Høy oppløsning respirometri å vurdere mitokondrienes funksjon i permeabilized og intakte celler

Summary

Høy oppløsning respirometri brukes til å bestemme mitokondrie oksygenforbruk. Dette er en enkel teknikk for å bestemme mitokondrielle luftkjedekomplekser '(I-IV) respiratoriske priser, maksimal mitokondrielle elektrontransportsystem kapasitet, og mitokondrielle ytre membranintegritet.

Abstract

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

Introduction

Mitokondrier oppfylle viktige roller i cellulær energi metabolisme, særlig ved hjelp av oksygen for å produsere adenosin trifosfat (ATP). De er innblandet i celledød og i en rekke menneskelige sykdommer. Mitokondriell oksidativ fosforylering (OXPHOS) kombinerer elektrontransport langs elektrontransportkjeden med oksygenforbruk og ATP syntese. Den mitokondrielle trikarboksylsyre (TCA) syklusen er involvert i omdannelsen av proteiner, karbohydrater og fett til energirike forbindelser som nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) og flavin-adenin-dinukleotid (fadh _2). Elektroner fra NADH og FADH ₂ blir deretter overført til de respiratoriske elektrontransportkjeden proteinkomplekser (I til IV) som er plassert i den indre mitokondrie-membran. I tillegg kan to andre redoks-reaksjonsveier overføre elektroner til elektrontransportkjeden: i) mitokondrielle elektronoverførende flavoprotein (etf) som er plassert på matrisen flate av den indre mitochondrial membran, og leverer elektroner fra fettsyre β-oksidasjon; og ii) mitokondrielle glycerofosfat-dehydrogenase, som oksyderer glycerofosfat til dihydroksyaceton fosfat og strømmer elektroner til den mitokondrielle elektrontransportkjeden. Kompleks IV (den endelige elektronakseptor) overfører elektroner til en oksygenmolekyl, omdannelse av oksygen til to molekyler vann. Flytting av elektroner fra luftelektrontransportkjeden kompleks I til IV er kombinert med proton strømning fra mitokondrie matrisen til den intermembrane plass som etablerer en elektrokjemisk gradient over mitokondrie indre membran. Etterpå mitokondrie kompleks V (ATP syntase) transporterer hydrogenioner tilbake inn i mitokondrie matrise og syntetiserer ATP molekyler. OXPHOS funksjon kan vurderes in vivo og in vitro ved hjelp av forskjellige teknikker og forskjellige mitokondrielle respirasjonssystemer tilstander kan oppnås. I isolerte mitokondrier følgende virkry tilstander kan måles: i) basal mitokondriell respirasjon (tilstand 1), ii) oksygenforbruk etter tilsetning av spesifikke substrater for de mitokondrielle respiratoriske kjede-komplekser (tilstand 2), iii) maksimalt mitokondrielle oksygenforbruk etter tilsetning av mettende konsentrasjoner av adenosindifosfat (ADP) (tilstand 3) og, iv) hviler åndedrett etter ADP forbruk (omdannet til ATP) (tilstand 4). I intakte celler følgende respiratoriske tilstander kan måles: i) basale cellulære oksygenforbruk i nærvær av endogene substrater og ADP, ii) basale cellulære oksygenforbruk i nærvær av oligomycin (oligomycin-insensitive respirasjon) og oligomycin-sensitive respirasjon (ATP omsetning), iii) FCCP ukoblet åndedrett, og iv) ikke-mitokondriell respirasjon etter tilsetningen av antimycin A og rotenon. I permeabiliserte celler, kan spesifikke substrater for elektrontransportkjeden komplekser og ADP tilsettes, og maksimale komplekse avhengige priser respiratoriske such så komplisert I-, II- og IV-avhengige luftveiene priser kan måles.

Målinger av cellulær respirasjon gi viktig innsikt i mitokondrieluftkapasitet spesifikke for komplekser I-IV, mitokondrie integritet og energi metabolisme ^{1, 2, 3.} En av de enhetene som gjør målinger av mitokondrienes oksygenforbruk med høy nøyaktighet, oppløsning og følsomhet er høy oppløsning oxygraph ^4. Den høyoppløselige oxygraph anordning inneholder to kamre med injeksjonsportene, og hvert kammer er utstyrt med en polarografisk oksygensensor. Cellular eller isolerte mitokondrie suspensjoner blir rørt kontinuerlig i respirometer. For å vurdere mitokondrienes funksjon, substrater og hemmere for mitokondrie kompleks aktivitet kan legges følgende standardprotokoller. Underlag og hemmere kan titreres ved injeksjon into kamrene i oxygraph og oksygen forbruk priser er beregnet ved hjelp av programvare og uttrykt som picomol per sekund per antall celler. Høy oppløsning respirometri tilbyr flere fordeler i forhold til tradisjonelle og konvensjonelle polarografisk oksygenelektrode enheter, inkludert økt følsomhet og evne til å arbeide med et lite antall av biologiske prøver slik som intakte eller permeabiliserte celler. I tillegg inneholder hver enhet to kamre, og luftveis priser kan registreres samtidig for sammenligninger av oksygenkonsentrasjon. Den høyoppløselige oxygraph har også fordelen av redusert lekkasje av oksygen fra enhetskamrene i forhold til tradisjonelle polarographic oksygen elektrodeanordningene. En annen innretning nylig utviklet for å måle cellulær oksygenforbruk er den 96-brønns ekstracellulære fluks analysator ^5. Det ekstracellulære fluks analysatoren er utstyrt med fluorescens i stedet for polarographic sensorer. Fordelene med den ekstracellulæreflux analysator sammenlignet med høy oppløsning oxygraph er i) det er en stor grad automatisert enhet, ii) det er mulig å måle oksygenforbruk i 24- og 96-brønners plater for high-throughput screening, derfor krever lavere mengder av biologiske prøver, og iii) ekstra måling av celle glycolytic forandring er mulig. Ulempene med den ekstracellulære flux analysatoren i forhold til den høyoppløselige oxygraph er i) de høye kostnadene ved enheten og forbruksvarer som for eksempel fluoriserende plater, som er ikke-gjenbrukbare, og ii) bare fire forbindelser per test / brønn er injiserbare derfor systemet ikke er mulig for substrat-uncoupler-inhibitor titrering protokoller.

I denne studien bruker vi høy oppløsning respirometri å bestemme mitokondrielle respirasjonen. For cellulære oksygen forbruk forsøk ble cellene permeabilisert for å tillate oppføring av eksogene ADP og oksyderbare mitokondrielle substrater for tilførsel av elektroner inn i complexes av luftveiene. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for disseksjon av individuelle mitokondrielle komplekser luftkapasitet, noe som er en klar fordel sammenlignet med intakte celler (mange substrater er celle-impermeant). Imidlertid vil cellemembranen permeabilization forstyrre barriere mellom cytosol og ekstracellulære rom og medium (vaske ut av cytosoliske oppløste stoffer) og sammensetningen av det intracellulære rommet er i likevekt med det ekstracellulære medium. En av ulempene ved permeabiliserte celler enn intakte celler, er at det mitokondrielle ytre membranen kan bli skadet hvis store mengder vaskemiddel anvendes under celle permeabiliseringen. I intakte celler, basal, koplet og frakoplet respirasjon av intakte celler kan måles. Denne metoden evaluerer oksygenforbruk på intakte celler uten tilsetning av eksogene substrater og ADP, og reproduserer lungefunksjon i den integrerte cellen og også gi informasjon om maksimale mitokondrielle elektron transport kapasitet ^{6, 7.} En av fordelene med intakte celler enn permeabiliserte celler er at cellemiljøet ikke blir forstyrret, og mitokondrier er i kontakt med hele komponenter av cellene. For å permeabilisere den cellulære plasmamembranen, er detergenter som digitonin blitt brukt ^åtte. Imidlertid kan mitokondrie ytre membranintegritet bli svekket hvis store mengder digitonin er ansatt. For å bekrefte at mitokondrienes ytre membran integritet ikke er svekket i permeabilized celler, er digitonin titrering utført for å bestemme den optimale konsentrasjonen for cellulær permeabilization. For disse eksperimentene ble cellene resuspendert i åndedrett medium og digitonin konsentrasjon titreres ved respirometri i nærvær av mitokondrielle substrater og ADP, og respirasjonsmålinger måles. Respirasjon av intakte, ikke-permeabiliserte celler som ikke er stimulert i nærvær av mitochondrial underlag og ADP. Imidlertid ville etterfølgende trinnvis digitonin-titrering ga gradvis permeabiliseringen av plasmamembraner, og optimal digitonin konsentrasjon oppnås. Dette er vist ved økningen av respirasjon opp til full permeabiliseringen. Mitokondrie kvalitet og ytre membran integritet kan bekreftes ved å legge eksogene cytokrom c ^{2, 9.} Cytokrom c er et 12 kDa elektron-bærer-proteinet i det mitokondrielle elektrontransportkjeden ^{10, 11, 12.} Det er lokalisert i den mitokondrielle intermembrane plass, og er involvert i oksygenforbruk, bærende elektroner fra komplekset III til IV kompleks. Når den mitokondrielle ytre membran er skadet, cytokrom c frigjøres, og mitokondrienes oksygenforbruket reduseres. Ved tilsetning av eksogen cytokrom c, noe forstørrelse i mitokondriell respirasjon er en indikasjon på enforstyrret mitokondrie ytre membran.

I permeabilized celler, substrater og hemmere av mitokondrie kompleks aktivitet legges følgende ulike protokoller ^{3, 9.} For eksempel for å undersøke mitokondrielle komplekse drevet luftveiene priser, kan den følgende protokoll benyttes. Etter permeabiliseringen av cellene, blir først kompleks I stimulert av substrater malat og glutamat, som genererer NADH som et substrat for den respiratoriske kjeden og fremkalle aktivering av komplekset I. Deretter blir ADP tilsettes for omdannelse til ATP (tilstand 3, aktive komplekset jeg avhengig åndedrett). Etter et stabilt signal er nådd, rotenon (mitokondrisk kompleks I-inhibitor) administrert for å hemme komplekse I. rotenon etterfølges av succinat til FADH ₂ og for å aktivere kompleks II (tilstand 3, aktive komplekse II-avhengig respirasjon). For å måle komplekse IV-avhengige åndedrett, første kompleks III-avhengig respirasjon inhiberes ved tilsetning av antimycin A (mitokondrisk kompleks III-hemmer). Etterpå er kompleks IV avhengig åndedrett stimulert ved å administrere askorbat og tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD kan auto-oksidere i åndedrett buffer, derfor den maksimale komplekse IV-avhengige pusterytme (tilstand 3) beregnes ved å subtrahere respirasjonsmålinger før og etter tilsetning av natriumazid, en inhibitor for mitokondriell kompleks IV. Åndedrett eksperimenter kan utføres i to kamre med en oxygraph i parallell-en tjener som en kontroll (ikke-stimulerte celler), den andre inneholdende de stimulerte celler. Selvfølgelig cellene kan forbehandles på forskjellige måter, for eksempel, med legemidler som påvirker mitokondrielle funksjoner, før deres oksygenforbruket måles i oxygraph kammeret. Denne protokollen tillater funksjonell undersøkelse av de individuelle mitokondrie respiratoriske kjede-komplekser. I tillegg kan man måle maksimal ADP-stimulerterespirasjon (tilstand 3) i permeabiliserte celler, ved hjelp av eksogene fettsyrer i form av palmitat. I denne protokollen, er konsentrert bestander av natrium-palmitat konjugert med ultra fettsyrefri bovint serumalbumin (BSA) (6: 1 molforhold palmitat: BSA). Etterpå ble cellene først blir permeabiliserte med digitonin og mitokondriell respirasjon bestemmes ved tilsetning av karnitin og palmitat, etterfulgt av tilsetning av ADP (tilstand 3, maksimal respirasjon). Deretter oligomycin lagt for å etterligne tilstand 4 (state 4o) og luftkontrollforholdet (RCR verdi) er beregnet som stat 3 / stat 4o. β-oksidasjon fremmer produksjon av acetyl CoA (som kommer inn i den TCA-syklus) og generering av FADH ₂ og NADH, elektronene som sendes til elektrontransportkjeden ved elektronoverførende flavoprotein og β-hydroksyacyl-CoA-dehydrogenase. Mitokondriene er i sentrum av fettsyremetabolisme og beskrevet palmitat-BSA-protokoll kan benyttes av forskere som undersøker fettty syre oksidering. I intakte celler, aktivatorer og inhibitorer av mitokondriell aktivitet komplekset tilsettes etter en annen protokoll ^{6, 9.} For disse forsøk, er første oksygenforbruk av ikke-permeabiliserte celler i fravær av eksogene substrater måles (fosforylerende pusterytme). Deretter, blir det ikke-fosforyleringsmiddel respirasjonsfrekvens målt etter tilsetning av oligomycin, som er en inhibitor av mitokondrial ATP-syntase. Etterpå er det protonophore karbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) administrert ved forskjellige konsentrasjoner og maksimal mitokondrie frikoblet respirasjonsfrekvens måles. Protonophores som FCCP kan indusere en styrking i proton permeabilitet av den indre membran, slik passiv bevegelse av protoner for å spre den chemiosmotic gradient. En økning i proton-permeabilitet frakobler oksydativ åndedrett (ingen ATP produksjon) og induserer en økning i oxygen forbruk. Etterpå blir rotenon og antimycin lagt til hemme mitokondrie respirasjon, og ikke-mitokondriell respirasjon er trukket fra alle andre luftveis priser.

Oksygenforbruk kan uttrykkes som IO ₂ [pmol x sek ^-1 x 10 ^-6 celler] (oksygen per million celler) som beregnes ved å dividere volumspesifikke oksygenfluks (i det lukkede kammer oksygen), JV, O ₂ [pmol x sek ^-1 x ml ^-1] av cellekonsentrasjonen i cellekammeret (antall celler pr volum [10 ⁶ celler ∙ ml ^{1]) 15.} Cell-mass spesifikk oksygen forandring, JO ₂ [pmol x sek ^-1 x mg ^-1], er flyten per celle, IO ₂ [pmol x sek ^-1 x 10 ^-6 celler], dividert med massen per celle [mg ∙ 10 ⁶ celler]; eller volumspesifikke flux, JV, O ₂ [pmol x sek ^-1 x ml ^-1], dividert med masse per volumUme [mg ∙ ml ^1]. JO ₂ er oksygenfluksen pr celle protein, tørrvekt eller cellevolum.

I denne studien ved hjelp av høy oppløsning respirometri beskriver vi protokoller for å bestemme i) optimal digitonin konsentrasjon for fullstendig mobil plasma membran permeabilization (digitonin titrering assay), ii) mitokondrielle ytre membran integritet ved hjelp av eksogene cytokrom c, iii) mitokondrie respiratoriske kjeden komplekser jeg , II og iV maksimal luftveiene priser i digitonin-permeabilisert HepG2-celler i nærvær av eksogent ADP og mitokondrielle respiratoriske kjeden substrater, og iv) basal, kombinert og maksimal frakobles respirasjon (maksimal elektrontransportkapasiteten) av intakte celler uten tilsetning av eksogene substrater og ADP, og reproduserer lungefunksjon i den integrerte cellen.

Protocol

1. Cell Culture Kultur humane hepatom HepG2 celler 6 i 25 cm2 cellekulturflasker i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en inkubator (5% CO 2, 95% luft) (seeding densitet: 1 x 10 6 celler per 25 cm2 cellekulturkolbe, inkubasjonstid på 37 ° C inkubator: 48 timer, celletettheten ved konfluens: 4-5 x 10 6 celler pr 25 cm <s…

Representative Results

Fastsettelse av Optimum Digitonin Konsentrasjon for Cellular Permeabilization: Digitonin Titrering Experiment Digitonin titrering utføres for å bestemme den optimale konsentrasjonen for permeabiliseringen av HepG2-celler. For disse eksperimentene er digitonin titreres i intakte celler i nærvær av rotenon, succinat (mitokondrisk kompleks II substrat) og en metnings mengde av ADP (for å indusere kompleks II-avhengige tilstand …

Discussion

Formålet med den foreliggende protokollen var å bruke høy oppløsning respirometri å måle mitokondrielle luftkjedekomplekser '(I-IV) respiratoriske priser, maksimal mitokondrienes elektrontransportsystemet kapasitet og mitokondrie ytre membran integritet.

Det er noen viktige skritt i denne protokoll. Først blir cellulær oksygenforbruk vanligvis normalisert til antall celler (pmol / [sec x antall celler]). Derfor, før overvåking av cellulær oksygenforbruk, er det viktig å bruke…

Materials

ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
FCCP	Sigma	C 2920	Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter	Thermo Fisher Scientific	n/a	Automated cell counting instrument
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical, dissolve in DMSO
DMEM	Gibco	31966021	Medium
EGTA	fluka	3779	Chemical
FBS	Gibco	26010-074	Medium component
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical
Trypsin	Sigma	T 4674	Chemical