Abstract
Atualmente muitas ferramentas químicas disponíveis para introduzir sondas químicas em proteínas para estudar sua estrutura e função. Um método útil é a conjugação de proteínas geneticamente pela introdução de um aminoácido não natural contendo um grupo funcional bioorthogonal. Este relatório descreve um protocolo detalhado para site-specific a conjugação de anticorpos. O protocolo inclui detalhes experimentais para a incorporação genética de um aminoácido contendo azida, e a reacção de conjugação por cicloadição azida-alcino promoveu-deformação (SPAAC). Esta reacção promovida por deformação prossegue por mistura simples das moléculas de reacção a pH e temperatura fisiológicos, e não requer reagentes adicionais, tais como cobre (I) e os iões ligandos quelantes de cobre. Por conseguinte, este método seria útil para a conjugação de proteínas em geral e ao desenvolvimento de conjugados de anticorpo e fármaco (ADCs).
Introduction
Uma vez que a incorporação genética de p -methoxyphenylalanine em Escherichia coli foi relatado, 1 mais de 100 aminoácidos não naturais (UAAS) foram incorporados com sucesso em várias proteínas. 1-3 Entre estes UAAS, os aminoácidos contêm grupos funcionais bioorthogonal têm sido extensivamente estudados e representam a maior proporção. Os grupos funcionais bioorthogonal utilizados nos UAAS incluem cetona, 4 azida, alcino 5, 6 cyclooctyne, tetrazina 7, 8 α, amida β-insaturado, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 e biciclo [6.1.0] -nonyne. 11 Embora cada grupo funcional tem as suas vantagens e desvantagens, os aminoácidos contendo azida foram mais extensivamente utilizada para a conjugação de proteínas. p -Azidophenylalanine (AF), um dos aminoácidos contendo azido, está prontamente disponível, e a sua incorporação efficiency é excelente. pode-se fazer reagir as proteínas mutantes contendo este aminoácido com alcinos por cicloadição catalisada por cobre ou com cyclooctynes por SPAAC. 12-20
Recentemente, biofármacos têm atraído muita atenção na indústria farmacêutica. O conjugado anticorpo-fármaco (ADC) é uma classe de anticorpos terapêuticos que são vantajosos devido à sua capacidade para terapia-alvo para o tratamento de cancros humanos e 21 outras doenças. Mais de 50 ADCs estão actualmente em ensaios clínicos, eo número está aumentando rapidamente. No desenvolvimento dos ADCs, muitos factores devem ser considerados para maximizar a eficácia e minimizar os efeitos colaterais. Entre estes factores, a reacção de conjugação eficiente e específica do local para formar uma ligação covalente entre um anticorpo e um fármaco é crítica. A eficiência e especificidade desejada na reacção de conjugação pode ser conseguida por conjugação com um grupo funcional numa bioorthogonalaminoácido não natural que é especificamente incorporada num anticorpo. 22-26 Aqui, nós relatamos um protocolo para o site especificamente incorporar AF em um fragmento de anticorpo e o conjugado do fragmento de anticorpo mutante com uma sonda bioquímica.
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Protocol
1. O plasmídeo Construção
- Construir um plasmídeo de expressão (pBAD-HerFab-L177TAG) que expressam o gene do anticorpo alvo (pBAD-HerFab-WT) com um Sua 6-tag, e substituir o codão para a leucina-177 com o códon de âmbar (TAG) 27, utilizando técnica de mutagénese dirigida ao local convencional.
Veja a Tabela de Materiais. - Construir outro plasmídeo de expressão (pEVOL-AFRS) contendo os genes para o tRNA Tyr evoluiu e aminoacil-tRNA sintetase par (RAA). Use o vector plasmídeo especialmente concebido, pEVOL, para incorporação eficiente do UAAS. Os protocolos de informação plasmídeo e clonagem detalhadas são descritas no relatório anterior. 28
- Obter DNA de plasmídeo de alta qualidade, utilizando kits de preparação de plasmídeos disponíveis comercialmente. A proporção de ~ 1,8 260/280 é óptima para o ADN purificado. Se necessário, realizar uma% de electroforese em gel de agarose para verificar a pureza do ADN.
- eletroporação
- Adicione cada DNA 1 mL de pEVOL-AFRS 28 e pBAD-HerFab-L177TAG a 20 mL Escherichia coli DH10β tensão. Misturar suavemente, usando uma pipeta. Os plasmídeos podem ser transformados em conjunto ou em reacções independentes.
- Para 0,1 cm cuvetes, defina as configurações de eletroporação a 25 mF e 2,5 kV.
- Coloque a célula no slide da câmara chocante. Empurrar o slide para a câmara até a tina fique em contato firme com os eletrodos de câmara.
- Pulsar uma vez, premindo o botão de pulso até que os bips máquina eletroporação.
- Adicionar 1 mL de super caldo óptima com catabólica repressão (SOC) meio contendo 2% (w / v) de triptona, 0,5% (w / v) de extracto de levedura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, e glucose a 20 mM rapidamente à cuvete e transferir a mistura para um tubo de ensaio. Incubam-se as células durante 1 h a 37 ° C com agitação.
- Células de E. coli transformada E. espalhadas sobre Lisogenia Broth (LB) agar contendo os antibióticos apropriados (35 ug / ml de cloranfenicol e 100 ug / ml de ampicilina para selecção pEVOL-RSFA e pBAD-HerFab-L177TAG, respectivamente). Incubar as placas a 37 ° C durante 12 h.
- preparação de cultura
- Inocular uma única colónia transformada em 5 mL de meio LB contendo antibióticos. Incubar durante 12 h a 37 ° C com agitação.
3. Expressão e Purificação de HerFab-L177AF
- Expressão de HerFab-L177AF
- Transferir a cultura primária (5 mL) em 200 mL de meio LB contendo ampicilina (100 ug / mL) e AF (1 mM), seguido de incubação a 37 ° C com agitação.
NOTA: solução estoque AF 100 mM (10 ml) foi preparada por dissolução de 206 mg de FA em 100 mM de ácido clorídrico (10 ml, volume final). - Adicionar 2 mL de 1,6 M arabinose (16concentração final mM) quando a cultura atingir a fase log-(OD550 = 0,8, DO = densidade óptica). Incubar durante 12 h a 30 ° C com agitação.
- Células colheita por centrifugação a 11000 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e congelar o sedimento a -20 ° C.
- Transferir a cultura primária (5 mL) em 200 mL de meio LB contendo ampicilina (100 ug / mL) e AF (1 mM), seguido de incubação a 37 ° C com agitação.
- A lise celular
- Ressuspender os sedimentos celulares em 20 ml de tampão de lise periplasmática contendo 30 mM Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, sacarose a 20%, e 0,2 mg / ml de lisozima, e incubar a mistura durante 1 h a 37 ° C.
- Centrifuga-se o lisado celular a 18000 xg, a 4 ° C durante 15 min. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco e descartar o sedimento.
- Cromatografia de afinidade de Ni-NTA
- Adicionar a suspensão de resina de Ni-NTA para cada tubo de centrifugação (400 mL de resina de uma cultura de 200 mL), e agitar suavemente a 4 ° C durante 1 h.
- Verter a suspensão em uma coluna de polipropileno e lavar a resina três vezes com 5 mL de lavagem buffer contendo 50 mM de NaH 2 PO 4 (pH 8,0), imidazole 20 mM, e NaCl 300 mM.
- Elui-se o anticorpo alvo com tampão de eluição de 300 uL contendo 50 mM de NaH 2 PO 4 (pH 8,0), imidazole 250 mM e NaCl 300 mM.
- Determinar a concentração de proteína mutante por Bradford ensaio de proteína de 29 ou através da medição da absorvância a 280 nm. Calcular o coeficiente de extinção (75866 M-1cm-1) para HerFab-L177AF a 280 nm pelo coeficiente de extinção da proteína calculadora utilizando o coeficiente de extinção (2471 M-1cm-1) para AF.
NOTA: A sequência de aminoácidos de HerFab pode ser encontrada no site do NCBI (GI: 783282791 e GI: 783282792).
4. Conjugação de Purificada HerFab-L177AF com Alcino Sondas Usando cicloadição Azide-alcino promoveu-Strain (SPAAC)
- Adicionar 20 ul de Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) em H2O (20081; M de concentração final) a uma solução de 10 mL de HerFab-L177AF (10 uM de concentração final) em tampão de fosfato contendo 10 mM de Na 2 HPO 4 (pH 7,0) e NaCl 100 mM.
NOTA: Como alternativas, cyclooctyne difluorinated (DIFO) e biciclo [6.1.0] nonino derivados (BCN) também estão disponíveis para a mesma aplicação. - Permitir que a reacção de cicloadição promoveu-estirpe prosseguir durante 6 h a 37 ° C. Se é usada uma sonda sensível à luz (por exemplo, Cy5.5), cobrir o vaso de reacção com uma folha de alumínio.
- Purificar o HerFab rotuladas de acordo com a etapa 5.
5. Purificação de HerFab Labeled
- Adicionar 500 ul de amostra a uma coluna de centrifugação filtro centrífugo.
- Centrifugar a coluna de centrifugação a 14.000 xg, a 4 ° C durante 15 min.
- Rejeitar de fluxo e de transferência de amostra purificada a partir da coluna de spin para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Como uma alternativa para a etapa 5.1- 5.3, executar Purificação por diálise contra o mesmo tampão.
- Armazenar o HerFab purificado marcado a 4 ° C.
6. SDS-PAGE Análise de HerFab Rotulado
- Adicionar tampão de amostra de proteína de 5 uL de LDS contendo 106 mM Tris-HCl, Tris base 141 mM (pH 8,5), 2% de LDS, 10% de glicerol, EDTA 0,51 mM, 0,22 mM SERVA azul G250, e fenol 0,175 mM de vermelho a 13 uL de purificado marcado HerFab (7,8 ^ M ou 0,38 mg / mL) na presença (+) ou ausência (-) de 2 ul de ditiotreitol (DTT, 100 mM de concentração final). Incubar a mistura a 95 ° C durante 10 min.
- Anexar o Bis-Tris cassete de gel de SDS-PAGE a 4-12% para a célula de electroforese e adicionar tampão de corrida. Coloque as amostras de proteína conjugados e o marcador de peso molecular pré-manchado. Efectuar a electroforese de gel durante 35 min a 200 V.
Nota: manter a célula de electroforese no escuro durante todo o período para minimizar o foto-branqueamento do fluoróforo. - Após a electroforese, a transferênciao gel a um scanner de gel fluorescente, e verificar se há emissão de fluorescência no comprimento de onda apropriado. Para Cy5.5, utilize o modo Cy5 no software do scanner.
- Manchar o gel com uma mancha de proteína comercial.
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Representative Results
Neste estudo, um fragmento de anticorpo foi local especificamente conjugado com um fluoróforo por incorporação de um aminoácido contendo azida no fragmento e fazendo reagir o fragmento de anticorpo mutante com um cyclooctyne tensas (Figura 1). HerFab foi seleccionado como o fragmento de anticorpo-alvo em que AF foi incorporado como um aminoácido contendo azida. Para escolher o resíduo em HerFab para a substituição com FA, foi analisada a estrutura de cristal de raios-X de HerFab. 30 requisitos importantes para o resíduo incluem distância suficiente a partir do local de ligação do anticorpo para minimizar a redução da sua afinidade de ligação e acessibilidade ao solvente para a reacção de conjugação eficiente. Leucina na posição 177 era um candidato razoável, pois o resíduo é bem exposta ao exterior do anticorpo e localizado perto da interface de dois domínios de imunoglobulina, que está distante do local de ligação do anticorpo.
conteúdo "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Inicialmente, o plasmídeo de expressão para HerFab com um C-terminal Sua 6-tag foi construído, e um codão âmbar foi introduzida na posição 177 para incorporação AF pelo local -directed mutagénese. o HerFab mutante contendo AF foi expressa na presença de AF 1 mM, por co-expressam o ARNt Tyr e aminoacil-ARNt-sintetase par evoluiu. 27 Ni-NTA de purificação por afinidade foi realizada para as proteínas mutantes expressos na presença e ausência de FA, e a seguinte análise de SDS-PAGE mostrou que o fragmento de anticorpo de comprimento completo foi obtido apenas na presença de AF (Figura 2). em seguida, o fragmento de anticorpo mutante contendo AF foi avaliada por uma reacção de conjugação com Cy5.5 -Conectado derivado aza-dibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO). o fragmento de anticorpo e Cy5.5-ADIBO foram feitos reagir em um tampão de fosfato durante 6 horas, e a mistura de reacção foi analisada por SDS-PAGE na presença (+) e ausência (-) De DTT (Figura 3a). 25 A reacção com um fragmento de anticorpo de tipo selvagem também foi realizada e analisada como controlo. As imagens de fluorescência mostraram claramente a conjugação do fragmento de anticorpo mutante com Cy5.5-ADIBO, enquanto não se observou conjugação na reacção com o fragmento de tipo selvagem. A ionização por spray de análise por espectrometria de massa (ESI-MS) mostrou quantitativa conjugação com nenhum fragmento não conjugada detectável (Figura 3b). No geral, estes resultados mostraram que o mutante contendo HerFab AF pode ser eficiente e convenientemente conjugado com cyclooctynes esticado por SPAAC sem qualquer reagente adicional.
Figura 1: Ilustração esquemática da rotulagem anticorpo específico do site por SPAAC.blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Expressão de HerFab mutante contendo AF na posição 177 (L177), na presença do par ARNt / Aars evoluído. Expressão de HerFab-L177AF em meio LB contendo o par ARNt / RSFA evoluiu e AF 1 mM. As amostras purificadas foram analisadas por SDS-PAGE na presença (+) ou ausência (-) de DTT, e o gel foi corado com um corante de proteínas comercial. Figura adaptada de Ko, W. et ai. 27. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Conjugação reagemion de HerFab-L177AF com Cy5.5-ADIBO. (A) a análise de SDS-PAGE da reacção de conjugação de tipo selvagem e HerFab HerFab-L177AF com Cy5.5-ADIBO. As misturas reaccionais foram analisadas na presença (+) como na ausência (-) de DTT, e as bandas de proteína foram visualizadas por uma mancha de proteínas comercial (esquerda) e imagens de fluorescência (à direita). (B) ESI-MS análise de HerFab-L177AF (esquerda) e HerFab-L177AF marcado com Cy5.5-ADIBO (direita): diferença de massa esperada entre HerFab- L177AF eo anticorpo conjugado = 1.190 Da, observada diferença de massa = 1.190 Da . Figura adaptada de Ko, W. et ai. 27. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A incorporação genética de aminoácidos não naturais em proteínas tem várias vantagens sobre outros métodos utilizados para a modificação de proteínas. 3/1 Uma das vantagens importantes é a sua aplicabilidade em geral a qualquer tipo de proteína. Em princípio, não há limitação na escolha de uma proteína alvo e um local alvo da proteína. No entanto, a substituição de um resíduo estruturalmente ou funcionalmente importante com um UAA pode resultar na alteração da estrutura e função da proteína alvo. Geralmente, os resíduos que estão expostos a solvente e não interagem com outros resíduos são escolhidos para incorporação de UAAS. Portanto, a informação estrutural a partir de uma estrutura cristalina de alta resolução é usado, a fim de escolher os locais óptimos para SAU incorporação. 30 Uma vez que a incorporação de UAAS é tecnicamente fácil e requer um mutagénese simples, múltiplos locais podem ser facilmente rastreadas para seleccionar um resíduo óptima para uma função pretendida de uma proteína alvo. </ P>
Neste protocolo, AF é geneticamente incorporado em um fragmento de anticorpo, e o fragmento mutante é local-especificamente marcado com um fluoróforo, usando SPAAC. O rendimento conjugação deste método é quantitativa, sem qualquer reacção indesejada, que é uma melhoria importante em relação ao relatório anterior. 25 Isto foi alcançado através de análise estrutural cuidado na selecção de um local óptimo e um aumento no tempo de reacção. Portanto, a escolha do local para incorporação SAU é crítica para a conjugação rápida e quantitativa. Além disso, a utilização de sistemas eficientes de incorporação UAA (por exemplo, pEvol-RSFA) também é crítico para a produção de proteína e eficiência de incorporação. 28
Outros UAAS incorporados nas proteínas pelo método de incorporação genética para a conjugação de proteínas pode também ser utilizado para a conjugação anticorpo. 11/04 Em termos de taxa de reacção, a reacção de cicloadição catalisada por cobre,, bem como a demanda inversa de electrões da reacção de Diels-Alder utilizando tetrazinas 8 e alcenos ou alcinos tensas, 7 vai ser melhor do que o SPAAC utilizado neste estudo. No entanto, a reacção de cicloadição catalisada por cobre requer ião de cobre (I) e ligandos, e 31 dos aminoácidos para a reacção de Diels-Alder são muitas vezes um desafio sinteticamente, e não são suficientemente estáveis para a conjugação quantitativa. A cetona-hidroxiamina condensação 4 também pode ser utilizado para o mesmo fim. No entanto, isso requer condições moderadamente ácidas, e a sua taxa de reacção é mais lenta do que a do SPAAC. Tendo em conta os factores, tais como a acessibilidade comercial e sintéticos de aminoácidos não naturais, a velocidade da reacção, a bio-ortogonalidade, biocompatibilidade das condições de reacção, e eficiência de incorporação de aminoácidos não naturais, o método de utilização de SPAAC e geneticamente incorporou AF seria útil para o desenvolvimento modificado proteínas terapêuticas, tais como os ADCs, bem como para geralde marcação de proteínas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture Preparation | |||
| 2.1 Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Cell Lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500 μL capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences | ||
References
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