Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).
Det finns för närvarande många kemiska verktyg för att införa kemiska sonder till proteiner för att studera deras struktur och funktion. En användbar metod är proteinkonjugering genom genetiskt introducera en onaturlig aminosyra innehållande en bioorthogonal funktionell grupp. Denna rapport beskriver ett detaljerat protokoll för sätesspecifik antikropp konjugering. Protokollet inkluderar experimentella detaljer för den genetiska inkorporering av en azid-innehållande aminosyra och konjugeringsreaktionen av stam-främjade azid-alkyn cykloaddition (SPAAC). Denna stam-främjade Reaktionen fortgår genom enkel blandning av de reagerande molekyler vid fysiologiskt pH och temperatur, och som inte kräver ytterligare reagens, såsom koppar (I) joner och koppar-kelatbildande ligander. Därför skulle denna metod vara användbar för allmän proteinkonjugering och utveckling av antikropps läkemedelskonjugat (ADC).
Eftersom den genetiska inkorporering av p -methoxyphenylalanine i Escherichia coli rapporterades, 1 mer än 100 onaturliga aminosyror (UAAs) har framgångsrikt införlivas i olika proteiner. 1-3 Bland dessa UAAs, aminosyrorna innehåller bioorthogonal funktionella grupper har studerats ingående och utgör den största andelen. De bioorthogonal funktionella grupper som används i de UAAs inkluderar keton, 4 azid, 5 alkyn, 6 cyclooctyne, 7 tetrazin, 8 α, β-omättad amid, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 och bicyklo [6.1.0] -nonyne. 11 Även om varje funktionell grupp har sina fördelar och nackdelar, har aziden innehållande aminosyror varit mest använda för proteinkonjugering. p -Azidophenylalanine (AF), en av de azido-innehållande aminosyror, är lätt tillgänglig, och dess inkorporering efficiency är utmärkt. Mutantproteiner som innehåller denna aminosyra kan reageras med alkyner av koppar-katalyserad cykloaddition eller med cyclooctynes från SPAAC. 12-20
Nyligen har proteinläkemedel lockat stor uppmärksamhet inom läkemedelsindustrin. Den Antikropp-läkemedelskonjugat (ADC) är en klass av terapeutiska antikroppar som är fördelaktiga på grund av deras förmåga för riktad terapi för behandlingen av humana cancerformer 21 och andra sjukdomar. Mer än 50 ADC finns för närvarande i kliniska prövningar, och antalet ökar stadigt. I utvecklingen av ADC: er, många faktorer måste beaktas för att maximera effektiviteten och minimera biverkningar. Bland dessa faktorer, till ett effektivt och sätesspecifik konjugeringsreaktionen bilda en kovalent bindning mellan en antikropp och ett läkemedel är kritisk. Den önskade effektiviteten och specificiteten i konjugeringsreaktionen kan uppnås genom konjugering med en bioorthogonal funktionell grupp i enonaturlig aminosyra, som specifikt införlivas i en antikropp. 22-26 Här rapporterar vi ett protokoll till platsspecifikt införliva AF i ett antikroppsfragment och konjugera den muterade antikroppsfragment med en biokemisk sond.
Den genetiska inkorporering av onaturliga aminosyror i proteiner har flera fördelar jämfört med andra metoder som används för proteinmodifiering. 1-3 En av de viktigaste fördelarna är dess allmänna tillämpbarhet till någon form av protein. I princip finns det ingen begränsning i valet av ett målprotein och ett målställe av proteinet. Emellertid kan ersättning av en strukturellt eller funktionellt viktiga rester med en UAA resultera i att förändra strukturen och funktionen av målproteinet. Ge…
The authors have nothing to disclose.
1. plasmid Construction | |||
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500g |
Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1g |
LB Broth | BD Difco | 244620 | 500g |
2. Culture preparation | |||
2.1) Electroporation | |||
Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1cm electrode gap, pkg. of 50 |
Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25g |
Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25g |
Agar | SAMCHUN | 214230 | 500g |
SOC medium | Sigma | S1797 | 100ML |
3. Expression and purification of HerFab-L177AF | |||
3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1g |
L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100g |
Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500ml |
3.2 Cell lysis | |||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500g |
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1kg |
Sucrose | Sigma | S9378 | 500g |
Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1g |
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25ml |
Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1ml capacity |
Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1kg |
Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1kg |
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
5. Purification of Labeled HerFab | |||
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10g |
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10ml |
MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500ml |
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12well |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25g |
Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences |