Introduction
Pflanzen produzieren Samen, die Anlass zu der nächsten Generation geben. Samen akkumulieren große Mengen an Speicherreserven, wie Öle, Kohlenhydrate und Proteine, für die post-germinative Wachstum. Die Menschen nutzen Samenspeicherreserven als Quellen für Lebens- und Futtermittel und damit Pflanzensamen sind eine der wichtigsten Lieferanten von essbaren organischen Stoffen weltweit. Samenerträge zu erhöhen, ist eine wichtige Herausforderung in der Pflanzenwissenschaft.
Da Reserven Samenspeicher kommerziell wertvolle Quellen für Lebensmittel und Industriematerialien sind, wurden 1-6 umfassend untersucht die molekularen Mechanismen der Regulation des Stoffwechsels dieser Reserven zu Grunde liegen. Ferner werden diese Mechanismen, welche zur Erhöhung der Samenerträge in Kulturen nützlich sein. Samen entwickeln sich in Pflanzen Ovarien nach der Befruchtung, und sie reifen durch eine Reihe von Entwicklungsstufen 1,6,7. Weiterhin die Entwicklung zugrunde liegenden Samen molekularen Mechanismus zu verstehen, erfordert eine detaillierte, Präzise Genexpressionsprofile von einer Reihe Samen der Entwicklung erzeugt werden. Allerdings sind die hohen Mengen an Ölen, Proteinen, Kohlenhydraten und Polyphenolen in Pflanzensamen machen es schwierig, hochgereinigter RNA zu isolieren, die eine exakte Profilierung der Genexpression verhindert.
Hier stellen wir ein effizientes Verfahren zur RNA-Isolierung aus Ölsaaten, die große Mengen an Ölen, Proteinen und Polyphenolen. Mit dieser Methode können die Forscher hoch gereinigter RNA herzustellen. Solche RNA wird zur Überwachung von Transkriptions Änderungen in Schlüsselgenen Steuerung der Stoffwechselregulation von Samenspeicherreserven in der Entwicklung und reifen Ölsaaten nützlich sein.
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Protocol
1. Extraktion von Gesamt-RNA aus Pflanzensamen
- Bereiten Puffersätze, Spin-Säulen, 1,5 und 2,0 ml-Polypropylenröhrchen und Nuklease-freies 1,5 ml Polypropylenröhrchen.
- 1% (w / v) für die Molekularbiologie Polyvinylpyrrolidon (nachstehend bezeichnet als PVP) Lysepuffer für RNA-Extraktion und kräftig vortexen zu Zelle. Inkubieren für 20 min bei 25 ° C vollständig gelöst. Nach 20 min Inkubation wird durch Drehen des Rohrs den Kopf zu verhindern, die Bildung von Blasen des Puffers vorsichtig mischen. Lagerung bei Raumtemperatur (15-25 ° C) vor dem Gebrauch.
- Erntefrüchte aus Arabidopsis thaliana - Pflanzen und in 1,5 ml Polypropylen - Röhrchen auf Eis. Platz Früchte auf Aluminiumplatten gehalten bei 4 ° C und zu isolieren Samen aus den Früchten unter einem Stereomikroskop.
- Legen Sie die Samen isoliert (ca. 200 Samen) in 1,5 ml Polypropylen-Röhrchen, die in einem Aluminiumgestell auf Eis gelagert wurden und sofort legen Sie die Röhrchen in flüssigem nitrogen.
- Entfernen Sie die Schläuche aus dem flüssigen Stickstoff und bringt sie in die Aluminiumgestell auf dem Eis. Füge 100 & mgr; l des Puffers, enthaltend 1% PVP und zentrifugieren für 1 min bei 1.000 × g bei 4 ° C.
- Homogenisieren der Probe mit einem Edelstahl-Stößel einen Motor-Mühle für 60 s unter Verwendung während der Schlauch in der Aluminium-Rack auf Eis zu halten.
- In 550 & mgr; l des Puffers, der 1% PVP, mischen Sie den Puffer sanft durch das Rohr auf den Kopf, und Inkubation bei 25 ° C für 10 min.
- Zentrifuge für 5 min bei 8000 × g bei 25 ° C und die Übertragung 550 ul des Überstands in ein neues 1,5 ml-Polypropylenröhrchen.
- Zentrifuge für 5 min bei 10.000 × g bei 25 ° C und die Übertragung 450 ul des Überstands in ein neues 1,5 ml-Polypropylenröhrchen.
- Verwenden Sie den Überstand als Zelllysats zur RNA-Extraktion. Hiernach folgen Sie den Anweisungen in den Anweisungen des Herstellers im Handel erhältlichen Kits beschrieben.
- eluierenRNA mit einem Minimalvolumen des Elutionspuffers zur Überwachung der Expressionsmuster von niedrigem Pegel Transkripte eine ausreichend hohe Konzentration an RNA zu gewährleisten. Lagern Sie die RNA in einem Tiefkühlschrank bis zur Verwendung.
2. Überprüfung der RNA-Qualität
- durch leichtes Klopfen, und legen Sie den Schlauch in einem Aluminiumgestell auf Eis auftauen Gesamt-RNA, mischen.
- Messen Sie die RNA-Konzentration, A260 / A280-Verhältnis und A260 / A230-Verhältnis ein Mikrovolumen Spektralphotometer.
- Verdünne die Gesamt-RNA in RNase-freiem Wasser auf eine Endkonzentration von 70 ng / & mgr; l.
3. Reverse Transkription von Gesamt-RNA aus Samen
- Tauen Sie die Gesamt-RNA und Puffersätze aus dem im Handel erhältlichen Kits. Halten Sie die Enzyme aus dem Kit auf Eis, nachdem leichtes Klopfen. Bereiten Sie Nuklease-freies 0,2 ml Polypropylenröhrchen.
- Werden 5 & mgr; l Gesamt-RNA, 1 & mgr; l Oligo-dT-Primer (50 uM) und 1 uM Zufalls 6-mer (50 uM) zu dem 0,2 ml Polypropylene Röhrchen auf Eis.
- Inkubieren für 15 min bei 37 ° C und auf Eis.
- Hiernach folgen Sie den Anweisungen in den Anweisungen des Herstellers in die Reverse Transkription-PCR-Kit beschrieben.
- Legen Sie die reverse Transkription Produkte auf Eis vor dem Gebrauch.
4. Quantitative Real-time PCR-Analyse
- Konstrukt Plasmide, die die Ziel-Gensequenzen unter Verwendung von Protokoll des Herstellers beherbergt.
- Passen Sie die Konzentrationen an 100-500,000 Kopien / ul für die DNA-Vorlagen für die Standardkurven.
- Verdünnen der cDNA-Lösungen (1: 100) mit destilliertem Wasser.
- In 2 ul der verdünnten cDNA-Lösungen und die Plasmide für die Standardkurven an den Master-Mix aus der quantitativen real-time PCR-Kit.
- Set up PCR in Echtzeit die folgenden Zyklusbedingungen verwendet: 95 ° C für 30 s und dann 40 Zyklen bei 95 ° C für 5 s und 60 ° C für 35 s.
- Analysieren Sie die Kopienzahlen nach dem Mannsteller Anweisungen für den Echtzeit-PCR-System.
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Representative Results
Wir untersuchten zunächst die optimale Konzentration von PVP mit Arabidopsis reifen Samen. Gesamt-RNA wurde aus etwa 1000 Samen isoliert gemäß dem Protokoll oben unter Verwendung Zelllysepuffer beschrieben, die 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% bzw. 2,0% PVP. Nach Homogenisierung und Zentrifugation wurde der Überstand gesammelt , während die Ölschicht und Samen Debris (1A) zu vermeiden.
Abbildung 1: Bestimmung des optimalen Polyvinylpyrrolidon - Konzentration in der Puffer Zell - Lyse. Gesamt-RNA wurde mit dem Zell-Lyse-Puffer, der unterschiedliche Konzentrationen von PVP extrahiert. (A) eine Photographie der Samen nach der Homogenisierung und Zentrifugation. (B) Die Graphen der Wellenlängen Extinktion für jede Probe angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die Mengen und Reinheit der isolierten RNAs wurden aus der graphischen Darstellung der Wellenlänge Extinktion (1B) geschätzt, was zeigte , dass 1,0% PVP war die effektive Konzentration der Isolierung großer Mengen von gereinigtem RNA aus Samen.
Die Entwicklung Samen wurden aus Arabidopsis thaliana Früchten isoliert auf vorgekühlte Aluminiumplatten auf Eis unter einem Stereomikroskop (2A, 2B). Die Samen wurden mit einem Edelstahl Pistill und Motorschleifer in einem Rohr auf einem Aluminiumzahnstange auf Eis (2C, 2D) homogenisiert.
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Abbildung 2: Isolierung und Homogenisierung von Samen von Arabidopsis thaliana zu entwickeln. Die Entwicklung Samen werden aus Früchten auf einem kalten Aluminiumplatte unter einem Stereomikroskop (A) isoliert. Karpelle werden aus dem Stiel (B) abgezogen und sich entwickelnden Samen werden gesammelt. Die Samen werden in Lysepuffer , enthaltend 1% (w / v) Polyvinylpyrrolidon mit einem Edelstahl Stößel (C) in Röhrchen in einem Aluminiumgestell gekühlt auf Eis (D) homogenisiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Gesamt-RNA wurde bei 4, 8 aus dem Samen isoliert, und 12 Tage nach der Blüte (nachstehend als DAF) neu entwickelten Verfahren auszubringen oder die herkömmlichen Verfahren. Die Konzentrationen, A260 / A280-Verhältnisse, und A260 /A230 - Verhältnisse von RNA aus 200 Samen isoliert sind in Tabelle 1 gezeigt.
| Methode | DAF | RNA-Konzentration | A260 / A280 | A260 / A230 |
| konventionell | 4 | 72,4 ± 7,4 | 1.90 ± 0.02 | 2,27 ± 0,06 |
| 8 | 10,8 ± 3,0 | 1,50 ± 0,08 | 1,40 ± 0,17 | |
| 12 | 4,9 ± 1,7 | 1,57 ± 0,10 | 0,76 ± 0,18 | |
| Neu | 4 | 63,7 ± 2,6 | 2,10 ± 0,08 | 2.29 ± 0.03 |
| 8 | 46,3 ± 4,9 | 2,15 ± 0,05 | 2,23 ± 0,09 | |
| 12 | 41.77; 3.1 | 2,09 ± 0,04 | 2,17 ± 0,07 |
Tabelle 1: Konzentrationen, A260 / A280 - Verhältnisse, und A260 / A230 - Verhältnisse von RNA isoliert aus Arabidopsis Samen. Gesamt-RNA wurde aus etwa 200 Samen (190-206 Samen) bei 4, 8 und 12 DAF unter Verwendung des herkömmlichen Verfahrens oder neu entwickelten Verfahren isoliert. Die RNA-Konzentrationen, A260 / A280-Verhältnisse, und A260 / A230-Verhältnisse wurden gemessen. Die Werte stellen Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen Experimenten.
Die Ergebnisse zeigen, dass unsere Methode uns hoch gereinigter RNA aus 8 und 12 DAF Samen zu isolieren aktiviert. Die Gesamt-RNA wurde revers transkribiert, um cDNA, und die cDNA-Lösungen wurden 100-fach verdünnt. Die Kopienzahl von WRI1 (WRINKLED 1: AT3G54320), SDP1 (SUGAR DEPENDENT1: AT5G04040) 7 <sup />, und EIF3K (eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 3K: AT4G33250) als interne Kontrolle 8 wurden gemessen und die relativen Mengen der Transkripte wurden geschätzt durch quantitative Echtzeit - PCR - Analysen (Abbildung 3).
Abbildung 3: Die Quantifizierung von niedrigem Niveau Transkripten in sich entwickelnden Samen. Gesamt-RNA wurde aus 4, 8 und 12 DAF Samen unter Verwendung unserer Methode extrahiert und cDNA-Lösungen wurden vorbereitet. Die relativen Mengen an WRI1 (A) und SDP1 (B) Transkripte wurden durch quantitative Echtzeit - PCR gemessen. EIF3K wurde als interne Kontrolle verwendet. Die Werte stellen SD von drei unabhängigen Experimenten bedeuten. DAF; Tage nach der Blüte. Bitte klicken erwieder eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Obwohl die Mengen an Transkripten WRI1 und SDP1 relativ niedrig in sich entwickelnden Samen sind, war es möglich , die Expression Änderungen zwischen Samen in verschiedenen Entwicklungsstadien zu erkennen. Um sicherzustellen , dass unser Verfahren können auch in anderen Ölsaaten verwendet werden, wurde Gesamt - RNA aus reifen Samen von Brassica napus und Glycine max isoliert. Die RNA - Konzentrationen, A260 / A280 Verhältnisse und A260 / A230 - Verhältnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
| Methode | Pflanze | RNA-Konzentration | A260 / A280 | A260 / A230 |
| konventionell | B. napus | 7,7 ± 0,8 | 1,5 ± 0,12 | 0,75 ± 0,11 |
| G. max | 1,61 ± 0,06 | 0,69 ± 0,09 | ||
| Neu | B. napus | 143,2 ± 19,0 | 2.17 ± 0.03 | 2,23 ± 0,13 |
| G. max | 152,3 ± 4,4 | 2.17 ± 0.02 | 2.30 ± 0.02 |
Tabelle 2: Konzentrationen, A260 / A280 - Verhältnisse, und A260 / A230 - Verhältnisse von RNA , isoliert aus reifen Samen von Brassica napus und Glycine max. Gesamt - RNA wurde aus etwa 100 mg von Brassica napus und Glycine max Samen unter Verwendung des herkömmlichen Verfahrens oder neu entwickelten Verfahren isoliert. Die Samen wurden vorher zerkleinert und grob homogenisiert mit einem Mörser und Pistill in flüssigem Stickstoff gekühlt. Die RNA-Konzentrationen, A260 / A280 Verhältnisse und A260 / A230-Verhältnisse wurden gemessen. Die Werte stellen Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen Experimenten.
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Discussion
Genexpressionsprofile tragen zum Verständnis der Pflanzenphysiologie; Daher wurden spezifische RNA - Isolierungsverfahren wurden für jede Probe Bedingung 9-12 entwickelt. Wir untersuchten die Prozesse, die während der RNA-Isolierung aus Samen gehemmt wurden und festgestellt, dass RNA zu Silikamembranen Bindung war stark gehemmt. Große Mengen an Öl, Proteine und Polyphenole hemmen RNA-Isolierung. Wir modifiziert, um die RNA-Extraktionsverfahren dieser Verbindungen mit einer Lyse-Lösung vor dem Prozess der RNA-Bindung an Silikamembranen zu entfernen. Die wichtigen Modifikationen enthalten die Zugabe von 1% PVP (Schritt 1.2) und die Sammlung des zentrifugierten Überstand von Lyselösung (Schritte 1.7, 1.8). Das Ziel der Zugabe von 1% PVP ist Polyphenole zu entfernen. Wir untersuchten die effektivste Konzentration von PVP zu verwenden, und bestätigte, dass 1% PVP die wirksamste Konzentration für diesen Prozess ist. Das Ziel des Überstands aus zentrifugiert Lyselösung Sammelist zu Öl und Proteine zu entfernen. Der Überstand sollte sorgfältig gesammelt werden, um eine Ölschicht im Überstand und das Pellet in dem Rohr zu vermeiden, zurückzuhalten. Diese beiden einfachen Änderungen drastisch verbessert die Erholung, A260 / A280 Verhältnisse und A260 / A230 Verhältnis der isolierten RNA aus Samen an der mittleren und späten Phasen der Entwicklung (Tabelle 1).
Unser Verfahren, das eine einfache Modifikation des Standardprotokolls darstellt, verwendet im Handel erhältliche Kits für die RNA-Isolierung. Somit ist unsere Methode praktisch für ohne dass umständliche zusätzliche Schritte, wie Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation unter Verwendung von Lithiumchlorid hoch gereinigter RNA aus Samen isoliert. Unsere Methode ist auch für die Verwendung mit reifen Raps und Soja - Samen (Tabelle 2), was darauf hinweist , dass die Modifikationen funktionieren gut für öl- und eiweißreichen Samen Ernte. Die RNA - Rückgewinnungsraten von 4 DAF Samen (Tabelle 1) und junge Wurzels, Blätter und Stängel niedriger waren unsere Methode verwendet, was darauf hinweist, dass unsere Methode für die RNA-Isolierung aus Geweben ist nicht geeignet, die in Öl und Proteine sind schlecht. Daher ist das Verfahren vorteilhaft, nur für die Isolierung von RNA aus den Geweben, die Öl, Proteine und Polyphenole, wie Samen und Früchte.
Insgesamt ist unser Verfahren geeignet, ohne die Verwendung von Phenol, Chloroform oder zusätzliche Verfahren zur RNA-Reinigung hoch gereinigter RNA aus Pflanzensamen zu erwerben. Dieses Verfahren wird genauer Profilierung der Genexpression in Samen erleichtern.
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Acknowledgments
Wir danken dem Personal von Functional Genomics Facility-und Spektrografie und Bioimaging-Anlage, Nibb Kernforschungsanlagen und Modellpflanze Research Facility, Nibb Bioresource-Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
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