Introduction
As plantas produzem sementes, que dão origem à próxima geração. Sementes acumular grandes quantidades de reservas de armazenagem, tais como óleos, hidratos de carbono e proteínas, para o crescimento pós-germinativo. Os seres humanos utilizar as reservas de armazenamento de sementes como fontes de alimentos e ração animal, e, portanto, sementes de plantas são um dos principais fornecedores de matéria orgânica comestível em todo o mundo. Aumentar a produção de sementes é um desafio importante na ciência das plantas.
Desde reservas de conservação das sementes são fontes de valor comercial de alimentos e materiais industriais, os mecanismos moleculares subjacentes à regulação do metabolismo destas reservas têm sido amplamente investigadas 1-6. Além disso elucidação desses mecanismos será útil para aumentar a produção de sementes de culturas. Sementes se desenvolvem nos ovários de plantas após a fertilização, e eles amadurecem através de uma série de estágios de desenvolvimento 1,6,7. Para compreender melhor o desenvolvimento mecanismo molecular subjacente de sementes requer detalhada, Perfis de expressão de gene precisas de uma série de desenvolvimento de sementes a ser produzido. No entanto, as elevadas quantidades de óleos, proteínas, hidratos de carbono, e polifenóis em sementes de plantas tornar-se difícil de isolar ARN altamente purificada, o que se opõe perfil preciso da expressão do gene.
Aqui, nós apresentamos um método eficiente para o isolamento de ARN a partir de sementes oleaginosas que contenham grandes quantidades de óleos, proteínas e polifenóis. Usando este método, os pesquisadores serão capazes de preparar RNA altamente purificada. Tal RNA será útil para monitorar mudanças de transcrição dos genes-chave que controlam a regulação metabólica das reservas de armazenagem de sementes no desenvolvimento e oleaginosas maduras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Extracção do ARN total de sementes de plantas
- Prepare conjuntos de buffer, colunas de spin, 1,5 e 2,0 tubos de polipropileno ml, e tubos de 1,5 mL de polipropileno livre de nuclease.
- Adicionar 1% (w / v) de polivinilpirrolidona de grau de biologia molecular (daqui em diante referida como PVP) para a célula de tampão de lise para extracção de ARN e vortex vigorosamente. Incubar durante 20 min a 25 ° C para dissolver completamente. Após 20 min de incubação, misturam suavemente o tampão, rodando o tubo de cabeça para baixo para evitar a formação de bolhas. Armazenar à temperatura ambiente (15-25 ° C) antes do uso.
- Frutos da colheita de plantas de Arabidopsis thaliana e coloque em 1,5 tubos de polipropileno ml em gelo. Coloque frutas em placas de alumínio mantida a 4 ° C e isolar a partir de sementes de frutos sob um microscópio estéreo.
- Coloque as sementes isoladas (aproximadamente 200 sementes) em tubos de polipropileno de 1,5 ml, que foram armazenados num bastidor de alumínio em gelo e imediatamente colocar os tubos em N líquidoitrogen.
- Retire os tubos do azoto líquido e devolvê-las para a cremalheira de alumínio em gelo. Adicionar 100 ul da solução tampão contendo 1% de PVP e centrifugar durante 1 min a 1000 xg, a 4 ° C.
- Homogeneizar a amostra com um pilão de aço inoxidável usando um motor-moedor durante 60 s ao mesmo tempo manter o tubo no suporte de alumínio em gelo.
- Adicionar 550 ul da solução tampão contendo 1% de PVP, misturar suavemente o tampão, rodando o tubo de cabeça para baixo, e incubar durante 10 min a 25 ° C.
- Centrifugar durante 5 minutos a 8000 xg a 25 ° C e transferência de 550 uL do sobrenadante para um novo tubo de polipropileno de 1,5 mL.
- Centrifugar durante 5 min a 10.000 xg, a 25 ° C e transferência de 450 uL do sobrenadante para um novo tubo de polipropileno de 1,5 mL.
- Utilizar o sobrenadante como o lisado de células para extracção de ARN. Daqui por diante, seguir o processo descrito nas instruções do fabricante no kit disponível comercialmente.
- Elui-se oRNA usando um volume mínimo de tampão de eluição para assegurar uma concentração suficientemente elevada de ARN para monitorizar os padrões de transcritos de baixo nível de expressão. Armazenar o ARN num congelador, até ser utilizado.
2. A verificação da RNA Qualidade
- Descongelar o RNA total, misture agitando ligeiramente, e colocar o tubo em um rack de alumínio no gelo.
- Medir a concentração de ARN, razão A260 / A280 e razão A260 / A230 usando um espectrofotómetro microvolume.
- Dilui-se o ARN total em água isenta de ARNase para uma concentração final de 70 ng / mL.
3. transcrição reversa do ARN total a partir de sementes
- Descongelar o RNA total e tampão conjuntos do kit comercial. Mantenha as enzimas do kit no gelo depois de toque suave. Prepare tubos de 0,2 mL de polipropileno livre de nuclease.
- Adicionar 5 uL de ARN total, 1 ul de iniciador oligo dT (50 uM), e 1 uM de 6-meros aleatórios (50 uM) ao polypropy 0,2 mltubo de lene no gelo.
- Incubar durante 15 min a 37 ° C e colocar em gelo.
- Daqui por diante, seguir o processo descrito nas instruções do fabricante no kit de transcrição reversa-PCR.
- Coloque os produtos de transcrição reversa em gelo antes do uso.
4. Análise Quantitativa-PCR em tempo real
- Construção de plasmídeos que albergam as sequências de genes alvo utilizando o protocolo do fabricante.
- Ajustar as concentrações de 100-500,000 cópias / mL para moldes de ADN para as curvas padrão.
- Dilui-se as soluções de cDNA (1: 100) com água destilada.
- Adicionar 2 mL das soluções diluídas de ADNc e os plasmídeos para as curvas padrão para a mistura principal a partir do kit em tempo real quantitativa de PCR.
- Definir-se-PCR em tempo real usando as seguintes condições de ciclo: 95 ° C durante 30 s e depois 40 ciclos a 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 35 s.
- Analisar os números de cópias de acordo com o homeminstruções do ufacturer para o sistema de PCR em tempo real.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Em primeiro lugar, investigou a melhor concentração de PVP usando Arabidopsis sementes maduras. O ARN total foi isolado a partir de cerca de 1000 sementes de acordo com o protocolo descrito acima, utilizando tampão de lise celular contendo 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% ou 2,0% de PVP. Após homogeneização e centrifugação, o sobrenadante foi recolhido, evitando a camada de óleo e detritos de sementes (Figura 1A).
Figura 1: Estimativa da concentração óptima de polivinilpirrolidona em tampão de lise celular. O ARN total foi extraído com tampão de lise de células contendo diferentes concentrações de PVP. (A) Uma fotografia das sementes após a homogeneização e centrifugação. (B) Os gráficos de absorvância de comprimento de onda para cada uma das amostras estão indicadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As quantidades e pureza dos ARN isolados foram estimados a partir do gráfico de absorvância de comprimento de onda (Figura 1B), o que mostrou que 1,0% de PVP foi a concentração mais eficaz de isolar grandes quantidades de ARN purificado a partir de sementes.
Sementes em desenvolvimento foram isolados a partir de frutos de Arabidopsis thaliana em placas de alumínio pré-arrefecida em gelo sob uma (2A Figuras, 2B) estereomicroscópio. As sementes foram homogeneizados com um pilão de aço inoxidável e do motor-moedor num tubo sobre um bastidor de alumínio em gelo (Figuras 2C, 2D).
2.jpg "/>
Figura 2: Isolamento e homogeneização de sementes em desenvolvimento de Arabidopsis thaliana. Sementes em desenvolvimento são isolados a partir de frutos em uma placa de alumínio frio sob um estereomicroscópio (A). Carpelos são descascadas de pedículo (B), e as sementes em desenvolvimento são recolhidas. As sementes são homogeneizados em tampão de lise contendo 1% (w / v) de polivinilpirrolidona utilizando um pilão de aço inoxidável (C) em tubos de uma cremalheira de alumínio arrefecidas em gelo (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O ARN total foi isolado a partir das sementes em 4, 8, e 12 dias após a floração (daqui em diante referido como DAF), usando o nosso método recentemente desenvolvido ou o método convencional. As concentrações, proporções A260 / A280 e A260 /A230 rácios de ARN isolado a partir de 200 sementes são mostrados na Tabela 1.
| Método | DAF | A concentração de RNA | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Convencional | 4 | 72,4 ± 7,4 | 1,90 ± 0,02 | 2,27 ± 0,06 |
| 8 | 10,8 ± 3,0 | 1,50 ± 0,08 | 1,40 ± 0,17 | |
| 12 | 4,9 ± 1,7 | 1,57 ± 0,10 | 0,76 ± 0,18 | |
| Novo | 4 | 63,7 ± 2,6 | 2,10 ± 0,08 | 2,29 ± 0,03 |
| 8 | 46,3 ± 4,9 | 2,15 ± 0,05 | 2,23 ± 0,09 | |
| 12 | 41,77; 3.1 | 2,09 ± 0,04 | 2,17 ± 0,07 |
Tabela 1: Concentrações, as razões A260 / A280 e A260 / A230 proporções de RNA isolado a partir de sementes de Arabidopsis. O ARN total foi isolado a partir de cerca de 200 sementes (de 190 para 206 sementes) em 4, 8, e 12 DAF usando o método convencional ou o nosso método recentemente desenvolvido. As concentrações de RNA, razões A260 / A280 e razões A260 / A230 foram medidos. Os valores representam a média ± SD de três experiências independentes.
Os resultados mostram que o nosso método permitiu isolar ARN altamente purificada a partir de 8 e 12 sementes DAF. O ARN total foi transcrito reverso-em ADNc, e as soluções de cDNA foram diluídos 100 vezes. Os números de cópias de WRI1 (enrugada 1: AT3G54320), SDP1 (açúcar DEPENDENT1: AT5G04040) 7 </ sup>, e EIF3K (tradução eucariótica fator de iniciação 3K: AT4G33250) como um controlo interno 8 foram medidos, e as quantidades relativas dos transcritos foram estimados por quantitativo em tempo real análises de PCR (Figura 3).
Figura 3: A quantificação de transcritos de nível baixo em sementes em desenvolvimento. O ARN total foi extraído a partir de 4, 8, e 12 sementes DAF utilizando o nosso método, e soluções de ADNc foram preparados. As quantidades relativas de WRI1 (A) e (B SDP1 transcrições) foram medidos por quantitativa PCR em tempo real. EIF3K foi usada como um controlo interno. Os valores representam DP de três experiências independentes dizer. DAF; dias após a floração. Por favor, clique elere para ver uma versão maior desta figura.
Embora as quantidades de WRI1 e SDP1 transcrições são relativamente baixo em sementes em desenvolvimento, foi possível detectar as mudanças de expressão entre as sementes em diferentes fases de desenvolvimento. Para verificar que o nosso método pode ser utilizado em outras sementes oleaginosas, o ARN total foi isolado a partir de sementes maduras de Brassica napus e Glycine max. As concentrações de RNA, razões A260 / A280 e razões A260 / A230 são mostrados na Tabela 2.
| Método | Plantar | A concentração de RNA | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Convencional | B. napus | 7,7 ± 0,8 | 1,5 ± 0,12 | 0,75 ± 0,11 |
| G. max | 1,61 ± 0,06 | 0,69 ± 0,09 | ||
| Novo | B. napus | 143,2 ± 19,0 | 2,17 ± 0,03 | 2,23 ± 0,13 |
| G. max | 152,3 ± 4,4 | 2,17 ± 0,02 | 2,30 ± 0,02 |
Tabela 2: Concentrações, as razões A260 / A280 e A260 / A230 proporções de RNA isolado a partir de sementes maduras de Brassica napus e Glycine max. O ARN total foi isolado a partir de aproximadamente 100 mg de Brassica napus e sementes de Glycine max, utilizando o método convencional ou o nosso método recentemente desenvolvido. As sementes foram previamente esmagadas e aproximadamente homogeneizada com um almofariz e um pilão arrefecido com azoto líquido. As concentrações de RNA, A260 / A280 razões, e razões A260 / A230 foram medidos. Os valores representam a média ± SD de três experiências independentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
perfis de expressão gênica contribuir para a nossa compreensão da fisiologia da planta; Assim, os métodos de isolamento de ARN específico foram desenvolvidas de cada amostra condição 9-12. Foram investigados os processos que foram inibidas durante o isolamento de ARN a partir de sementes e descobriram que o RNA se ligar a membranas de sílica foi severamente inibido. Grandes quantidades de óleo, proteínas e polifenóis inibem isolamento do RNA. Nós modificámos o processo de extracção de ARN para remover estes compostos com uma solução de lise antes do processo de ligação de ARN para membranas de sílica. As modificações importantes incluíram a adição de 1% de PVP (passo 1.2) e a recolha do sobrenadante a partir da solução de lise centrifugada (passos 1.7, 1.8). O objectivo da adição de 1% de PVP é remover polifenóis. Foi examinada a concentração mais eficaz de PVP de usar e confirmou que 1% de PVP é a concentração mais eficaz para este processo. O objectivo de recolher o sobrenadante a partir de solução de lise centrifugadaé para remover o óleo e proteínas. O sobrenadante recolhido deve ser cuidadosamente para evitar a retenção de uma camada de óleo no sobrenadante e o sedimento no tubo. Estas duas modificações simples melhorou drasticamente a recuperação, as proporções A260 / A280 e razões A260 / A230 da ARN isolado a partir de sementes no meio e final de desenvolvimento (Tabela 1).
O nosso método, o que representa uma simples modificação do protocolo padrão, utiliza kits disponíveis comercialmente para a isolamento do RNA. Assim, o nosso método é prático para o isolamento de ARN altamente purificada a partir de sementes, sem a necessidade de passos adicionais morosos como a extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol usando cloreto de lítio. O nosso método é também eficaz para utilização com sementes de colza e sementes de soja maduros (Tabela 2), indicando que as modificações funcionam bem para sementes de culturas de petróleo e rica em proteínas. As taxas de recuperação de ARN a partir de 4 sementes DAF (Tabela 1) e raiz de jovems, folhas e caules foram menores utilizando o nosso método, indicando que o nosso método não é adequado para o isolamento de ARN a partir de tecidos que são pobres em proteínas e óleo. Portanto, o método só é vantajoso para o isolamento de ARN a partir dos tecidos que contêm óleo, proteínas e polifenóis, tais como sementes e frutos.
Em geral, o nosso método é adequado para a aquisição de ARN altamente purificada a partir de sementes de plantas sem o uso de fenol, clorofórmio, ou processos adicionais para a purificação de ARN. Este método irá facilitar perfil mais preciso de expressão de genes em sementes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Agradecemos à equipe de Genômica Funcional Facility e Espectrografia e BioImaging Facility, Nibb Núcleo Instalações de pesquisa, e para o modelo de pesquisa de plantas, Nibb Bioresource Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
