Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.
Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.
जोड़ कार्टिलेज में दोष स्वाभाविक रूप से ठीक नहीं है। नतीजतन, स्टेम सेल प्रत्यारोपण बिगड़ा उपास्थि की मरम्मत के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तावित किया गया है। हालांकि, इस पद्धति दोनों स्टेम कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या के अधिग्रहण और इन कोशिकाओं की प्रेरण chondrogenic भेदभाव से गुजरना करने की आवश्यकता है। अस्थि मज्जा (बीएम) व्यापक रूप से स्टेम सेल के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन बी.एम. से सेल अलगाव दो प्रमुख नुकसान है: invasiveness और अपर्याप्त उपज। अधिग्रहण के अपने आसानी के कारण, वसा ऊतकों से स्टेम कोशिकाओं का एक बेहतर स्रोत है। पिछले अध्ययनों से वसा ऊतकों से स्टेम कोशिकाओं को अलग-थलग और ये ऐसे TGF-β1 1, 2 के रूप में साइटोकिन्स, का उपयोग कोशिकाओं में chondrogenic भेदभाव उत्प्रेरण की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया। इन विधियों प्रभावी लेकिन महंगे हैं।
साइटोकिन्स के लिए एक कम लागत विकल्प के रूप में, यांत्रिक तनाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताchondrogenic भेदभाव प्रेरित। यांत्रिक लोड हो रहा जोड़ कार्टिलेज 3 के स्वास्थ्य को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और यह विभिन्न कोशिकाओं में chondrogenic phenotypes पैदा कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, हीड्रास्टाटिक दबाव एमएपी काइनेज / JNK मार्ग 4 के माध्यम से synovium व्युत्पन्न पूर्वज कोशिकाओं में chondrogenic phenotypes लाती है, और यांत्रिक संपीड़न chondrocytic जीन 5 upregulating द्वारा मानव mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) में उपास्थिजनन लाती है। इसके अलावा, कतरनी तनाव मानव MSCs 6 में उपास्थिजनन से संबंधित बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) की अभिव्यक्ति के लिए योगदान देता है। केन्द्रापसारक गुरुत्वाकर्षण (सीजी), एक आसानी से लागू किया और नियंत्रित यांत्रिक centrifugation द्वारा उत्पन्न तनाव, कोशिकाओं 7 में अंतर जीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, फेफड़ों उपकला कार्सिनोमा कोशिकाओं में, इंटरल्यूकिन (IL) -1b की अभिव्यक्ति centrifugation 8 से upregulated है। टीherefore, एक प्रयोगात्मक inducible यांत्रिक तनाव के रूप में, तटरक्षक स्टेम कोशिकाओं में chondrocytic जीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं हुआ है तटरक्षक स्टेम कोशिकाओं की chondrogenic भेदभाव प्रेरित कर सकते हैं।
इस अध्ययन में हमने पाया कि तटरक्षक SOX9 की upregulation, उपास्थिजनन के एक मास्टर नियामक प्रेरित, मानव ASCs में, chondrocytic जीन की overexpression में जिसके परिणामस्वरूप। इसके अलावा, हम TGF-β1 के लोगों के साथ उपास्थिजनन पर तटरक्षक के प्रभाव, वृद्धि कारक सबसे अधिक स्टेम कोशिकाओं में इन विट्रो उपास्थिजनन के लिए प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल की तुलना में।
कोशिकाओं के stemness राज्य SOX9 के तटरक्षक प्रेरित overexpression के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। हमारे अध्ययन में, SOX9 अभिव्यक्ति जल्दी पारित होने ASCs (2-3) में तटरक्षक द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, लेकिन बाद में पारित होने के AS…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C2116) and by Research Fund of Seoul St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea.
Plasticware | |||
100mm Dish | TPP | 93100 | |
60mm Dish | TPP | 93060 | |
50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ASC Culture Media Materials | |||
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100nM |
Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50ug/ml |
L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50ug/ml |
ITS | BD | 354352 | 1% |
Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10ng/ml |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate |
Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
loading star | Dyne Bio | A750 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells |