Summary

Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity

Published: February 24, 2017
doi:

Summary

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Abstract

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Introduction

Defekte im Gelenkknorpel nicht heilen natürlich. Folglich Stammzelltransplantation hat sich als vielversprechender Ansatz für die Reparatur von Knorpel beeinträchtigt vorgeschlagen worden. Jedoch erfordert dieses Verfahren sowohl die Übernahme von einer ausreichenden Anzahl von Stammzellen und die Induktion dieser Zellen chondrogene Differenzierung zu unterziehen. Knochenmark (BM) wurde als Quelle für Stammzellen weit verbreitet, aber Zellisolation aus BM hat zwei wesentliche Nachteile: Invasivität und ungenügender Ausbeute. Aufgrund seiner Leichtigkeit des Erwerbs, Fettgewebe ist eine bevorzugte Quelle für Stammzellen. Frühere Studien zeigten die Machbarkeit Stammzellen aus Fettgewebe zur Isolierung und chondrogene Differenzierung in diesen Zellen Zytokine, wie TGF-β1 1 unter Verwendung von 2 zu induzieren. Diese Verfahren sind wirksam, aber teuer.

Als preiswertere Alternative zu Cytokine können mechanische Belastungen verwendet werden,induzieren die chondrogene Differenzierung. Mechanische Belastung spielt eine kritische Rolle bei der Gesundheit von Gelenkknorpel Aufrechterhaltung 3, und es kann chondrogenen Phänotyp in verschiedenen Zellen induzieren. Beispielsweise induziert hydrostatischem Druck chondrogenen Phänotyp in Synovium abgeleiteten Vorläuferzellen über die MAP kinase / JNK – Weg 4 und mechanische Kompression induziert die Chondrogenese in mesenchymalen Stammzellen (MSCs) durch chondrozytische Gene 5 upregulating. Zusätzlich trägt Scherspannung auf die Expression von Chondrogenese bezogenen extrazellulären Matrix (ECM) in humanen MSCs 6. Kreiselschwerkraft (CG), ein leicht angewendet und kontrolliert mechanischer Beanspruchung durch Zentrifugation erzeugt, kann Differential Gen induzieren Expression in Zellen 7. Beispielsweise in Karzinomzellen Lungenepithelzellen, wird die Expression von Interleukin (IL) -1b durch Zentrifugation 8 nach oben reguliert. Therefore als experimentell induzierbaren mechanische Beanspruchung kann CG verwendet werden chondrozytische Genexpression in Stammzellen zu induzieren. Es bleibt jedoch unklar, ob CG die chondrogene Differenzierung von Stammzellen induzieren können.

In dieser Studie haben wir festgestellt, dass CG die Hochregulation von SOX9, einen Master-Regulator der Chondrogenese, in der menschlichen ASCS induziert, was zu einer Überexpression von chondrozytische Gene. Zusätzlich verglichen wir die Wirkungen von CG auf Chondrogenese mit denen von TGF-β1, die meisten der Wachstumsfaktor im Allgemeinen in vitro – Chondrogenese in Stammzellen zu induzieren , verwendet.

Protocol

Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Katholischen Universität von Korea (KC16EAME0162) und führte nach NIH-Richtlinien zugelassen. Alle Gewebe wurden mit schriftliche Einverständniserklärung erhalten. 1. Kreisel Gravity Laden und Pelletkultur Zellkultur und Ernte Kultur ASCS (P2-P3, siehe Materialliste) in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium-Low Glucose (DMEM-LG), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) be…

Representative Results

Kreiselschwerkraft induziert die Überexpression von chondrogenen Differenzierungsmarker in Fettgewebe gewonnenen Stammzellen. Um das Ausmaß der Zentrifugal-Schwerkraft bestimmen, die geeignet ist die chondrogene Differenzierung zu induzieren, ASCs wurden mit unterschiedlichen Graden der CG stimuliert (0, 300, 600, 1.200 und 2.400 xg) für 15 min. Nach der Stimulation wurden die ASCs erneut ausgesät auf Kulturplatten und kul…

Discussion

Die stemness Zustand von Zellen ist sehr wichtig für CG-induzierten Überexpression von SOX9. In unserer Studie konnte SOX9 Expression von CG in frühen Passage ASCs (2-3), aber nicht in späteren Durchgang ASCs induziert werden. Es wurde berichtet , dass während der Kultivierung ASCs 16 CD34 + -Zellen bis 3 Passagen enthalten. ASCS neigen dazu, die Expression von CD34 zu verlieren, wie die Zellen passagiert werden, in einer geringen Reaktion auf CG führt.

Mit zent…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C2116) and by Research Fund of Seoul St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea.

Materials

Plasticware
100mm Dish TPP 93100
60mm Dish TPP 93060
50 mL Cornical Tube SPL 50050
15 mL Cornical Tube SPL 50015
10 mL Disposable Pipette Falcon 7551
5 mL Disposable Pipette Falcon 7543
Name Company Catalog Number Comments
ASC Culture Media Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
DMEM Low glucose Life Technologies 11885-084 growth base media
Penicilin Streptomycin Sigma Aldrich P4333 1%
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044 10%
PBS/1 mM EDTA Life Technologies 12604-039
Name Company Catalog Number Comments
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose Life Technologies 11995 chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140-050
Dexamethasone Sigma Aldrich D2915 100nM
Penicilin Streptomycin Life Technologies P4333 1%
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044 1%
Ascorbate-2-phosphate Sigma Aldrich A8960 50ug/ml
L-proline Sigma Aldrich P5607 50ug/ml
ITS BD 354352 1%
Human TGFβ1 Peprotech 100-21 10ng/ml
Name Company Catalog Number Comments
Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Tween 20 BIOSESANG T1027
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-Collagen II antibody abcam  ab34712 1:100
 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody,
 Alexa Fluor 594 conjugate 
Molecular Probe  A-11037 1:200
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)  Catholic MASTER Cells

References

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Cite This Article
Jang, Y., Jung, H., Ju, J. H. Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity. J. Vis. Exp. (120), e54934, doi:10.3791/54934 (2017).

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