Introduction
植物は、次の世代を生じる種子を生産します。種子は、ポスト発芽成長のために、そのような油、炭水化物、およびタンパク質などの貯蔵物質、大量に蓄積します。人間は食品や動物飼料の供給源として種子貯蔵準備金を活用し、ひいては植物の種子は、世界的に食用有機物の主要なサプライヤの一つです。種子の収量を増加させると、植物科学における重要な課題です。
種子貯蔵物質が食品や工業材料の商業的に価値のある情報源であるため、これらの引当金の代謝の調節の根底にある分子メカニズムは、広く1-6を検討されています。さらに、これらのメカニズムを解明することは、作物種子収量を増加させるために有用であろう。種子は受精後植物卵巣で開発し、それらは発達段階1,6,7の一連の成熟します。さらに分子機構根底にある種子の開発を理解することは、詳細が必要です種子を開発する一連の正確な遺伝子発現プロファイルが生成されます。しかし、油、タンパク質、炭水化物、および植物種子中のポリフェノールの高い量は、それが困難な遺伝子発現の正確なプロファイリングを排除する高度に精製されたRNAを単離することを可能にします。
ここでは、油、タンパク質、およびポリフェノールを多く含む油糧種子からのRNAの単離のための効率的な方法を紹介します。この方法を使用して、研究者らは、高度に精製されたRNAを調製することができるであろう。このようなRNAは、開発および成熟脂肪種子における種子貯蔵物質の代謝調節を制御する重要な遺伝子で転写変化をモニタリングするために有用であろう。
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Protocol
植物の種子からの全RNAの1の抽出
- バッファセット、スピンカラム、1.5および2.0 mLのポリプロピレンチューブ、およびヌクレアーゼフリー1.5 mLのポリプロピレンチューブを準備します。
- RNA抽出、激しくボルテックスするための溶解緩衝液をセルに（以下、PVPという）分子生物学グレードのポリビニルピロリドン（w / v）の1％を加えます。完全に溶解するために25℃で20分間インキュベートします。 20分間のインキュベーション後、気泡の形成を防止するために逆さまにチューブを回転させることによって穏やかにバッファーを混合します。使用前に室温（15~25℃）で保管してください。
- 氷上で1.5 mLのポリプロピレンチューブ中のシロイヌナズナと場所から収穫果物。アルミプレート上に果物を置き、4℃で維持し、実体顕微鏡下で果実から種子を分離します。
- 氷の上にアルミラックに格納され、直ちに液体窒素中にチューブを配置された1.5 mLのポリプロピレンチューブに分離された種子（約200種を）置きますitrogen。
- 液体窒素からチューブを外して、氷の上にアルミニウムラックに戻します。 4℃で千×gで1分間、1％のPVPと遠心分離機を含む緩衝液100μLを加えます。
- 氷の上にアルミラックにチューブを保持したまま60秒間モーターグラインダーを使用して、ステンレス製の乳棒でサンプルをホモジナイズします。
- 1％のPVPを含有する緩衝液550μLを加える逆さまチューブを回して穏やかにバッファーを混合し、25℃で10分間インキュベートします。
- 25℃で8000×gで5分間遠心し、新しい1.5 mLのポリプロピレンチューブに上清550μLを移します。
- 25°C 10,000×gで5分間遠心し、新しい1.5 mLのポリプロピレンチューブに上清450μLを移します。
- RNA抽出のための細胞溶解液として上清を使用してください。以下では、市販のキットには、メーカーの説明書に記載の手順に従ってください。
- 溶出低レベルの転写物の発現パターンをモニターするためのRNAの十分に高い濃度を確実にするために、溶出緩衝液の最小量を使用してRNA。使用するまでディープフリーザーでRNAを保管してください。
RNAの品質の2.確認
- 、全RNAを解凍穏やかなタッピングによって混合し、氷上でアルミラックにチューブを配置します。
- 微量分光光度計を用いてRNA濃度、A260 / A280比、およびA260 / A230比を測定します。
- 70 ngの/μLの最終濃度になるようにRNaseフリー水で全RNAを希釈します。
種子からの全RNAの3逆転写
- 市販のキットから全RNAおよびバッファセットを解凍します。穏やかなタッピングした後、氷上でキットからの酵素を保管してください。ヌクレアーゼフリー0.2 mlのポリプロピレンチューブを準備します。
- 0.2 mLのpolypropyに全RNAの5μL、オリゴdTプライマーの1μL（50μM）、およびランダム6量体の1μM（50μM）を追加氷上のレンチューブ。
- 37ºCで15分間インキュベートし、氷上に置きます。
- 以下は、逆転写PCRキットで、製造業者の説明書に記載されている手順に従ってください。
- 使用前に氷上で逆転写産物を置きます。
4.定量的リアルタイムPCR解析
- 製造業者のプロトコルを使用して、標的遺伝子配列を保有するプラスミドを構築します。
- 標準曲線のためのDNAテンプレートの100-500,000コピー/μLに濃度を調整します。
- 蒸留水で：（100 1）のcDNAのソリューションを希釈します。
- 定量的リアルタイムPCRキットからマスターミックスに希釈したcDNA溶液及び標準曲線のためのプラスミドの2μLを追加します。
- 35秒30秒95℃をした後、5秒、95℃で40サイクル、60℃：以下のサイクリング条件を用いてリアルタイムPCRを設定します。
- 男に従ってコピー数を分析リアルタイムPCRシステム用のufacturerの指示。
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Representative Results
我々は最初のシロイヌナズナ完熟種子を用いて、PVPの最適濃度を調べました。全RNAを、0％、0.25％、0.5％、1.0％または2.0％のPVPを含有する細胞溶解緩衝液を用いて、上記のプロトコルに従って約1,000種から単離しました。油層と種子の破片（ 図1A）を回避しながら、ホモジナイズし、遠心分離後、上清を回収しました。
図1： 細胞溶解緩衝液中で最適なポリビニルピロリドン濃度の推定。総RNAは、PVPの異なる濃度を含有する細胞溶解緩衝液で抽出しました。 （A）ホモジナイズし、遠心分離後の種子の写真。 （B）各サンプルについて、波長の吸光度のグラフが示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
単離されたRNAの量及び純度は1.0％PVPを種子から精製したRNAを大量に単離する最も効果的な濃度であることが示された波長の吸光度のグラフ（ 図1B）から推定しました。
開発種子は実体顕微鏡（ 図2A、2B）の下で氷上で予冷したアルミニウム板上に、シロイヌナズナの果実から単離しました。種子は氷の上にアルミニウムラック（ 図2C、2D）にチューブ内のステンレス製の乳棒およびモーターグラインダーでホモジナイズしました。
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図2：単離と シロイヌナズナ の種子を開発するの均質化 。現像種子は、実体顕微鏡（A）下コールドアルミニウム板上果実から単離されます。心皮の茎（B）から剥離され、現像種子が収集されます。種子は、氷（D）で冷却アルミラックに試験管内のステンレス鋼乳棒（C）を用いて1％（w / v）のポリビニルピロリドンを含有する溶解緩衝液中で均質化されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
総RNAは、新しく開発された方法または従来の方法を使用して（以下、DAFと呼ばれる）開花後4,8、および12日目の種子から単離しました。濃度、A260 / A280比、およびA260 /200種から単離されたRNAのA230比を表1に示します。
| 方法 | DAF | RNA濃度 | A260 / A280 | A260 / A230 |
| 従来型の | 4 | 72.4±7.4 | 1.90±0.02 | 2.27±0.06 |
| 8 | 10.8±3.0 | 1.50±0.08 | 1.40±0.17 | |
| 12 | 4.9±1.7 | 1.57±0.10 | 0.76±0.18 | |
| 新しい | 4 | 63.7±2.6 | 2.10±0.08 | 2.29±0.03 |
| 8 | 46.3±4.9 | 2.15±0.05 | 2.23±0.09 | |
| 12 | 41.77; 3.1 | 2.09±0.04 | 2.17±0.07 |
表1： シロイヌナズナの 種子 から単離されたRNAの濃度、A260 / A280比、およびA260 / A230比 。全RNAは、従来の方法または新しく開発された方法を用いて、8、4時（190〜206種子から）約200種子から単離し、12 DAFました。 RNA濃度は、A260 / A280比、およびA260 / A230比を測定しました。値は、3つの独立した実験の平均±SDを表します。
結果は、我々の方法は、8および12 DAF種子から高度に精製されたRNAを分離することができたことを示しています。全RNAをcDNAに逆転写した、およびcDNA溶液を100倍に希釈しました。コピーWRI1の番号（ しわ1：AT3G54320）、SDP1（SUGAR DEPENDENT1：AT5G04040）7 </ SUP>、及びEIF3K（真核生物翻訳開始因子3K：AT4G33250）内部統制8とを測定し、転写物の相対量は、（ 図3）分析、定量的リアルタイムPCRによって評価しました。
図3： 種子の開発に低レベルの転写物の定量。全RNAを、我々の方法を用いて、4、8、及び12 DAF種子から抽出し、そしてcDNA溶液を調製しました。 WRI1（A）及びSDP1（B）転写物の相対量は、定量的リアルタイムPCRにより測定しました。 EIF3K内部対照として使用しました。値は3回の独立した実験の平均±SDを表します。 DAF;開花後の日。 彼をクリックしてくださいこの図の拡大版を表示するために再。
WRI1とSDP1転写物の量は、種子の開発に比較的低いが、異なる発達段階での種子の間の発現の変化を検出することが可能でした。私たちの方法は、他の油糧種子で利用することができることを確認するには、全RNAは、 アブラナおよびダイズの成熟種子から単離されました。 RNA濃度は、A260 / A280比、およびA260 / A230比を表2に示します。
| 方法 | 工場 | RNA濃度 | A260 / A280 | A260 / A230 |
| 従来型の | セイヨウアブラナ | 7.7±0.8 | 1.5±0.12 | 0.75±0.11 |
| G. maxの | 1.61±0.06 | 0.69±0.09 | ||
| 新しい | セイヨウアブラナ | 143.2±19.0 | 2.17±0.03 | 2.23±0.13 |
| G. maxの | 152.3±4.4 | 2.17±0.02 | 2.30±0.02 |
表2：濃度、A260 / A280比、および セイヨウアブラナ および ダイズ の成熟種子から単離されたRNAのA260 / A230比 。全RNAは、従来の方法または新しく開発された方法を用いて、 アブラナおよびダイズ種子の約100 mgを単離しました。種子を液体窒素中で冷却し、乳鉢と乳棒を用いて以前に粉砕し、概ね均質化しました。 RNA濃度、A260 / A280の比率、およびA260 / A230比を測定しました。値は、3つの独立した実験の平均±SDを表します。
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Discussion
遺伝子発現プロファイルは、植物生理学の我々の理解に貢献します。従って、特定のRNAの単離方法は、各サンプル条件9-12のために開発されています。我々は、種子からのRNA単離の間に抑制されたプロセスを調査し、RNAをシリカ膜への結合が厳しく抑制されたことがわかりました。油、タンパク質、およびポリフェノールの大量のRNA単離を阻害します。我々は、RNAはシリカ膜に結合する工程の前に、溶解溶液でこれらの化合物を除去するために、RNA抽出過程を改変しました。重要な修飾は、1％のPVP（ステップ1.2）、遠心分離、溶解液からの上清の収集（1.7、1.8ステップ）の添加を含みました。 1％のPVPの添加の目的は、ポリフェノールを除去することです。我々が使用するPVPの最も効果的な濃度を検討し、1％のPVPがこのプロセスのための最も有効な濃度であることが確認されました。遠心分離した溶解液から上清を収集する目的油およびタンパク質を除去することです。上清は、上清中の油層とチューブ内のペレットを保持しないように注意してください収集する必要があります。これらの2つの簡単な修正が大幅に中央で種子や開発の後期段階（ 表1）からの回復、A260 / A280比、および単離されたRNAのA260 / A230比を改善しました。
標準プロトコルの簡単な変更を表して私たちの方法は、RNA単離のための市販のキットを使用しています。したがって、我々の方法は、塩化リチウムを使用し、フェノール - クロロホルム抽出、エタノール沈殿など煩雑な追加の工程を必要とせずに種子から高度に精製されたRNAの単離のために実用的です。私たちの方法は、修正が石油・タンパク質が豊富な作物の種子のために働くことを示す、また成熟した菜種や大豆の種子（ 表2）で使用するために有効です。 4 DAFの種子（ 表1）と若いルートからのRNA回収率秒、葉や茎は、我々の方法は、油やタンパク質に乏しい組織からのRNAの単離に適していないことを示す、我々の方法を使用して低かったです。したがって、この方法は、例えば、種子および果実などの油、タンパク質、及びポリフェノールを含有する組織からのRNAの単離のために有利です。
全体として、我々の方法は、RNAの精製のためのフェノール、クロロホルム、または追加のプロセスを使用せずに植物の種子から高度に精製されたRNAを取得するのに適しています。この方法は、種子における遺伝子発現のより正確なプロファイリングを容易にします。
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Acknowledgments
私たちは、ゲノム機能施設と分光とバイオイメージング施設、基生研中核研究施設、およびモデル植物研究施設、基生研バイオリソースセンターのスタッフに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
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