichaam en een geneesmiddel is kritiek. De gewenste efficiëntie en specificiteit van de conjugatiereactie kan worden bereikt door conjugatie met een bioorthogonal functionele groep pernatuurlijk aminozuur dat op specifieke wijze een antilichaam is opgenomen. 22-26 Hier melden wij een protocol bij plaatsspecifiek te nemen AF in een antilichaamfragment conjugaat en het mutante antilichaamfragment met een biochemische probe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmide Bouw
- Construct een expressieplasmide (pBAD-HerFab-L177TAG), die het doelwit antilichaam-gen (pBAD-HerFab-WT) met een Zijn 6-tag zou uiten, en vervang het codon voor leucine-177 met de amber codon (TAG) 27, met behulp van conventionele plaatsgerichte mutagenese techniek.
Zie tabel van Materialen. - Construct een andere uitdrukking plasmide (pEVOL-AFRS) die de genen voor de geëvolueerde tRNA Tyr en aminoacyl-tRNA synthetase (JAV) paar. Gebruik de speciaal ontworpen plasmidevector, pEVOL, voor een efficiënte opname van UAAs. De gedetailleerde informatie en plasmide klonen protocollen worden beschreven in het vorige verslag. 28
- Verkrijgen van hoge kwaliteit plasmide DNA door toepassing van commercieel verkrijgbare plasmide preparaat kits. De 260/280 verhouding van ~ 1,8 is optimaal voor het gezuiverde DNA. Desgewenst voeren 1% agarose gelelektroforese om de zuiverheid van het DNA te controleren.
- elektroporatie
- Voeg elk 1 pl DNA van pEVOL-AFRS 28 en pBAD-HerFab-L177TAG tot 20 pl Escherichia coli DH10β stam. Meng voorzichtig pipetteren. De plasmiden kunnen samen of in onafhankelijke reacties worden omgezet.
- Voor 0,1 cm cuvetten, zet de elektroporatie instellingen tot 25 uF en 2,5 kV.
- Plaats de cuvet in de schuif van de schokkende kamer. Duw de schuif in de kamer tot de cuvette maakt stevig contact met de kamer elektroden.
- Pulse eens door te drukken op de pulsknop totdat de elektroporatie apparaat piept.
- Voeg 1 mL super optimale bouillon met katabolische repressie (SOC) medium dat 2% (w / v) trypton, 0,5% (w / v) gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCl2 en 20 mM glucose de cuvette snel en het mengsel over te brengen naar een reageerbuis. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C onder schudden.
- Spread getransformeerde E. coli cellen op lysogenie bouillon (LB) agarplaten die geschikte antibiotica (35 ug / ml chlooramfenicol en 100 ug / ml ampicilline voor het selecteren pEVOL-AFRS en pBAD-HerFab-L177TAG respectievelijk). Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 12 uur.
- cultuur voorbereiding
- Inoculeer een enkele getransformeerde kolonie in 5 ml LB medium met antibiotica. Incubeer gedurende 12 uur bij 37 ° C onder schudden.
3. Expressie en zuivering van HerFab-L177AF
- Expressie van HerFab-L177AF
- Breng de primaire kweek (5 ml) in 200 ml LB-medium dat ampicilline (100 ug / ml) en AF (1 mM), gevolgd door incubatie bij 37 ° C onder schudden.
OPMERKING: 100 mM voorraadoplossing AF (10 ml) werd bereid door 206 mg AF in 100 mM zoutzuur (10 ml, eindvolume). - Voeg 2 ml van 1,6 M arabinose (16mM uiteindelijke concentratie) als de cultuur van de log-fase (OD 550 = 0,8, OD = optische dichtheid) bereikt. Incubeer gedurende 12 uur bij 30 ° C onder schudden.
- Oogst de cellen door centrifugatie bij 11.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en bevriezen van de pellet bij -20 ° C.
- Breng de primaire kweek (5 ml) in 200 ml LB-medium dat ampicilline (100 ug / ml) en AF (1 mM), gevolgd door incubatie bij 37 ° C onder schudden.
- cellysis
- Resuspendeer de celpellets in 20 ml periplasmatische lysisbuffer die 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% sucrose en 0,2 mg / ml lysozym, en incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Centrifugeer het cellysaat bij 18.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Breng de supernatant naar een nieuwe buis en gooi de pellet.
- Ni-NTA affiniteitchromatografie
- Add Ni-NTA hars suspensie aan elke centrifugebuis (400 ul hars een 200 ml kweek) en meng voorzichtig bij 4 ° C gedurende 1 uur.
- Giet de suspensie in een polypropyleen kolom en was de hars driemaal met 5 ml wassen buffer bevattende 50 mM NaH 2PO 4 (pH 8,0), 20 mM imidazool en 300 mM NaCl.
- Elueer het doelantilichaam met 300 ul elutiebuffer die 50 mM NaH 2PO 4 (pH 8,0), 250 mM imidazool en 300 mM NaCl.
- Bepaal de concentratie van het mutante eiwit door Bradford eiwit assay 29 of door meting van de absorptie bij 280 nm. Bereken de extinctiecoëfficiënt (75.866 M -1 cm -1) voor HerFab-L177AF bij 280 nm door eiwit extinctiecoëfficiënt rekenmachine met behulp van de extinctiecoëfficiënt (2471 M -1 cm -1) voor AF.
LET OP: De aminozuurvolgorde van HerFab kan worden gevonden in de NCBI website (GI: 783.282.791 en GI: 783.282.792).
4. Conjugatie van gezuiverde HerFab-L177AF met Acetyleenalkoholen Probes Met behulp-Strain bevorderd azide-alkyn Cycloadditiereacties (SPAAC)
- Voeg 20 ul van Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-Adibo) in H2O (20081; M eindconcentratie) aan een oplossing van 10 uL HerFab-L177AF (10 uM eindconcentratie) in fosfaatbuffer die 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7,0) en 100 mM NaCl.
LET OP: Als alternatieven, difluorinated cyclooctyne (DIFO) en bicyclo [6.1.0] nonyn (BCN) derivaten zijn ook beschikbaar voor dezelfde toepassing. - Laat de-stam bevorderde cycloadditiereactie men gedurende 6 uur bij 37 ° C. Als een lichtgevoelige sensor (bijv Cy5.5) wordt gebruikt, omvatten het reactievat met aluminiumfolie.
- Zuiver het gemerkte HerFab volgens stap 5.
5. Zuivering van gelabelde HerFab
- Voeg 500 ul van het monster op een centrifugaal filter spinkolom.
- Centrifugeer de spinkolom bij 14.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
- Discard doorstroom en overdracht gezuiverd monster van de spinkolom een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Als alternatief voor stap 5.1- 5.3 Voer Purificatie door dialyse tegen dezelfde buffer.
- Bewaar de gezuiverde gemerkte HerFab bij 4 ° C.
6. SDS-PAGE analyse van gelabelde HerFab
- Voeg 5 ul LDS eiwit monsterbuffer bevattende 106 mM Tris-HCl, 141 mM Tris base (pH 8,5), 2% LDS, 10% glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blue G250 en 0,175 mM fenolrood aan 13 pl gezuiverd gelabeld HerFab (7,8 uM of 0,38 mg / ml) in de aanwezigheid (+) of afwezigheid (-) van 2 pl dithiothreitol (DTT, 100 mM eindconcentratie). Incubeer het mengsel bij 95 ° C gedurende 10 minuten.
- Bevestig de 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel cassette aan de elektroforese cel en voeg loopbuffer. Laad het geconjugeerde eiwit monsters en de pre-lood gewicht marker moleculair. Voeren gelelektroforese 35 minuten bij 200 V.
Opmerking: Bewaar de elektroforese cel in het donker tijdens de gehele periode van de foto-bleken van de fluorofoor te minimaliseren. - Na elektroforese overdragende gel een gel fluorescerende scanner en scannen op fluorescentie-emissie bij de geschikte golflengte. Voor Cy5.5, gebruik maken van de Cy5-modus in de scanner software.
- Vlekken op de gel met een commerciële eiwit vlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie werd een antilichaamfragment eigen specifiek een fluorofoor geconjugeerd door het opnemen van een azide-aminozuur in het fragment en het reageren van het mutante antilichaamfragment met een gespannen cyclooctyne (figuur 1). HerFab werd geselecteerd als het doel antilichaamfragment waarin AF werd opgenomen als een azide-aminozuur. Aan het residu in HerFab de vervanging AF kiezen, het röntgen kristalstructuur van HerFab geanalyseerd. 30 Belangrijke vereisten voor het residu pakket voldoende afstand van de antilichaam bindingsplaats bij de daling van de bindingsaffiniteit en oplosmiddel toegankelijkheid voor efficiënte conjugatiereactie minimaliseren. Leucine op positie 177 een goede kandidaat omdat het residu goed blootgesteld buiten het antilichaam en gelegen nabij het grensvlak van twee immunoglobuline-domeinen, die ver van de antilichaam bindingsplaats.
content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Aanvankelijk expressieplasmide voor HerFab met een C-eindstandig His6-tag werd geconstrueerd, en een amber codon werd geïntroduceerd op positie 177 voor AF opneming door plaatsgerichte -directed mutagenese. de mutant HerFab met AF werd tot expressie gebracht in aanwezigheid van 1 mM AF door co-expressie brengen van het ontwikkelde tRNA Tyr en aminoacyl-tRNA synthetase pair. 27 Ni-NTA affiniteitszuivering werd voor het mutante eiwitten tot expressie gebracht in de aanwezigheid en afwezigheid van AF en de volgende SDS-PAGE analyse toonde aan dat het antilichaamfragment full-length alleen in de aanwezigheid van AF werd verkregen (figuur 2). Vervolgens wordt het mutante antilichaam fragment dat AF werd beoordeeld op conjugatiereactie met Cy5.5 -gebonden aza-dibenzocyclooctyne derivaat (Cy5.5-Adibo). het antilichaam fragment en Cy5.5-Adibo gereageerd in een fosfaatbuffer gedurende 6 h en het reactiemengsel werd geanalyseerd door SDS-PAGE met (+) en afwezigheid (-) Van DTT (figuur 3a). 25 De reactie met een wildtype antilichaamfragment werd uitgevoerd en geanalyseerd als controle. De fluorescentiebeelden toonde duidelijk conjugatie van de mutant antilichaamfragment met Cy5.5-Adibo, terwijl er geen conjugatie in de reactie met het wildtype-fragment werd waargenomen. Electron nevel ionisatie analyse massaspectrometrie (ESI-MS) toonde kwantitatieve conjugatie zonder waarneembare geconjugeerde fragment (figuur 3b). Kortom, deze resultaten toonden aan dat de mutant HerFab met AF kan efficiënt en gemakkelijk geconjugeerd met gespannen cyclooctynes door SPAAC zonder extra reagens.
Figuur 1: Schematische weergave van de site-specifiek antilichaam labeling door SPAAC.blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Expressie van mutant HerFab met AF op positie 177 (L177) in aanwezigheid van de geëvolueerde tRNA / AARS pair. Expressie van HerFab-L177AF in LB medium dat de geëvolueerde tRNA / AFRS pair en 1 mM AF. Gezuiverde monsters werden geanalyseerd door SDS-PAGE in aanwezigheid (+) of afwezigheid (-) van DTT, en de gel werd gekleurd met een commerciële eiwit vlek. Figuur aangepast van Ko, W. et al. 27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vervoeging reagerenion van HerFab-L177AF met Cy5.5-Adibo. (A) SDS-PAGE analyse van de conjugatiereactie van wild type HerFab en HerFab-L177AF met Cy5.5-Adibo. De reactiemengsels werden geanalyseerd met (+) en afwezigheid (-) van DTT en eiwitbanden werden zichtbaar gemaakt met een commercieel eiwitkleuring (links) en fluorescentiebeeldvorming (rechts). (B) ESI-MS analyses van HerFab-L177AF (links) en HerFab-L177AF gelabeld met Cy5.5-Adibo (rechts): verwachte massa verschil tussen HerFab- L177AF en het geconjugeerde antilichaam = 1.190 Da, waargenomen verschil in massa = 1.190 Da . Figuur aangepast van Ko, W. et al. 27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De genetische incorporatie van niet-natuurlijke aminozuren in eiwitten heeft verscheidene voordelen boven andere werkwijzen voor eiwitmodificatie. 1-3 Eén van de belangrijkste voordelen is de algemene toepasbaarheid op elke vorm van eiwit. In principe is er geen beperking in het selecteren van een doeleiwit en een doelwitplaats van het eiwit. Echter kan vervanging van een structureel of functioneel belangrijke residuen met een UAA leiden tot veranderen van de structuur en functie van het doeleiwit. Algemeen, resten die worden blootgesteld aan oplosmiddel en geen interactie met andere residuen worden gekozen voor het inbouwen van UAAs. Daarom wordt structurele informatie uit een hoge-resolutie kristalstructuur gebruikt om optimale plaatsen voor UAA opname kiezen. 30 Door het opnemen van UAAs technisch eenvoudig en vereist een eenvoudige mutagenese kunnen meerdere plaatsen gemakkelijk worden gescreend op optimale residu selecteren voor een gewenste functie van een doeleiwit. </ P>
In dit protocol wordt AF genetisch opgenomen in een antilichaamfragment, en de mutante fragment plaatsspecifiek gelabeld met een fluorofoor, via SPAAC. Het conjugatie opbrengst van deze werkwijze is kwantitatief zonder ongewenste reactie, wat een belangrijke verbetering ten opzichte van het verslag. 25 Dit werd bereikt door zorgvuldige structurele analyse voor het selecteren van een optimale locatie en een toename van de reactietijd. Daarom is de keuze van het gebied voor opname UAA is cruciaal voor een snelle en kwantitatieve conjugatie. Bovendien, het gebruik van efficiënte UAA incorporatie systemen (bijvoorbeeld pEvol-AFRS) ook problemen gelden eiwitopbrengst en opnamedoelmatigheid. 28
Andere UAAs in eiwitten opgenomen door genetische incorporatie werkwijze voor eiwitconjugatie kan ook worden gebruikt voor het antilichaam conjugatie. 11/04 In termen van reactiesnelheid, koper-gekatalyseerde cycloadditiereactie,alsmede inverse elektronen-demand Diels-Alder-reactie met behulp tetrazine 8 en gespannen alkenen of alkynen, zullen 7 beter dan SPAAC gebruikt in deze studie. De koper gekatalyseerde cycloadditiereactie vereist koper (I) ionen en liganden, 31 en de aminozuren van de Diels-Alder-reactie vaak uitdagend synthetisch en niet stabiel genoeg voor kwantitatieve conjugatie. Keton-hydroxyamine condensatie 4 kan ook worden gebruikt voor hetzelfde doel. Het vereist echter matig zure omstandigheden en de reactiesnelheid langzamer dan de SPAAC. Gezien de factoren zoals commerciële en synthetische toegankelijkheid van onnatuurlijke aminozuren, de reactiesnelheid, bio-orthogonaliteit, biocompatibiliteit van reactieomstandigheden en opnamedoelmatigheid onnatuurlijke aminozuren, de wijze van gebruik SPAAC en genetisch bijgemengde AF zou bevorderen het gewijzigd worden therapeutische eiwitten zoals ADCs, alsmede voor algemeneeiwitmarkerend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture Preparation | |||
| 2.1 Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Cell Lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500 μL capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences | ||
References
- Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
- Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
- Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
- Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
- Lee, Y. -J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
- Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
- Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
- Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
- Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
- Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
- Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
- Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
- Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
- Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
- Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
- Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
- Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
- Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
- Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
- Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
- Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
- Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
