Högupplöst respiration att bedöma mitokondrie funktion i Permeabilized och intakta celler

Summary

Hög upplösning respiration används för att bestämma mitokondriella syreförbrukning. Detta är en enkel teknik för att bestämma mitokondriella andningskedjan komplex "(I-IV) andningsfrekvens, maximal mitokondriella elektrontransportsystemet kapacitet och mitokondriell yttre membran integritet.

Abstract

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

Introduction

Mitokondrier fyller viktiga roller i cellulär energimetabolism, i synnerhet genom att använda syre för att producera adenosintrifosfat (ATP). De är inblandade i celldöd och i flera humana sjukdomar. Mitokondriell oxidativ fosforylering (OXPHOS) kombinerar elektrontransport längs elektrontransportkedjan med syreförbrukning och ATP-syntes. Den mitokondriella trikarboxylsyra (TCA) cykel är inblandad i omvandlingen av proteiner, kolhydrater och fetter i energirika föreningar som nikotinamidadenindinukleotid (NADH) och flavinadenindinukleotid _(FADH2). Elektroner av NADH och _FADH2 överförs sedan till andningselektrontransportkedjan proteinkomplex (I-IV) som är belägen i det inre mitokondriemembranet. Dessutom kan två andra redox vägar överföra elektroner till elektrontransportkedja: i) mitokondriell elektronöverförande flavoprotein (ETF), som är belägen på matrisen ytan av det inre mitochondrial membran, och levererar elektroner från fettsyra β-oxidation; och ii) mitochondrial glycerofosfatdehydrogenas som oxiderar glycerofosfat till dihydroxiaceton fosfat och matar elektroner till den mitokondriella elektrontransportkedjan. Komplex IV (den ultimata elektronacceptor) överför elektronerna till en syremolekyl, omvandla syre till två vattenmolekyler. Förflyttning av elektronerna från andningselektrontransportkedjan komplex I-IV är kopplad med protonflöde från den mitokondriella matrisen till intermembrane utrymme som etablerar en elektrokemisk gradient över det mitokondriella innermembranet. Efteråt mitokondriella komplex V (ATP-syntas) skyttlar vätejonerna tillbaka in i mitokondriematrisen och syntetiserar ATP-molekyler. OXPHOS funktion kan bedömas in vivo och in vitro med användning av olika tekniker och olika mitokondriella respirationstillstånd kan erhållas. I isolerade mitokondrier följande respiratory tillstånd kan mätas: i) basal mitokondrie andning (tillstånd 1), ii) syreförbrukningen efter tillsats av specifika substrat av mitokondriella andningskedjan komplex (tillstånd 2), iii) maximal mitokondrie syreförbrukning efter tillsats av mättande koncentrationer av adenosindifosfat (ADP) (tillstånd 3) och iv) vilande andning efter ADP konsumtion (omräknat till ATP) (tillstånd 4). I intakta celler följande andningstillstånd kan mätas: i) basalcellsyreförbrukning i närvaro av endogena substrat och ADP, ii) basalcellsyreförbrukning i närvaro av oligomycinkänslig (oligomycinkänslig-okänsliga andning) och oligomycinkänslig känsliga andning (ATP omsättningen), iii) FCCP okopplade andning, och iv) icke-mitokondrie andning efter tillsats av antimycin A och rotenon. I permeabiliserade celler, kan specifika substrat av elektrontransportkedjan komplex och ADP tillsättas och maximala komplexa beroende respirationshastigheter arådana så komplext I-, II- och IV-beroende respirationshastigheter kan mätas.

Mätningar av cellandningen ge viktiga insikter i mitokondriell lungkapacitet är specifik för komplex I-IV, mitokondriell integritet och energiomsättning ^{en, två, tre.} En av anordningarna som möjliggör mätningar av mitokondriell syreförbrukning med hög noggrannhet, upplösning och känslighet är den högupplösta oxygraph ^4. Den högupplösta oxygraph enheten innehåller två kammare med insprutningsöppningar och varje kammare är utrustad med en polarografisk syresensor. Cellulära eller isolerade mitokondriella suspensioner rörs kontinuerligt i respirometer. För att bedöma mitokondriefunktion, substrat och inhibitorer för mitokondriell komplex aktivitet kan tillsättas efter standardprotokoll. Substrat och inhibitorer kan titreras genom injektion into kamrarna i oxygraph och syreförbrukning beräknas med hjälp av programvara och uttrycktes som pikomol per sekund per antalet celler. Högupplöst respiration erbjuder flera fördelar jämfört med traditionella och konventionella polarografisk syreelektrod enheter inklusive ökad känslighet och förmåga att arbeta med ett litet antal biologiska prover, såsom intakta eller permeabiliserade celler. Dessutom innehåller varje enhet två kamrarna, och respirationshastigheter kan spelas in samtidigt vid jämförelse av syrekoncentrationer. Den högupplösta oxygraph har också fördelen av minskat läckage av syre från enhetens kamrarna jämfört med traditionella polarografiska syreelektrodanordningarna. En annan anordning som nyligen utvecklats för att mäta cellulär syreförbrukningen är 96 brunnar extracellulärt flöde analysator ^5. Den extracellulära flödes analysator är utrustad med fluorescens istället för polarografiska sensorer. Fördelarna med den extracelluläraflux analysator jämfört med den högupplösta oxygraph är i) det är en stor del automatiserad enhet, ii) det är möjligt att mäta syreförbrukningen i 24- och 96-brunnsplattor för high-throughput screening, därför kräver mindre mängder av biologiska prover, och iii) ytterligare en mätning av cellulär glykolytiska flux är möjlig. Nackdelarna med den extracellulära flödes analysatorn i jämförelse med den högupplösta oxygraph är i) de höga kostnaderna för enheten och av förbrukningsmaterial såsom fluorescerande plattor, som är icke-återanvändbara, och ii) endast fyra föreningar per analys / brunn är injicerbara systemet är därför inte möjligt för substrat-frikopplare-inhibitor titrering protokoll.

I den aktuella studien använder vi hög upplösning respiration att bestämma mitokondrie andning. För cellulära syreförbrukning experiment cellerna permeabiliseras för att tillåta inträde av exogent ADP och oxider mitokondriella substrat för matning elektroner in i complexes i andningsorganen. Detta tillvägagångssätt gör dissektion av enskilda mitokondriella komplex andningskapacitet, vilket är en klar fördel jämfört med intakta celler (många substrat cell ogenomträngligt). Emellertid kommer cellmembranet permeabilization störa barriären mellan cytosolen och extracellulära utrymmet och medium (tvätta ur cytosoliska lösta ämnen) och sammansättningen av det intracellulära utrymmet jämviktas med det extracellulära mediet. En av nackdelarna med permeabiliserade celler över intakta celler är att det mitokondriella yttre membran kan skadas om stora mängder rengöringsmedel används under cell permeabilization. I intakta celler, basala, kopplade och okopplade andning av intakta celler kan mätas. Denna metod utvärderar syreförbrukningen hos intakta celler utan tillsats av exogena substrat och ADP, återger lungfunktion hos den integrerade cellen och även tillhandahålla information om maximal mitokondriella elektron transport kapacitet ^{6, 7.} En av fördelarna med intakta celler över permeabiliserade celler är att cellulära miljön inte störs och mitokondrier är i kontakt med hela komponenter av cellerna. För att permeabilisering cellplasmamembranet, har rengöringsmedel såsom digitonin använts ^åtta. Däremot kan mitokondrie yttre membran integritet äventyras om stora mängder digitonin användes. För att bekräfta att mitokondriell yttre membran integritet inte äventyras i permeabiliserade celler, digitonin titrering för att bestämma den optimala koncentrationen för cellulär permeabilization. För dessa experiment, celler återsuspenderades i andningsmedium och digitonin koncentrationen titreras genom respiration i närvaro av mitokondriella substrat och ADP, och andningsfrekvens mäts. Respiration av intakta, icke-permeabiliserade celler stimuleras inte i närvaro av mitochondrial substrat och ADP. Men skulle efterföljande stegvis digitonin titrering ge gradvis permeabilization av plasmamembran, och optimal digitonin koncentration erhålls. Detta visas genom ökningen av andning upp till full permeabilization. Kan verifieras mitokondrie kvalitet och yttre membran integritet genom att tillsätta exogena cytokrom c ^{2, 9.} Cytokrom c är ett 12 kDa elektronbärande proteinet av den mitokondriella elektrontransportkedjan ^{10, 11, 12.} Den är lokaliserad i den mitokondriella intermembrane utrymme, och är involverad i syreförbrukning, bärande elektroner från komplex III till komplex IV. När mitokondriella yttre membranet är skadat, är cytokrom c frigörs och mitokondriesyreförbrukningen minskar. Vid tillsats av exogen cytokrom c, är ett tecken på en något augmentation i mitokondriell andningstörde mitokondriell yttre membranet.

I permeabiliserade celler, substrat och hämmare av mitokondrie komplex aktivitet tillsätts efter olika protokoll ^{3, 9.} Exempelvis i syfte att undersöka mitokondriella komplexa driven respirationshastigheter kan användas följande protokoll. Efter permeabilisering av cellerna, är första komplex I stimuleras av substraten malat och glutamat, som alstrar NADH som ett substrat för andningskedjan och provocera aktiveringen av komplex I. Efteråt ADP tillsättes för omvandling till ATP (tillstånd 3, aktiv komplex I-beroende andning). Efter en stabil signal uppnås, är rotenon (mitokondriell komplex jag hämmare) som administreras för att hämma komplexa I. Rotenon följs av succinat till _FADH2 och aktivera komplex II (tillstånd 3, aktivt komplex II-beroende andning). För att mäta komplexa IV beroende andning, första komplex III-beroende andning hämmas genom tillsats av antimycin A (mitokondriell komplex III-hämmare). Efteråt är komplex IV beroende andning stimuleras genom administrering askorbat och tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD kan auto-oxidera i respiration buffert, därför den maximala komplexa IV beroende respirationshastigheten (State 3) beräknas genom att subtrahera andningsfrekvens före och efter tillsatsen av natrium-azid, en inhibitor av mitokondriell komplex IV. De andnings experiment kan utföras i två kamrar en oxygraph i parallell en portion som en kontroll (ostimulerade celler), det andra innehåller de stimulerade cellerna. Uppenbarligen, kan cellerna förbehandlas på olika sätt, t.ex., med läkemedel som påverkar mitokondriella funktioner, innan deras syreförbrukning mäts i oxygraph kammaren. Detta protokoll möjliggör funktionell undersökning av de enskilda mitokondriella andningskedjan komplex. Dessutom kan man mäta maximal ADP-stimuleraderespiration (tillstånd 3) av permeabiliserade celler, med användning av exogen fettsyra i form av palmitat. I detta protokoll är koncentrerade bestånd av natriumpalmitat konjugerat med ultrafettsyrafritt bovinserumalbumin (BSA) (6: 1 molförhållande palmitat: BSA). Efteråt celler först är permeabiliserade med digitonin och mitokondrie andning bedöms genom tillsats av karnitin och palmitat följt av tillsats av ADP (tillstånd 3, maximal andning). Därefter oligomycin sätts för att efterlikna tillståndet 4 (stat 4o) och andningskontroll kvoten (RCR värde) beräknas som tillstånd 3 / tillstånd 4o. β-oxidation gynnar produktionen av acetyl-CoA (som kommer in i TCA-cykeln) och generering av _FADH2 och NADH, elektronerna av vilka överförs till elektrontransportkedjan genom elektronöverförande flavoprotein och β-hydroxiacyl-CoA-dehydrogenas. Mitokondrierna är i centrum för fettsyrametabolism och beskrivs palmitat-BSA protokoll kan användas av forskare undersöker fettty acid oxidation. I intakta celler, aktivatorer och inhibitorer av mitokondriekomplex aktivitet tillsätts efter ett annat protokoll ^{6, 9.} För dessa experiment är första syreförbrukning av icke-permeabiliserade celler i frånvaro av exogena substrat mäts (fosforylerande andningsfrekvens). Därefter är den icke-fosforylerande respirationshastigheten mäts efter tillsatsen av oligomycin, som är en inhibitor av mitokondriell ATP-syntas. Efteråt protonophore karbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) administreras vid olika koncentrationer och maximal mitokondriella okopplade andningsfrekvens mäts. Protonophores såsom FCCP kan inducera en ökning i proton permeabilitet det inre membranet, vilket möjliggör passiv rörelse av protoner för att skingra chemiosmotic lutning. En ökning av proton permeabilitet syftar till att skilja oxidativ respiration (ingen ATP-produktionen) och inducerar en ökning av oxygen konsumtion. Efteråt är rotenon och antimycin A tillsättes för att hämma mitokondrie respiration, och icke-mitokondriell andning subtraheras från alla andra andningsfrekvenser.

De syreförbrukning kan uttryckas som IO ₂ [pmol x sek ^-1 x 10 ^-6 celler] (syreflöde per miljon celler) som beräknas genom att dividera volymspecifik syreflödet (i den slutna syrekammaren), JV, O ₂ [pmol x sek ^-1 x ml ^-1] av cellkoncentrationen i cellkammaren (antalet celler per volym [10 ⁶ celler ∙ ml ^{1]) 15.} Cell-massa specifik syreflödet, JO ₂ [pmol x sek ^-1 x mg ^-1], är flödet per cell, IO ₂ [pmol x sek ^-1 x 10 ^-6 celler] dividerat med massa per cell [mg ∙ 10 ^6-celler]; eller volymspecifik flux, JV, O ₂ [pmol x sek ^-1 x ml ^-1] dividerat med massa per volymUME [mg ∙ ml ^1]. JO ₂ är syreflödet per cellprotein, torrvikt eller cellvolym.

I föreliggande studie med användning av högupplösande respiration, beskriver vi protokoll för att bestämma i) optimalt digitonin koncentration för fullständig cellulär plasmamembran permeabilisering (digitonin titrering analys), ii) mitokondriell yttermembranintegritet med användning av exogena cytokrom c, iii) mitokondriella andningskedjan komplex I , II och IV maximala andningsfrekvens i digitonin-permeabiliserade HepG2-celler i närvaro av exogen ADP och mitokondriella andningskedjan substrat, och iv) basal, kopplade och maximal okopplad andning (maximal elektron transportkapacitet) av intakta celler utan tillsats av exogena substrat och ADP, återger lungfunktion hos den integrerade cellen.

Protocol

1. Cellodling Kultur humana hepatom HepG2-celler 6 i 25 cm 2 cellodlingsflaskor i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) innehållande 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin vid 37 ° C i en inkubator (5% CO 2, 95% luft) (såddtäthet: 1 x 10 6 celler per 25 cm 2 cellodlingskolv, inkubationstid i 37 ° C inkubator: 48 h, celldensitet vid sammanflytning: 4-5 x 10 6 celler per 25 cm 2<…

Representative Results

Bestämningen av optimala Digitonin Koncentration för Cellular Permeabilization: Digitonin Titrering Experiment Digitonin titrering utförs för att bestämma den optimala koncentrationen för permeabilisering av HepG2-celler. För dessa experiment är digitonin titreras i intakta celler i närvaro av rotenon, succinat (mitokondriell komplex II substrat) och en mättande mängd av ADP (för att inducera komplex II-beroende tills…

Discussion

Syftet med detta protokoll var att använda hög upplösning respiration att mäta mitokondriella andningskedjan komplex "(I-IV) andningsfrekvens, maximal mitokondriella elektrontransportsystemet kapacitet och mitokondriell yttre membran integritet.

Det finns några viktiga steg i detta protokoll. Först är cellulära syreförbrukningshastigheter vanligtvis normaliserad till antalet celler (pmol / [sek x antal celler]). Därför innan övervaka cellulär syreförbrukning, är det vikti…

Materials

ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
FCCP	Sigma	C 2920	Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter	Thermo Fisher Scientific	n/a	Automated cell counting instrument
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical, dissolve in DMSO
DMEM	Gibco	31966021	Medium
EGTA	fluka	3779	Chemical
FBS	Gibco	26010-074	Medium component
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical
Trypsin	Sigma	T 4674	Chemical