Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.
Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.
Defekter i ledbrosk inte läka naturligt. Följaktligen stamcellstransplantation har föreslagits som en lovande metod för reparation av försämrad brosk. Detta kräver dock att metoden både förvärv av ett tillräckligt antal stamceller och induktion av dessa celler att genomgå kondrogen differentiering. Benmärg (BM) har använts i stor utsträckning som en källa till stamceller, men cellisolering från BM har två stora nackdelar: invasivitet och otillräcklig avkastning. På grund av dess lätthet att förvärvet är fettvävnad en föredragen källa för stamceller. Tidigare studier visat att det är möjligt att isolera stamceller från fettvävnad och inducera kondrogen differentiering i dessa celler med användning av cytokiner, såsom TGF-β1 1, 2. Dessa metoder är effektiva men dyra.
Som en lägre kostnad alternativ till cytokiner, kan mekanisk påfrestning användas för attinducera kondrogen differentiering. Mekanisk belastning spelar en avgörande roll för att bevara hälsan hos ledbrosk 3, och det kan inducera kondrogena fenotyper i olika celler. Till exempel inducerar hydrostatiska trycket kondrogena fenotyper i synovium-härledda progenitorceller via MAP-kinas / JNK-vägen 4, och mekanisk kompression inducerar kondrogenes i humana mesenkymala stamceller (MSC) genom uppreglering chondrocytic gener 5. Dessutom bidrar skjuvspänning till uttrycket av kondrogenes relaterade extracellulära matrisen (ECM) i mänskliga MSC 6. Centrifugal punkten (CG), en lätt appliceras och kontrollerad mekanisk påkänning som alstras av centrifugering, kan inducera differentiell genexpression i celler 7. Till exempel i lung epiteliala karcinomceller, är uttrycket av interleukin (IL) -1b uppregleras genom centrifugering 8. Thärför, såsom en experimentellt inducerbar mekanisk påfrestning, CG kan användas för att inducera chondrocytic genuttryck i stamceller. Det är dock fortfarande oklart om CG kan inducera den kondrogena differentieringen av stamceller.
I denna studie fann vi att CG inducerade uppregleringen av SOX9, en master regulator av kondrogenes, i humana DSKer, vilket resulterar i överuttryck av chondrocytic gener. Dessutom, jämfört vi effekterna av CG på kondrogenes med de av TGF-β1, tillväxtfaktor som oftast används för att inducera in vitro kondrogenes i stamceller.
Den stemness tillstånd av celler är mycket viktigt för CG-inducerad överexpression av SOX9. I vår studie kunde SOX9 expression induceras av CG i tidig-passage DSKer (2-3), men inte i senare-passage ASCs. Det har rapporterats att, under odling, ASC: er innehåller CD34 + celler tills 3 passager 16. ASC: er tenderar att förlora uttrycket av CD34 som cellerna passe, vilket resulterar i ett lågt svar på CG.
Med centrifugal gravitationskraft, kan hydrostatiskt tryc…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C2116) and by Research Fund of Seoul St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea.
Plasticware | |||
100mm Dish | TPP | 93100 | |
60mm Dish | TPP | 93060 | |
50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ASC Culture Media Materials | |||
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100nM |
Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50ug/ml |
L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50ug/ml |
ITS | BD | 354352 | 1% |
Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10ng/ml |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate |
Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
loading star | Dyne Bio | A750 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells |