We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.
Abstract
Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.
Introduction
식물은 다음 세대를 야기 종자를 생산한다. 씨앗은 후 germinative 성장을위한 오일, 탄수화물, 단백질, 같은 저장 매장량의 많은 양의 축적. 인간은 식품 및 동물 사료의 소스로 종자 저장 보유고를 활용, 따라서 식물 씨앗은 전 세계적으로 식용 유기 물질의 주요 공급 업체 중 하나입니다. 종자 생산량 증가는 식물 과학에서 중요한 도전이다.
종자 저장 매장량 식품 및 산업용 소재의 상업적 가치있는 소스이기 때문에, 이러한 매장량의 신진 대사의 규제를 기본 분자 메커니즘 널리 1-6 조사되었다. 또한 이러한 메커니즘을 해명하는 것은 작물 종자 수확량을 증가 도움이 될 것입니다. 씨앗은 수정 후 식물의 난소에서 개발, 그들은 발달 단계 1,6,7의 시리즈를 통해 성숙. 또한 분자 메커니즘 기본 종자 개발을 이해하는 상세한 필요씨앗, 현상하는 일련의 정확한 유전자 발현 프로파일을 생성한다. 그러나, 식물의 씨앗 오일, 단백질, 탄수화물, 폴리 페놀의 다량 어려운 유전자 발현의 정확한 프로파일을 배제 고순도 RNA를 분리 할 수 있습니다.
여기서는 오일, 단백질, 폴리 페놀을 다량 함유 종자로부터 RNA를 분리하기위한 효율적인 방법을 소개한다. 이 방법을 사용하여, 연구자는 고도로 정제 된 RNA를 제조 할 수있을 것이다. 이러한 RNA 개발 및 성숙 종자에서 종자 저장 매장량의 대사 조절을 제어하는 핵심 유전자의 전사 변화를 모니터링하는 데 유용 할 것입니다.
Protocol
식물 씨앗에서 총 RNA 1. 추출 버퍼 세트, 스핀 열, 1.5 및 2.0 mL의 폴리 프로필렌 튜브 및 뉴 클레아없는 1.5 ML의 폴리 프로필렌 튜브를 준비합니다. (V / W) (이하, PVP라고 함), 분자 생물학 등급의 폴리 비닐 피 롤리 돈을 적극적 RNA 추출 및 와류에 대한 용해 완충액 셀 1 % 추가. 완전히 용해시키기 위해 25 ℃에서 20 분 동안 인큐베이션. 20 분 배양 후, 기포의 형성을 방지하기 위해 거꾸로 …
Representative Results
우리는 먼저 애기 장대 성숙한 씨앗을 사용하여 PVP의 최적 농도를 조사 하였다. 총 RNA는 0 %, 0.25 %, 0.5 %, 1.0 % 또는 2.0 %의 PVP를 함유하는 세포 용해 완충액을 이용하여 전술 한 프로토콜에 따라 약 1,000 종자로부터 단리 하였다. 오일 층과 시드 파편 (도 1A)를 피하면서 균질화하고, 원심 분리 후 상청을 회수 하였다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p…
Discussion
유전자 발현 프로파일은 식물 생리에 대한 우리의 이해에 기여; 따라서, 특정 RNA 분리 방법은 각각의 샘플 조건 9-12 개발되었다. 우리는 씨앗에서 RNA 분리하는 동안 억제와 RNA는 실리카 막에 결합하는 것은 심각하게 저해 것을 발견 과정을 조사 하였다. 오일, 단백질, 폴리 페놀 다량의 RNA 분리를 억제한다. 우리는 RNA 실리카 막에 결합하는 과정 전에 분해 용액으로 이들 화합물을 제거하는…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기능 유전체학 시설과 분광법 및 Bioimaging 시설, NIBB 핵심 연구 시설 및 모델 식물 연구 시설, NIBB 생물 자원 센터의 직원을 감사드립니다.
Kanai, M., Mano, S., Nishimura, M. An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55008, doi:10.3791/55008 (2017).