Summary
Denne protokollen beskriver teknikker for kvantifisering og karakterisering av kromosomale avvik in vitro i RAW264.7 musemakrofager etter behandling med omgivende luft partikler.
Abstract
Eksponering for svevestøv (PM) er en stor verden helse bekymring, noe som kan skade ulike cellulære komponenter, inkludert kjernefysisk genetisk materiale. For å vurdere effekten av PM på kjernefysisk genetisk integritet, er strukturelle kromosomavvik scoret i de metafase sprer av mus RAW264.7 makroceller. PM er hentet fra luften med et høyt volum total suspenderte partikler sampler. Det oppsamlede materiale er oppløst, og filtrert for å holde den vannoppløselige, fine parti. Partiklene er kjennetegnet for den kjemiske sammensetning av kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Forskjellige konsentrasjoner av partikkelsuspensjonen blir tilsatt til en in vitro-kultur av RAW264.7 musemakrofager for en total eksponeringstid på 72 timer, sammen med ubehandlede kontrollceller. På slutten av eksponeringen, blir kulturen behandlet med colcemid å stanse celler i metafase. Cellene blir så høstet, behandlet med hypoton oppløsning, fiksert i acetomethanol, dropped på glassplater og til slutt farget med Giemsa løsning. Lysbilder blir undersøkt for å vurdere strukturelle kromosomavvik (CAS) i metafase sprer på 1,000X forstørrelse ved hjelp av en lys-feltet mikroskop. 50-100 metafase spredning er scoret for hver behandlingsgruppe. Denne teknikken er tilpasset for påvisning av strukturelle kromosomavvik (CAS), som kromatid-type pauser, kromatid-type utveksling, asentrisk fragmenter, disentrisk og ring kromosomer, dobbel minutter, endoreduplication og Robertsonske trans in vitro etter eksponering for PM. Det er en kraftig metode for å knytte et veletablert cytogenetisk endepunkt til epigenetiske forandringer.
Introduction
Det har blitt anslått at eksponering for svevestøv (PM) forårsaker over 3 millioner overflødig dødsfall årlig, hovedsakelig fra hjerte- og karsykdommer og lungekreft en. Faktisk PM ble anerkjent som kreftfremkallende for mennesker ved International Agency for Research on Cancer (gruppe 1), som økt risiko for lungekreft med økende nivåer av eksponering for PM har blitt vist to. Interessant, nesten alle kreftceller havn numeriske og / eller strukturelle kromosomavvik. Partikkelformet organisk karbon er en variant, kompleks, og heterogen blanding, hvis sammensetning og størrelsesfordeling avhenger av utslipp, så vel som fysiske og kjemiske omdannelser. Det står 35-55% av urban PM 2,5 masse (PM 2,5 mikrometer i størrelse og mindre) og mer enn 60% av landlige og kontinentale bakgrunn PM 2,5 masse tre, fire. Den vannløselig fraksjon står for 30-90% av organisk aerosol. Et stort antall organiske forbindelserer blitt identifisert, inkludert alifatiske hydrokarboner, polysykliske aromatiske hydrokarboner og deres oksygenerte og nitrerte derivater, alifatiske aldehyder og alkoholer, frie fettsyrer og deres salter, dikarboksylsyrer, multifunksjonelle forbindelser, proteiner og humuslignende makromolekyler (HULIS) ved hjelp kromatografiske metoder kombinert med massespektrometri teknikker 5-8. Disse forbindelser utgjør mindre enn 10-20% av partikkelformet organisk karbon, og således de fleste av organisk karbon er ukjent 9.
Eksperimentelle bevis tyder på at cytotoksisitet, oksidativt stress og betennelse er involvert i utviklingen av PM-assosierte patologiske tilstander. Det har nylig blitt vist, men at utsettelse for PM resulterer også i en rekke epigenetiske endringer, inkludert forandringer i DNA-metylering av repetitive elementer, i både eksperimentelle in vitro-systemer, og i mennesker 10-12. Av spesiell interesse er virkningen avPM på satellitt DNA - store og små satellitter - som er funnet i heterochromatic regionen rundt cent av kromosomer. Det ble vist at disse effekter kan vedvare av natur, som de kan påvises i minst 72 timer etter eksponering 12. Endringer i DNA-metylering, spesielt rundt sentromerer, kan føre til akkumulering av satellitt-DNA-mRNA-transkripter, kompromiss kromosomalt integritet under celledeling og, senere, resulterer i utvikling av en rekke patologiske tilstander 13.
Tilpasning av cytogenetisk tilnærming for analyse av instanser som et sluttpunkt av epigenetiske endringer forårsaket av PM, derfor er av stor betydning. Her rapporterer vi tilnærming for omgivelses PM innsamling og forberedelse, in vitro eksponering og analyse av instanser bruker murine makrofag RAW264.7 modellsystem. Makrofager utgjør den første forsvarslinje mot inhalerte fremmedlegemer og derfor tsin cellelinje tjener som en etablert og den mest brukte modellen i partikkel toksikologi 11, 12, 14, 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Partikkel Collection og klargjøring
- Kalibrering av høyt volum total suspenderte partikler sampler
- Frakoble sampler motoren fra massestrømningsregulatoren og kobler motoren til en stabil strømkilden (figur 1).
MERK: Et filter brukes ikke under denne prosedyren. - Monter kalibratoren åpning og topplading av adapterplaten til sampler. Stram de beste lasting adapter hold-down nøtter sikkert for å sikre at ingen luftlekkasjer er til stede. Tillat sampler motor for å varme opp til normal driftstemperatur (ca. 10-15 min).
- Gjennomføre en lekkasjetest ved å dekke hullene på toppen av åpningen og presset trykk på åpningen med hendene. Lytt etter en high-pitched pipende lyd laget av rømmer luft. Hvis dette høres, stram de beste lasting adapter hold-down nøtter som en lekkasje er til stede. Hvis lyden er lavere, lekkasjen er i nærheten av en av de andre pakningene i system.
- Koble den ene side av en vann-manometer til trykkuttak på siden av åpningen med en gummi vakuumrør. Forlater den motsatte side av manometeret åpen til atmosfæren. Hold et manometer vertikalt for å sikre nøyaktige målinger. Tapping baksiden av den kontinuerlige strømmen opptakeren vil bidra til å sentrere penn og gi nøyaktige målinger.
- Gjenta trinn 1.1.2 hjelp av fem strømningshastigheter som representerer driftsstrømningshastigheter fra 30 til 60 fot / minutt (omtrent hver 5-6 ft 3 / min). Juster knotten på variabel åpning til fem ulike posisjoner og ta fem ulike målinger.
- Spill omgivelseslufttemperatur, omgivelses lufttrykk, sampler serienummer, åpningen serienummer, åpning helling og skjærings med dato for sist sertifisert, dato, site plassering, og operatørens initialer på kalibreringsarket.
- Frakoble sampler motoren fra massestrømningsregulatoren og kobler motoren til en stabil strømkilden (figur 1).
- Total suspenderte partikler prøvetaking og gravimetrisk analyse
- Pakk en8 "x 10" kvartsfiberfilter i to lag med aluminiumsfolie. Plasser filteret innpakket i ovnen og temperatur ved 550 ° C. Bake av filteret i minst 4 timer. La ovnen avkjøle og hente filteret. Plasser filteret i eksikator med CaCO 3.
- Vei filteret i en mikrovekt med en presisjon på 10 ug. Gjenta målingen tre ganger i løpet av en dag. Individuelle målinger bør være innen 25 mikrogram. Dersom dette ikke oppnås, returnere innpakket filteret til tørkeapparat og gjenta prosessen neste dag.
- Åpne ly lokket (figur 2). Fjern filterholderen rammen ved å løsne de fire vingemutterne, slik at messingbolter og skiver for å svinge ned ut av veien. Brett ut filteret fra aluminiumsfolie, og bruke renset pinsett til å nøye sentrere det, grovere siden opp på støtte skjermen. Riktig justere filteret på skjermen.
- Plasser rammen på skjermen, og fest den medmessing bolter og skiver mens søknad tilstrekkelig press for å unngå luftlekkasje på kantene. Tørk støv opphopning fra rundt filterholderen med en ren klut. Lukk ly lokket forsiktig og sikre den.
- Sørg for at alle ledninger er koblet til deres passende kontakten stikkontakter og slangen mellom viftemotoren trykk trykk og kontinuerlig strøm opptakeren er koblet til.
- Forbered flyten opptaker. Trykk penn arm løfteren å heve pennen punkt og sette inn et nytt diagram. Juster tappen på diagrammet til stasjonen hub av spilleren og trykk med tommelen for å senke kartsenter på hub. Still tid ved å dreie drivnavet med urviseren til riktig tid i skjema er på linje med tidsindeksen peker.
- veksle manuelt på sampler og starte samlingen. Overvåk opptakeren for å være sikker på at det er inking riktig og medgått tid indikator for å være sikker på at den fungerer som den skal.
- På slutten av prøveperioden, slå av sampler, rekordmedgått tid og hente diagrammet. Fjern rammen for å eksponere filteret. Fjern den eksponerte filteret fra støtte ved å holde den forsiktig i endene med pinsett. Brett filter på langs slik at prøven berører prøven to ganger, og pakk den i den opprinnelige aluminiumsfolie.
- Oppbevar filter i et tørke med CaCO 3 i minst 24 timer før veiing. Gjenta trinn 1.2.2 for å måle vekten av filtrene etter prøvetaking. Plasser filteret i en zip plastpose og oppbevar den i -80 ° C inntil analyse.
- Analyse av samlet totalt suspendert partikler prøven
- Hent den lagrede filter, brette aluminiumsfolie og overføre filteret på en ren Teflon overflate. Bruk pinsett og skalpell, kutt ytre (hvit) del av filteret og kast.
- Deretter skjærer filteret i 0.5 "x 0.5" biter og legg bitene i en 100 ml flaske. Tilsett 50 ml av ultrarent vann. Plasser kolbe i en ultralydbad og sonikere i 60 minutter ved 33 ± 3 kHz.
- Filter ekstrakt gjennom et 0,45 um polypropylensprøyte filter til en 100 ml rundkolbe. Fordampe vannet ved anvendelse av en rotasjonsfordamper instrument under trykk ved 50 ° C inntil ca. 5 ml ekstrakt forblir i kolben.
- Fordampe det resterende vann i en 15 ml pæreformet kolbe med kjent vekt. Veie kolben med det tørre ekstrakt og ta opp massen til tørrstoff.
- Oppløs den tørre prøven med 400 mL av D 2 O ved sonikering i 15 min og overfør til en 5 mm standard NMR-rør. Sentrifuger i 5 minutter ved 12.000 xg ved romtemperatur for å fjerne eventuelt uoppløst materiale.
- Gjenta med 300 ul D 2 O. Tilsett 10 ul av NaN3 1,4% (endelig kons .: 0,02% vekt / volum) i NMR-røret. Tilsett 10 ul (32 ug) av totale suspenderte partikler (TSP) D4 (3,2 mg / ml) til D 2 O (sluttkonsentrasjon 0,258 mM) i NMR-røret.
- Erverve 1 H-NMR-spektra ved bruk av et NMR-spektrometer drevet ved 600,17 MHz.
- Sett NMR rør inn i trippel resonans cryoprobe. Kalibrere instrumentet i følgende rekkefølge: lås, tune, mellomlegg, 90 ° pulslengde kalibrering og mottaker gain justering.
- Mål-spektra ved 25 ° C med en 1 D eksitasjon skulptering sekvens ved bruk av 180 vann-selektive pulser i digital Quad deteksjonsmodus, 8192 skanner, 4 dummy skanner, sveipebredde på 8012,57 Hz, frekvensforskyvning for vann signal undertrykkelse satt til 4,70 ppm, 1,70 sek oppkjøpet tid, 32768 tidsdomenedatapunkter (TD), 1 ms varighet gradient (P16), 100 usekunder utvinning forsinkelse etter gradient (D16).
- Fremgangsmåte 1H NMR-spektrene ved å bruke en linje utvidelse på 1 Hz og null fylling med en faktor på 2 (65.536 datapunkter). Korriger fase og baseline manuelt og integrere. Sett TSP-d4 topp ved 0,0 ppm.
- Hent den lagrede filter, brette aluminiumsfolie og overføre filteret på en ren Teflon overflate. Bruk pinsett og skalpell, kutt ytre (hvit) del av filteret og kast.
2. Partikkel Eksponering
- Kultur satt opp
- Varm komplett vekstmedier inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin-streptomycin-løsning (100 U / ml), 0,25% trypsin-løsning og kalsium magnesium-fri fosfatbuffersaltløsning (PBS) i et vannbad (ved 37 ° C) i minst 30 min før kultur start.
- Ta ut en T75 kolbe fra 5% CO 2 inkubator som inneholder dyrkede RAW264.7 celler og vaske cellene med 2 ml forvarmet PBS to ganger.
- Løsne adherente RAW264.7 celler fra bunnen av vevskultur fartøy som bruker 1 ml av forvarmet trypsin-løsning fulgt av skraping.
- Samle celler fra vevkultur fartøy og foreta en enkelt cellesuspensjon ved gjentatt pipettering. Tell antall celler med trypanblått og plate ved en densitet på 8000 / cm 2 (500 000 celler totalt) i en 100 mm vevskulturskål med forvarmes komplett medium. Juster medievolumet til 10 ml for en endelig konsentrasjon på 50.000 cellerper ml.
MERK: Doble antall plater hvis DNA metylering analyse er også utført. - Plasser nylig belagt RAW264.7 cellene tilbake i 5% CO 2 inkubator ved 37 ° C og la til å feste i 24 timer.
- Også i en biosikkerhet kabinett, suspen filtrerte partikler. For eksempel, fortynne partiklene i en konsentrasjon på 0,5 mg / ml i steril PBS i en 5 ug / ml behandling dose og ved 5 mg / ml i en 50 ug / ml behandlingsdose. Fortynninger kan fremstilles opp til måned på forhånd og lagret ved -80 ° C.
- Behandling med svevestøv
- Ta ut cellene fra 5% CO2 inkubator og sjekke under 10x forstørrelse ved hjelp av et invertert mikroskop for cellevekst, cellemorfologi, kultur tilstand, og forurensning. Man bør forvente å ha minst 30% sammenflytende celler på dette stadiet.
- Aseptisk, aspirer media bruker sterilisert pipette og vaske kultur fartøy med 2 ml 37 ° C PBSto ganger for å fjerne media og flytende eller døde celler.
- Legg til en forhåndsbestemt dose av partikkelformet materiale med friskt medium i kulturbeholdere og inkuberes i ønsket tid ved 37 ° C i 5% CO2 inkubator. I denne studien behandle RAW264.7 celler med PM for 72 timer til parallell eksponering brukes for samtidig gentoksisk og epigenotoxic analyse.
MERK: Cytotoksisitet kan negativt påvirke kvaliteten på cytogenetisk analyse. Derfor er ytterligere analyser som cytotoksisitet, DNA-metylering, Western blotting, eller genekspresjonsanalyser vanligvis utført på behandlede celler. Expose celler som beskrevet og fortsette med den spesifikke analysen ønsket. Uerfarne brukere kan også være lurt å inkludere en positiv kontroll, for eksempel metyl metansulfonat å teste deres evne til å oppdage instanser.
3. cytogenisitetstest
- Behandling for å arrestere celler i metafase
- Varm colcemid såning (10 ug / ml) i et 37 ° C vannbad i 30 min. Tørk av lokket med 70% alkohol under en biosikkerhet kabinett for å minimere risikoen for forurensning
- Fjerne media aseptisk og vaske kultur fartøy med 2 ml forvarmet PBS to ganger.
- Legg forvarmet friskt medium (2 ml media / 10 6 celler) inneholdende colcemid oppløsning (5 ul / ml) i dyrkningsbeholder og inkuberes i 2 timer.
- Cell innhøsting
- Varm trypsinoppløsning og PBS i et vannbad som ble holdt ved 37 ° C i 30 min. Fra dette trinnet og utover, er det ikke nødvendig å opprettholde aseptiske tilstand.
- Fjerne media, vaske kulturbeholdere med 2 ml 37 ° C PBS i to ganger, legge nødvendige volumet av forvarmet trypsin løsning (vanligvis 2 ml til 60 mm kulturskål eller T25 kolbe og 4 ml for 100 mm skål eller T75 kolbe ), og plasserer kulturen fartøyet tilbake i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 1 min.
- Take ut dyrkings-beholderen, løsne cellene ved hjelp av en skraper, og tilsett 10 ml PBS for å stoppe trypsin handling.
- Pipette opp og ned minst ti ganger for å være enkelt celle suspensjon og overføre celler i en 15 ml konisk bunn sentrifugerør.
- Sentrifuger cellesuspensjon ved 400 xg i 5 minutter i en sving ut sentrifuge ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten, bryte cellepelleten ved forsiktig banking, tilsett 10 ml PBS, og igjen sentrifuger i fem min.
- Hypoton behandling og fiksering
- Forvarm 0,075 M kaliumklorid oppløsning i et 37 ° C vannbad i minst 30 minutter.
- Fjern supernatanten uten å forstyrre cellepellet og la ca. 0,5 ml PBS.
- Forsiktig bryte cellepellet og gjøre enkelt cellesuspensjon ved hjelp av en pipette P200.
- Tilsett 4 ml forvarmet kaliumklorid løsning dråpe for dråpe med forsiktig risting.
- Inkuber cellene i hypoton potassium kloridoppløsning i et 37 ° C vannbad i 20 min.
- Gjøre fersk acetomethanol oppløsning ved tilsetning av 3-deler metanol med en-del iseddik. Hold denne nylaget fiksativ ved romtemperatur.
- Etter hypoton behandling, tilsett et likt volum (4 ml) av fikseringsmiddel i røret og forsiktig blande løsningen ved å vende røret.
- Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten. På dette stadiet celle pellet størrelse øker, blir hvitaktig og mer synlig.
- Fjern supernatanten, tilsett 4 ml frisk fiksativ og holde ved romtemperatur i 30 min.
- Sentrifuger ved 400 xg i 5 min, fjern supernatanten, og gi to vasker med 4 ml fiksativ.
- Slide rengjøring og metafase spredning forberedelse
- Fordyp glass helt i 10% flytende vaskemiddel i 30 min.
- Skyll lysbildene grundig i kaldt rennende vann fra springen i 30 min.
- Rinse lysbilder tre ganger med destillert vann for å fjerne vaskemiddel, fordype i destillert vann, og oppbevar i kjøleskapet for senere bruk.
MERK: Rengjøring lysbilder før bruk letter ensartethet for å spre og øker meta kvalitet. - Drop 10 mL cellesuspensjon på kjølt våt lysbilde og la det lufttørke over natten ved romtemperatur.
- Flekker og montering
- Fremstille 50 ml Giemsa-farging oppløsning ved å blande en del av Giemsa beis løsning med en del av PBS og hell i en Coplin krukke.
- Fordype lysbildene i farging løsning for 20 min.
- Skyll lysbildene i destillert vann for å fjerne overflødig flekken og umiddelbart tørke lysbilder ved hjelp av en hårføner.
- La lysbilder ved romtemperatur over natten.
- Påfør en eneste dråpe montering medium på lysbildet, forsiktig plassere en dekkglass på montering medium, la medium å spre seg over raset sakte, og fjerndet overskytende medium med et papirhåndkle. La montert lysbilde tørke i minst en time før du flytter eller ser under et mikroskop for å unngå bevegelse av dekkglass.
Forsiktig: Det er viktig å plassere dekkglass forsiktig uten at det dannes bobler i dette trinnet. Bruken av sterk varme for å fjerne bobler er ikke anbefalt.
- Mikroskopisk observasjon og aberrasjon typer
- Undersøke de strukturelle instanser i metafase sprer ved 100X forstørrelse ved hjelp av en god kvalitet lyse-feltet mikroskop.
- Score minst 50 til 100 metafase sprer seg for hver behandlingsgruppe for behandlinger som induserer et stort antall av CAS. For mindre effektstørrelser, er analysen av opptil 300 metafase sprer anbefales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stor forsiktighet bør utvises i å velge plasseringen av TSP sampler, samt den tiden av året når samlingen er utført. Den kjemiske sammensetningen, så vel som størrelsen på partiklene kan i vesentlig grad påvirke resultatene. Det innsamlede materialet skal være synlig mot den hvite filteret. En vanlig mus metafase spredning vil ha 40 asentrisk kromosomer. Målet med teknikken er å påvise en endring (eller mangel på sådan) i andelen av unormale kromosomer i behandlede celler versus kontroller. At endringen kan da bli kvantifisert (antall unormale kromosomer) og kvalifisert (type unormalt).
Normal mus metafase spredning vil ha 40 asentrisk kromosomer (figur 3A). Behandling med partikler saker induserer forskjellige instanser som vist i figur 3, for eksempel kromatid brudd (3B), asentrisk (fragment
Figur 1. høyt volum totalt suspenderte partikler (TSP) sampler. Bildet viser TSP sampler installert i et tak i et urbant område å samle ambient partikler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Lastet kvarts fiber filter følgende samling med høyt volum TSP sampler. Close-up på filteret installert på TSP sampler, etter bruk. Legg merke til at fargen på filteret endret fra hvit til grå. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Mikroskopbilde viser representative eksempler på forskjellige typer av strukturelle avvik indusert i RAW264.7 celler etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av partikkelformig materiale. Aberrasjonene er indikert med piler. (A) normal metafase spredning med 40 acrocentric kromosomer, (B) kromatid-type pause (CTB), (C) asentrisk fragment (acentrics), (D) ring kromosom, (E) disentrisk kromosom (DIC), (F) double min (Dimn), (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytogenetisk undersøkelse eller mikroskopisk analyse av tallene eller strukturer av kromosomer, først og fremst i metafase sprer seg, gir informasjon avgjørende for prognose, risikovurdering, og behandling for ulike sykdommer. Det er nå godt etablert som cytogenetiske abnormiteter er forbundet med progresjon og utvikling av en rekke sykdommer, inkludert kreft. Hittil har instanser blitt funnet i alle de store krefttyper. CAer kan oppstå spontant eller av enten eksterne eller interne stimuli, slik som ioniserende stråling (IR) - en av de store ytre risikofaktorer som kan indusere forskjellige typer av forandringer cytogenetisk 16. Analyse av CAS hjelpemidler i vurderingen av absorbert stråledose (kalt cytogenetisk stråling biodosimetry). Videre analyse av frekvens og type spesifikk avvik gir også informasjon som er viktig for å bestemme kvaliteten av strålingen ble absorbert 17, 18. Cytogenetisk studien gir et direkte bilde av iMpact av skadelige stoffer på DNA. Dette er i motsetning til indirekte teknikker slik som komet analysen. Imidlertid har cytogenetisk undersøkelse vært lite benyttet i felt utenfor stråling, blant annet på grunn av de mange hands-on trinn involvert.
Selv om eksponering for organisk karbon til stede i PM er kjent for å påvirke helsen vår, er det få studier som rapporterer biologiske effekter inkluderer deres sammensetning 9. Dette er på grunn av de kostbare og tungvinte kromatografiske metoder som krever arbeidskrevende ekstraksjon, foredling, konsentrasjoner, og derivatiseringsreaksjoner protokoller, så lenge de bare gir innsikt for en liten del av en meget spesiell type forbindelser hver gang. Videre protokollene resultere i betydelig manipulering eller ødeleggelse av den opprinnelige prøven, og dermed ytterligere testing kan ikke utføres. Fordeler med kjernemagnetisk resonans (NMR) analyse er at NMR er en ikke-destruktiv metode; det krever et svært begrenset antall steps (ekstraksjon, konsentrasjon) før analyse, og høyfrekvente NMR-instrumenter (fra 400 MHz til 900 MHz) er tilgjengelige i mange, om ikke alle, universiteter innenfor kjernelager. En omfattende gjennomgang av atmosfærisk aerosol NMR-studier har nylig blitt publisert 19. Til slutt, på grunn av dens evne til å gi strukturell informasjon og bindinger mellom grupper, er NMR overlegen andre spektrometriske metoder som FT-IR, UV-Vis, og Raman-spektroskopi som bare gir data om typen av funksjonelle grupper. Om nødvendig kan morfologisk karakterisering av PM utføres i tillegg til NMR-spektrometri med bruk av scanning elektronmikroskopi.
Selv fra et enkelt sted, sammensetningen av PM oppsamlet kan variere avhengig av tiden på året. En stor nok mengde av materiale som skal behandles og holdes ved -80 ° C for gjentatte eksperimenter eller komplementære analyser. Trinnene 2.1.1 til og med 3.1.3 bør utføres aseptisk i en biosikkerhets kabinett. Dersom forurensning eller svekket cellulær morfologi er observert, ikke fortsetter med resten av protokollen. Trypsin behandlingstiden må justeres på grunnlag av celletype. Her, makrofager er svært adherent, og vi har funnet at en kombinasjon av 1 min trypsin og skraping fungerer best, men trypsin alene i 5 min verk for de fleste celletyper. Hypoton behandlingstiden også varierer avhengig av celletype og må standardiseres. Dosen og behandlingstiden av colcemid er de viktigste parametrene for kromosom forberedelse; en over-dose kan drepe celler eller stanse cellesyklusen. Vi beskriver her betingelser for RAW264.7 celler, og optimalisering er nødvendig for andre celletyper. Unnlatelse av å finne ideelle forhold i dette trinnet kan ha negativ innvirkning på mitotisk indeks samt kromosom morfologi, påvirker resultatene. Det anbefales også å vurdere nivåene av cytotoksisitet av PM før cytogenetisk analyse og velg dosene tilsvarende.
in vitro toksikologiske vurderingene er begrenset av den type som brukes celler, eksponering størrelse og partikkelkonsentrasjoner. Videre er det i denne studien, benyttet vi den vannoppløselige ekstrakt av PM og kan derfor potensialet av vannuoppløselige art å forårsake cytogenetisk aberrasjoner ikke forklares. Andre begrensninger er forbundet med tilstedeværelsen av "polymorfe varianter" - variasjoner i centromeric regionene og korte armene på kromosom; noen submikroskopiske eller kryptiske rearrangementer som kan feiltolkes og nærværet av komplekse Karyotyper.
Her viser vi at innføringen av cytogenetisk analyse kan hjelpe til med identifisering av PM-indusert skade på DNA, og kan potensielt tjene som en prediktiv endepunkt i vurdering av helseeffekter forårsaket av eksponering for ambient PM. Vår studie er, så vidt vi vet, den første til å indikere instanser som svar på PM. Replication av disse resultatene erønskelig å bekrefte våre funn. Denne protokollen kan også være innrettet til å vurdere nesten hvilken som helst type av mistenkt DNA-ødeleggende middel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet delvis av National Institute of Health Center of Biological fremragende forskning [stipend nummer 1P20GM109005], Arkansas Space Grant Consortium gjennom National Aeronautics and Space Administration [stipend nummer NNX15AK32A], og National Institute for Occupational Safety og helse (NIOSH) [tilskuddet antallet 2T420H008436]. Forfatterne ønsker å takke Christopher Fettes for korrekturlesing og redigering av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , IARC. Press Release 10-17-2013 (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , Springer. 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
