定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたRNAの単離のための効率的な方法

Summary

高純度のRNA単離に対する阻害効果を持つ油分、タンパク質、ポリフェノールを多く含む植物種子からのRNA単離方法を確立することに成功しました。私たちの方法は、シード中の低レベルの転写産物を持つ遺伝子の発現を監視するのに適しています。

Abstract

植物の種子は、生分解性の有機物を含む大量の貯蔵蓄えを蓄積します。人間は、食料や工業材料として種子貯蔵庫に依存しています。遺伝子発現プロファイルは、植物細胞の代謝制御を研究するための強力なツールです。そのため、作物の育種には、種子開発における詳細で正確な遺伝子発現プロファイルが必要です。これらのプロファイルを作成するためには、高度に精製されたRNAを取得することが不可欠です。高度に精製されたRNAを種子から単離するには、効率的な方法が必要です。ここでは、高純度RNAの単離に阻害効果を持つ油脂、タンパク質、ポリフェノールを多く含むシーズからRNAを単離する方法について述べます。私たちの方法は、フェノール、クロロホルム、またはRNA精製のための追加のプロセスを使用せずに、種子から高度に精製されたRNAを得ることを可能にします。この方法は、シロイヌナズナ、菜種、および大豆種子に適用できます。本手法は、発生中の種子や成熟した種子における低レベル転写産物の発現パターンのモニタリングに役立ちます。

Introduction

植物は、次の世代を生じる種子を生産します。種子は、ポスト発芽成長のために、そのような油、炭水化物、およびタンパク質などの貯蔵物質、大量に蓄積します。人間は食品や動物飼料の供給源として種子貯蔵準備金を活用し、ひいては植物の種子は、世界的に食用有機物の主要なサプライヤの一つです。種子の収量を増加させると、植物科学における重要な課題です。

種子貯蔵物質が食品や工業材料の商業的に価値のある情報源であるため、これらの引当金の代謝の調節の根底にある分子メカニズムは、広く^1-6を検討されています。さらに、これらのメカニズムを解明することは、作物種子収量を増加させるために有用であろう。種子は受精後植物卵巣で開発し、それらは発達段階^1,6,7の一連の成熟します。さらに分子機構根底にある種子の開発を理解することは、詳細が必要です種子を開発する一連の正確な遺伝子発現プロファイルが生成されます。しかし、油、タンパク質、炭水化物、および植物種子中のポリフェノールの高い量は、それが困難な遺伝子発現の正確なプロファイリングを排除する高度に精製されたRNAを単離することを可能にします。

ここでは、油、タンパク質、およびポリフェノールを多く含む油糧種子からのRNAの単離のための効率的な方法を紹介します。この方法を使用して、研究者らは、高度に精製されたRNAを調製することができるであろう。このようなRNAは、開発....

Protocol

植物の種子からの全RNAの1の抽出

1. バッファセット、スピンカラム、1.5および2.0 mLのポリプロピレンチューブ、およびヌクレアーゼフリー1.5 mLのポリプロピレンチューブを準備します。
2. RNA抽出、激しくボルテックスするための溶解緩衝液をセルに（以下、PVPという）分子生物学グレードのポリビニルピロリドン（w / v）の1％を加えます。完全に溶解するために25℃で20分間インキュベートします。 20分間のインキュベーション後、気泡の形成を防止するために逆さまにチューブを回転させることによって穏やかにバッファーを混合します。使用前に室温（15~25℃）で保管してください。
3. 氷上で1.5 mLのポリプロピレンチューブ中のシロイヌナズナと場所から収穫果物。アルミプレート上に果物を置き、4℃で維持し、実体顕微鏡下で果実から種子を分離します。
   1. 氷の上にアルミラックに格納され、直ちに液体窒素中にチューブを配置された1.5 mLのポリプロピレンチューブに分離された種子（約200種を）置きますitrogen。
4. 液体窒素からチューブを外して、氷の上にアルミニウムラックに戻します。 4℃で千×gで1分間、1％のPVPと遠心分離機を含む緩衝液100μLを加えます。
5. 氷の上にアルミラックにチューブを保持したまま60秒間モーターグラインダーを使用して、ステンレス製の乳棒でサンプルをホモジナイズします。

Results

我々は最初のシロイヌナズナ完熟種子を用いて、PVPの最適濃度を調べました。全RNAを、0％、0.25％、0.5％、1.0％または2.0％のPVPを含有する細胞溶解緩衝液を用いて、上記のプロトコルに従って約1,000種から単離しました。油層と種子の破片（ 図1A）を回避しながら、ホモジナイズし、遠心分離後、上清を回収しました。

図1： 細胞溶解緩衝液中で最適なポリビニルピロリドン濃度の推定。総RNAは、PVPの異なる濃度を含有する細胞溶解緩衝液で抽出しました。 （A）ホモジナイズし、遠心分離後の種子の写真。 （B）各サンプルについて、波長の吸光度.......

Discussion

遺伝子発現プロファイルは、植物生理学の我々の理解に貢献します。従って、特定のRNAの単離方法は、各サンプル条件^9-12のために開発されています。我々は、種子からのRNA単離の間に抑制されたプロセスを調査し、RNAをシリカ膜への結合が厳しく抑制されたことがわかりました。油、タンパク質、およびポリフェノールの大量のRNA単離を阻害します。我々は、RNAはシリカ膜に結合する工程の前に、溶解溶液でこれらの化合物を除去するために、RNA抽出過程を改変しました。重要な修飾は、1％のPVP（ステップ1.2）、遠心分離、溶解液からの上清の収集（1.7、1.8ステップ）の添加を含みました。 1％のPVPの添加の目的は、ポリフェノールを除去することです。我々が使用するPVPの最も効果的な濃度を検討し、1％のPVPがこのプロセスのための最も有効な濃度であることが確認されました。遠心分離した溶解液から上清を収集する目的油およびタンパク質を除去することです。上清は、上清中の油層とチューブ内のペレットを保持しないように注意してください収集する必要があります。これらの2つの簡単な修正が大幅に中央で種子や開発の後期段階（ 表1）<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNeasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904
polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	P5288-100G
ホモジナイザー S-303	AS ONE	1-1133-02
NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TAKARA	RR037A
KAPA SYBR高速リアルタイムqPCRキット	Kapa biosystems	KK4601