Summary

Chondrogène Différenciation Induction des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge

Published: February 24, 2017
doi:

Summary

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Abstract

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Introduction

Des défauts dans le cartilage articulaire ne guérissent pas naturellement. Par conséquent, transplantation de cellules souches a été proposée comme une approche prometteuse pour la réparation d'altération du cartilage. Cependant, cette méthode nécessite à la fois l'acquisition d'un nombre suffisant de cellules souches et l'induction de ces cellules à subir une différenciation chondrogénique. La moelle osseuse (BM) a été largement utilisé en tant que source de cellules souches, mais l'isolement des cellules de BM présente deux inconvénients majeurs: le rendement de propagation et insuffisante. En raison de sa facilité d'acquisition, le tissu adipeux est une source de cellules souches préférables. Des études antérieures ont démontré la faisabilité d'isoler des cellules souches du tissu adipeux et d' induire la différenciation chondrocytaire dans ces cellules en utilisant des cytokines, telles que le TGF-β1 1, 2. Ces méthodes sont efficaces mais coûteux.

Comme une alternative moins coûteuse aux cytokines, une contrainte mécanique peut être utilisé pourinduire la différenciation chondrogénique. Chargement mécanique joue un rôle essentiel dans le maintien de la santé du cartilage articulaire 3, et elle peut induire des phénotypes chondrogéniques dans différentes cellules. Par exemple, la pression hydrostatique induit des phénotypes chondrogéniques dans les cellules progénitrices dérivées de la synoviale par la voie de la MAP kinase / JNK 4, et une compression mécanique induit une chondrogenèse dans des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) , par la régulation positive des gènes 5 chondrocytes. En outre, la contrainte de cisaillement contribue à l'expression liée chondrogenèse matrice extracellulaire (ECM) dans les cellules souches mésenchymateuses humaines 6. Gravité centrifuge (CG), une contrainte mécanique facilement appliquée et contrôlée générée par centrifugation, peut induire l' expression différentielle des gènes dans les cellules 7. Par exemple, dans des cellules de carcinome de l' épithélium du poumon, l'expression de l' interleukine (IL) -1 ter est régulée positivement par centrifugation 8. Tinsi, en tant que contrainte mécanique expérimentalement inductible, CG peut être utilisé pour induire l'expression du gène chondrocytaire dans les cellules souches. Cependant, il reste difficile de savoir si CG peut induire la différenciation chondrogénique des cellules souches.

Dans cette étude, nous avons constaté que CG a induit la surexpression de SOX9, un régulateur de maître de chondrogenèse en ASCs humains, ce qui entraîne la surexpression des gènes chondrocytes. De plus, nous avons comparé les effets de la CG sur la chondrogenèse avec celles du TGF-β1, le facteur de croissance les plus couramment utilisés pour induire une chondrogenèse in vitro dans des cellules souches.

Protocol

Ce protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC16EAME0162) et réalisée selon les directives du NIH. Tous les tissus ont été obtenus avec le consentement éclairé par écrit. Chargement 1. centrifuge Gravité et Pellet Culture La culture cellulaire et la récolte ASCs de culture (P2-P3; voir la liste des matériaux) dans Modifié Moyennement bas de glucose de Eagle Dulbecco (DMEM-LG) …

Representative Results

gravité centrifuge induit une surexpression de marqueurs de différenciation chondrocytaire dans les cellules souches dérivées de tissu adipeux. Pour déterminer le degré de la force de gravité centrifuge qui est apte à induire la différenciation chondrogénique, ASCs ont été stimulées avec divers degrés de CG (0, 300, 600, 1200 et 2400 x g) pendant 15 min. Après stimulation, les ASCs ont été re-ensemencées sur …

Discussion

L'état des cellules de stemness est très important pour la surexpression CG-induite de SOX9. Dans notre étude, l'expression de SOX9 pourrait être induite par CG en ASCs début de passage (2-3), mais pas dans ASCs plus tard, passage. Il a été rapporté que, pendant la culture, ASCs contiennent des cellules CD34 + jusqu'à 3 passages 16. ASCs ont tendance à perdre l'expression de CD34 que les cellules sont repiquées, ce qui entraîne une faible réponse au CG.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C2116) and by Research Fund of Seoul St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea.

Materials

Plasticware
100mm Dish TPP 93100
60mm Dish TPP 93060
50 mL Cornical Tube SPL 50050
15 mL Cornical Tube SPL 50015
10 mL Disposable Pipette Falcon 7551
5 mL Disposable Pipette Falcon 7543
Name Company Catalog Number Comments
ASC Culture Media Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
DMEM Low glucose Life Technologies 11885-084 growth base media
Penicilin Streptomycin Sigma Aldrich P4333 1%
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044 10%
PBS/1 mM EDTA Life Technologies 12604-039
Name Company Catalog Number Comments
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose Life Technologies 11995 chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140-050
Dexamethasone Sigma Aldrich D2915 100nM
Penicilin Streptomycin Life Technologies P4333 1%
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044 1%
Ascorbate-2-phosphate Sigma Aldrich A8960 50ug/ml
L-proline Sigma Aldrich P5607 50ug/ml
ITS BD 354352 1%
Human TGFβ1 Peprotech 100-21 10ng/ml
Name Company Catalog Number Comments
Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Tween 20 BIOSESANG T1027
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-Collagen II antibody abcam  ab34712 1:100
 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody,
 Alexa Fluor 594 conjugate 
Molecular Probe  A-11037 1:200
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)  Catholic MASTER Cells

References

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Cite This Article
Jang, Y., Jung, H., Ju, J. H. Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity. J. Vis. Exp. (120), e54934, doi:10.3791/54934 (2017).

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