Introduction
Las plantas producen semillas, que dan lugar a la generación siguiente. Las semillas se acumulan grandes cantidades de reservas de almacenamiento, tales como aceites, hidratos de carbono y proteínas, para el crecimiento post-germinativa. Los seres humanos utilizan las reservas de almacenamiento de las semillas como fuentes de alimentación humana y animal, y por lo tanto las semillas de plantas son uno de los principales proveedores de materia orgánica comestible en todo el mundo. El aumento de los rendimientos de semilla es un reto importante en la ciencia de las plantas.
Dado que las reservas de almacenamiento de semillas son fuentes de valor comercial de alimentos y materiales industriales, los mecanismos moleculares que subyacen a la regulación del metabolismo de estas reservas han sido ampliamente investigados 1-6. al aclarar más estos mecanismos será útil para aumentar el rendimiento de semilla en los cultivos. Las semillas se desarrollan en los ovarios después de la fertilización de las plantas, y que maduran a través de una serie de etapas de desarrollo 1,6,7. entender aún más el desarrollo de semillas mecanismo molecular subyacente requiere detallada, Perfiles de expresión génica precisas de una serie de semillas en desarrollo a ser producidos. Sin embargo, las altas cantidades de aceites, proteínas, hidratos de carbono, y los polifenoles en semillas de plantas hacen que sea difícil aislar ARN altamente purificada, que se opone a los perfiles precisa de la expresión génica.
Aquí, se introduce un método eficiente para el aislamiento de ARN a partir de las semillas oleaginosas que contienen grandes cantidades de aceites, proteínas y polifenoles. Usando este método, los investigadores podrán preparar ARN altamente purificada. Dicho ARN será útil para el seguimiento de los cambios en la transcripción de genes clave que controlan la regulación del metabolismo de las reservas de almacenamiento de semillas oleaginosas en el desarrollo y maduros.
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Protocol
1. Extracción de ARN total de semillas de la planta
- Preparar conjuntos de tampones, columnas giratorias, 1.5 y 2.0 mL tubos de polipropileno, y tubos de polipropileno de 1,5 ml sin nucleasa.
- Añadir 1% (w / v) de polivinilpirrolidona de calidad para biología molecular (en lo sucesivo denominado PVP) a la celda tampón de lisis para la extracción de RNA y agitar vigorosamente. Incubar durante 20 min a 25 ° C para disolver completamente. Después de 20 min de incubación, mezclar el tampón suavemente girando el tubo boca abajo para evitar la formación de burbujas. Almacenar a temperatura ambiente (15-25 ° C) antes de su uso.
- La cosecha de frutas de las plantas de Arabidopsis thaliana y colocar en tubos de polipropileno de 1,5 ml en hielo. Coloque las frutas en placas de aluminio mantuvieron a 4 ° C y aíslan las semillas de los frutos bajo un microscopio estereoscópico.
- Coloque las semillas aisladas (aproximadamente 200 semillas) en 1,5 ml tubos de polipropileno que han sido almacenados en un bastidor de aluminio en hielo e inmediatamente colocar los tubos de líquido nitrogen.
- Retire los tubos del nitrógeno líquido y devolverlos a la rejilla de aluminio en el hielo. Añadir 100 ml de la solución tampón que contiene 1% de PVP y centrifugar durante 1 min a 1000 xg a 4 ° C.
- Homogeneizar la muestra con una mano de mortero de acero inoxidable usando un motor-amoladora durante 60 s mientras se mantiene el tubo en el bastidor de aluminio en hielo.
- Añadir 550 l de la solución tampón que contiene 1% de PVP, mezclar el tampón suavemente girando el tubo boca abajo, y se incuba durante 10 min a 25 ° C.
- Centrifugar durante 5 min a 8.000 xg, a 25 ° C y la transferencia de 550 l del sobrenadante a un nuevo tubo de polipropileno de 1,5 mL.
- Centrifugar durante 5 min a 10.000 xg, a 25 ° C y la transferencia de 450 l del sobrenadante a un nuevo tubo de polipropileno de 1,5 mL.
- Usar el sobrenadante como el lisado de células para la extracción de RNA. De aquí en adelante, siga el procedimiento descrito en las instrucciones del fabricante en el kit disponible en el mercado.
- eluir elARN usando un volumen mínimo de tampón de elución para garantizar una concentración suficientemente alta de ARN para el seguimiento de los patrones de expresión de las transcripciones de bajo nivel. Almacenar el ARN en un congelador hasta su uso.
2. Verificación de RNA de calidad
- Descongelar el ARN total, se mezcla con unos golpecitos suaves, y colocar el tubo en un bastidor de aluminio en el hielo.
- Medir la concentración de ARN, la relación A260 / A280, y la relación A260 / A230 usando un espectrofotómetro microvolumen.
- Diluir el ARN total en agua libre de RNasa hasta una concentración final de 70 ng / mL.
3. transcripción inversa del ARN total a partir de semillas
- Descongelar los conjuntos totales de ARN y de amortiguamiento de referencia del fabricante. Mantenga las enzimas del kit en hielo después de golpecitos suaves. Preparar tubos de 0,2 ml de polipropileno libre de nucleasa.
- Añadir 5 l de ARN total, 1 l de cebador oligo dT (50 mM), y 1 mM de Random 6-mer (50 M) al 0,2 mL proliprolenolene tubo en hielo.
- Incubar durante 15 minutos a 37 ° C y colocar en hielo.
- De aquí en adelante, siga el procedimiento descrito en las instrucciones del fabricante en el kit de PCR con transcripción inversa.
- Coloque los productos de transcripción inversa en el hielo antes de su uso.
4. Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real
- La construcción de plásmidos que albergan las secuencias de genes diana utilizando el protocolo del fabricante.
- Ajustar las concentraciones de 100-500,000 copias / l para las plantillas de ADN para las curvas de calibración.
- Diluir las soluciones de ADNc (1: 100) con agua destilada.
- Añadir 2 l de las soluciones diluidas de ADNc y los plásmidos para las curvas estándar a la mezcla maestra en el kit de PCR cuantitativa en tiempo real.
- Configurar-PCR en tiempo real utilizando las siguientes condiciones de ciclos: 95ºC durante 30 s y luego 40 ciclos a 95 ° C durante 5 s y 60ºC durante 35 s.
- Analizar el número de copias de acuerdo con el hombreinstrucciones del ufacturer para el sistema de PCR en tiempo real.
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Representative Results
En primer lugar, se investigó la concentración óptima de PVP usando Arabidopsis semillas maduras. ARN total fue aislado de aproximadamente 1000 semillas de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente, utilizando tampón de lisis celular que contiene 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% o 2,0% de PVP. Después de la homogeneización y centrifugación, se recogió el sobrenadante evitando al mismo tiempo la capa de aceite y los residuos de la semilla (Figura 1A).
Figura 1: Estimación de la concentración óptima de polivinilpirrolidona en el tampón de lisis celular. El ARN total se extrajo con el tampón de lisis celular que contiene diferentes concentraciones de PVP. (A) Una fotografía de las semillas después de la homogeneización y centrifugación. (B) Las gráficas de absorbancia de longitud de onda para cada muestra se indican. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las cantidades y la pureza del ARN aislado se estimaron a partir de la gráfica de absorbancia de longitud de onda (Figura 1B), que mostró que 1,0% de PVP fue la concentración más eficaz de aislamiento de grandes cantidades de ARN purificado a partir de semillas.
Semillas en desarrollo se aislaron a partir de frutos de Arabidopsis thaliana en placas de aluminio pre-enfriado en hielo bajo una (2A figuras, 2B) estereoscópicos. Las semillas se homogeneizaron con una mano de mortero de acero inoxidable y un motor-molino en un tubo sobre un bastidor de aluminio en hielo (Figuras 2C, 2D).
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Figura 2: El aislamiento y la homogeneización de las semillas en desarrollo de Arabidopsis thaliana. Semillas en desarrollo están aislados de frutas en una placa de aluminio en frío bajo un estereomicroscopio (A). Carpelos se pelan de pedículo (B), y se recogen las semillas en desarrollo. Las semillas se homogeneizaron en tampón de lisis que contiene 1% (w / v) de polivinilpirrolidona usando una mano de mortero de acero inoxidable (C) en tubos en un bastidor de aluminio enfriado en hielo (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
ARN total fue aislado de las semillas a las 4, 8, y 12 días después de la floración (en lo sucesivo, DAF), utilizando nuestro método de nuevo desarrollo o el método convencional. Las concentraciones, proporciones A260 / A280, A260 y /Ratios de A230 de ARN aislado a partir de 200 semillas se muestran en la Tabla 1.
| Método | DAF | concentración de ARN | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Convencional | 4 | 72,4 ± 7,4 | 1.90 ± 0.02 | 2,27 ± 0,06 |
| 8 | 10,8 ± 3,0 | 1,50 ± 0,08 | 1,40 ± 0,17 | |
| 12 | 4,9 ± 1,7 | 1,57 ± 0,10 | 0,76 ± 0,18 | |
| Nuevo | 4 | 63,7 ± 2,6 | 2.10 ± 0.08 | 2.29 ± 0.03 |
| 8 | 46,3 ± 4,9 | 2,15 ± 0,05 | 2,23 ± 0,09 | |
| 12 | 41.77; 3.1 | 2,09 ± 0,04 | 2.17 ± 0.07 |
Tabla 1: Concentraciones, ratios de A260 / A280, y A260 / A230 proporciones de ARN aislado de semillas de Arabidopsis. ARN total fue aislado de aproximadamente 200 semillas (de 190 a 206 semillas) a las 4, 8, y 12 DAF utilizando el método convencional o nuestro método recientemente desarrollado. Se midieron las concentraciones de ARN, relaciones A260 / A280 y relaciones A260 / A230. Los valores representan la media ± SD de tres experimentos independientes.
Los resultados muestran que nuestro método nos permitió aislar el ARN altamente purificada a partir de 8 y 12 semillas DAF. El ARN total fue inverso-transcrito a cDNA, y las soluciones de ADNc se diluyeron 100 veces. El número de copias de WRI1 (1: arrugada AT3G54320), SDP1 (azúcar DEPENDENT1: AT5G04040) 7 </ sup>, y eIF3k (traducción eucariótica factor de iniciación 3K: AT4G33250) como control interno 8 se midieron, y las cantidades relativas de las transcripciones fueron estimados por cuantitativa en tiempo real los análisis de PCR (Figura 3).
Figura 3: Cuantificación de transcripciones de bajo nivel en las semillas en desarrollo. ARN total fue extraído a partir de 4, 8, y 12 semillas DAF con nuestro método, y se prepararon soluciones de ADNc. Las cantidades relativas de WRI1 (A) y SDP1 transcripciones (B) se midieron por cuantitativa en tiempo real PCR. EIF3k se utilizó como control interno. Los valores representan la media ± DE de tres experimentos independientes. DAF; días después de la floración. Por favor, haga clic en élvolver a ver una versión más grande de esta figura.
Aunque las cantidades de WRI1 y SDP1 transcripciones son relativamente bajos en semillas en desarrollo, era posible detectar los cambios de expresión entre semillas en diferentes etapas de desarrollo. Para verificar que nuestro método se puede utilizar en otras semillas oleaginosas, el ARN total fue aislado de las semillas maduras de Brassica napus y Glycine max. Las concentraciones de ARN, relaciones A260 / A280 y relaciones A260 / A230 se muestran en la Tabla 2.
| Método | Planta | concentración de ARN | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Convencional | B. napus | 7,7 ± 0,8 | 1,5 ± 0,12 | 0,75 ± 0,11 |
| G. max | 1,61 ± 0,06 | 0,69 ± 0,09 | ||
| Nuevo | B. napus | 143,2 ± 19,0 | 2.17 ± 0.03 | 2.23 ± 0.13 |
| G. max | 152,3 ± 4,4 | 2.17 ± 0.02 | 2,30 ± 0,02 |
Tabla 2: Concentraciones, ratios de A260 / A280, y A260 / A230 proporciones de ARN aislado de semillas maduras de Brassica napus y Glycine max. ARN total fue aislado de aproximadamente 100 mg de Brassica napus y glicina semillas max utilizando el método convencional o nuestro método recientemente desarrollado. Las semillas fueron previamente triturados y más o menos se homogeneizó con un mortero enfriado en nitrógeno líquido. Las concentraciones de ARN, A260 / ASe midieron 280 las proporciones, y relaciones A260 / A230. Los valores representan la media ± SD de tres experimentos independientes.
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Discussion
los perfiles de expresión de genes contribuyen a nuestra comprensión de la fisiología de las plantas; Por lo tanto, los métodos de aislamiento de ARN específico se han desarrollado para cada condición de muestra 9-12. Se investigaron los procesos que se inhibe durante el aislamiento de ARN a partir de semillas y se ha encontrado que el ARN a membranas de sílice fue gravemente inhibida. Grandes cantidades de petróleo, proteínas y polifenoles inhiben el aislamiento de ARN. Hemos modificado el proceso de extracción de ARN para eliminar estos compuestos con una solución de lisis antes de que el proceso de ARN a membranas de sílice. Las modificaciones importantes incluyen la adición de 1% de PVP (paso 1.2) y la colección de sobrenadante de la solución de lisis se centrifugaron (pasos 1.7, 1.8). El objetivo de la adición de 1% de PVP es eliminar los polifenoles. Se examinó la concentración más eficaz de PVP de usar y confirmó que 1% de PVP es la concentración más eficaz para este proceso. El objetivo de recoger el sobrenadante de la solución de lisis se centrifugóes para eliminar el aceite y proteínas. El sobrenadante se debe recoger con cuidado para evitar el mantenimiento de una capa de aceite en el sobrenadante y el pellet en el tubo. Estas dos modificaciones simples mejoraron drásticamente la recuperación, las proporciones A260 / A280 y proporciones A260 / A230 del ARN aislado a partir de semillas en el medio y las fases finales de desarrollo (Tabla 1).
Nuestro método, lo que representa una simple modificación del protocolo estándar, utiliza kits disponibles en el mercado para el aislamiento de ARN. Por lo tanto, nuestro método es práctico para el aislamiento de ARN altamente purificada a partir de semillas sin la necesidad de etapas adicionales engorrosos tales como extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol utilizando cloruro de litio. Nuestro método también es eficaz para su uso con colza madura y semillas de soja (Tabla 2), indicando que las modificaciones funcionan bien para semillas de cultivos de petróleo y ricos en proteínas. Las tasas de recuperación de ARN a partir de 4 semillas DAF (Tabla 1) y raíz jovens, hojas y tallos fueron más bajos usando nuestro método, lo que indica que nuestro método no es adecuado para el aislamiento de ARN a partir de tejidos que son pobres en aceite y proteínas. Por lo tanto, el método es ventajoso sólo para el aislamiento de ARN de tejidos que contiene aceite, proteínas y polifenoles, tales como semillas y frutos.
En general, nuestro método es adecuado para la adquisición de ARN altamente purificada a partir de semillas de plantas sin el uso de fenol, cloroformo, o procesos adicionales para la purificación de ARN. Este método facilitará perfiles más precisa de la expresión génica en semillas.
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Acknowledgments
Agradecemos al personal de la genómica funcional y Facility Fondo para espectrografía y Bioimagen, Nibb instalaciones centrales de la investigación y en un Centro de Investigación de Plantas Modelo, Nibb bio-Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
