Introduction
Растения производят семена, которые дают начало следующему поколению. Семена скапливаются большие объемы запасов хранения, таких как масла, углеводов и белков, для пост-герминативных роста. Люди используют семенные запасы хранения в качестве источника питания и кормов для животных, и, таким образом, семена растений являются одним из основных поставщиков пищевого органического вещества по всему миру. Увеличение урожайности семян является важной задачей в растительном науке.
Поскольку запасы хранения семян являются коммерчески ценным источником пищевых и промышленных материалов, молекулярные механизмы , лежащие в основе регуляции метаболизма этих запасов были широко исследованы 1-6. Далее выяснении эти механизмы будут полезны для повышения урожайности семян сельскохозяйственных культур. Семена развиваются в растительных яичниках после оплодотворения, и они созревают через ряд стадий развития 1,6,7. Дальнейшее развитие понимания молекулярного механизма, лежащего семян требует подробное, Точные профили экспрессии генов из ряда развивающихся семенах будет производиться. Тем не менее, высокие количества масла, белков, углеводов и полифенолов в семенах растений, делают его трудно выделить высокоочищенного РНК, что исключает возможность точного профилирование экспрессии генов.
Здесь мы вводим эффективный метод выделения РНК из семян масличных культур, содержащих большое количество масел, белков и полифенолов. Используя этот метод, исследователи смогут подготовить высокоочищенного РНК. Такая РНК будет полезна для мониторинга изменений в транскрипционные ключевых генов, контролирующих метаболический регулирование запасов хранения семян в развивающихся и зрелых семян масличных культур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение тотальной РНК из семян растений
- Подготовьте наборы буферов, спиновые колонки, 1,5 и 2,0 мл полипропиленовые трубы и нуклеазы 1,5 мл полипропиленовые трубы.
- Добавить 1% (вес / об) молекулярной биологии класса поливинилпирролидона (далее именуемые как PVP) в буфере для лизиса клеток для экстракции РНК и вортексе. Инкубировать в течение 20 мин при 25 ° С до полного растворения. После 20-минутной инкубации, смешать буфер осторожно поворачивая трубку вверх дном, чтобы предотвратить образование пузырьков. Хранить при комнатной температуре (15-25 ° C) перед использованием.
- Урожай фруктов из Резуховидка Таля растений и место в 1,5 мл полипропиленовые пробирки на льду. Место фрукты на алюминиевые пластины выдерживают при температуре 4 ° С и изолируют семена из плодов с помощью стереомикроскопа.
- Поместите выделенные семена (около 200 семян) в 1,5 мл полипропиленовые пробирки, которые были сохранены в алюминиевой стойке на льду и сразу же поместить пробирки в жидком пitrogen.
- Удалите трубки из жидкого азота и вернуть их в алюминиевой стойке на льду. Добавьте 100 мкл буфера, содержащего 1% PVP и центрифуги в течение 1 мин при 1000 х г при температуре 4 ° С.
- Однородный образец с пестиком из нержавеющей стали с использованием мотор-шлифовальной машины в течение 60 с, держа трубку в алюминиевой стойке на льду.
- Добавить 550 мкл буфера, содержащего 1% PVP, смешайте буфер осторожно поворачивая трубку вверх дном, и инкубируют в течение 10 мин при 25 ° С.
- Центрифуга в течение 5 мин при 8000 х г при 25 ° С и передачи 550 мкл супернатанта к новой 1,5 мл полипропиленовую трубку.
- Центрифуга в течение 5 мин при 10000 х г при 25 ° С и передачи 450 мкл супернатанта к новой 1,5 мл полипропиленовую трубку.
- Используйте супернатант в качестве клеточного лизата для экстракции РНК. Далее следуйте процедуре, описанной в инструкции изготовителя в коммерчески доступного набора.
- ЭлюируйтеРНК с использованием минимального объема буфера для элюции, чтобы обеспечить достаточно высокую концентрацию РНК для мониторинга паттерны экспрессии транскриптов низкого уровня. Хранить РНК в глубоком морозильнике до использования.
2. Проверка качества РНК
- Разморозить тотальной РНК, перемешать путем осторожного постукивания, и поместите трубку в алюминиевой стойке на льду.
- Измерение концентрации РНК, соотношение A260 / A280 и A260 соотношение / A230 с использованием микрообъем спектрофотометра.
- Развести тотальную РНК в РНКазу воде до конечной концентрации 70 нг / мкл.
3. обратной транскрипцией тотальной РНК из семян
- Оттепель тотальной РНК и буферных наборов из коммерческого набора. Держите ферменты из комплекта на льду после осторожного постукивания. Подготовка нуклеазы 0,2 мл полипропиленовые трубы.
- Добавьте 5 мкл тотальной РНК, 1 мкл олиго дТ праймера (50 мкМ) и 1 мкМ случайных 6-меров (50 мкМ) в 0,2 мл полипропиленоваяЛене трубки на льду.
- Выдержите в течение 15 мин при 37 ° С и помещают на лед.
- Далее следуйте процедуре, описанной в инструкции изготовителя в обратном наборе транскрипции-ПЦР.
- Поместите продукты обратной транскрипции на льду перед использованием.
4. Количественный анализ в реальном времени ПЦР
- Построить плазмид, несущих последовательности гена-мишени с использованием протокола производителя.
- Отрегулируйте концентрации до 100-500,000 копий / мкл для ДНК-матриц для стандартных кривых.
- Разбавьте растворы кДНК (1: 100) с дистиллированной водой.
- Добавьте 2 мкл разбавленных растворов кДНК и плазмид для стандартных кривых к основной смеси из количественного ПЦР в реальном времени набора.
- Установка ПЦР в реальном времени с использованием следующих условий: езда на велосипеде 95 ° C в течение 30 с, а затем 40 циклов при 95 ° С в течение 5 с и 60 ° С в течение 35 сек.
- Анализ числа копий в соответствии с мужчинойинструкции ufacturer для реального времени системы ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сначала мы исследовали оптимальную концентрацию PVP с использованием Arabidopsis зрелых семян. Общую РНК выделяли из приблизительно 1000 семян в соответствии с протоколом, описанным выше, с использованием буфера для лизиса клеток, содержащего 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% или 2,0% PVP. После гомогенизации и центрифугирования супернатант собирали, избегая при этом слой масла и семян мусора (рисунок 1А).
Рисунок 1: Оценка оптимальной концентрации поливинилпирролидона в буфере для лизиса клеток. Суммарную РНК экстрагировали с буфера для лизиса клеток, содержащих различные концентрации PVP. (А) Фотография семян после гомогенизации и центрифугирования. (Б) Графики длин волн оптической плотности для каждого образца указаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Количество и чистота выделенных РНК оценивали из графика длин волн оптической плотности (рис 1б), который показал , что 1,0% PVP , была наиболее эффективной концентрации выделения большого количества очищенной РНК из семян.
Развивающиеся семена были выделены из Резуховидка Таля фруктов на предварительно охлажденных алюминиевых пластин на льду под (2А, 2В фигурах) стереомикроскопа. Семена гомогенизировали с пестиком из нержавеющей стали и мотор-мясорубки в трубе на алюминиевой стойке на льду (рис 2C, 2D).
2.jpg "/>
Рисунок 2: Выделение и гомогенизация развития семян Резуховидка Таля. Развивающиеся семена выделяют из плодов на холодной алюминиевой пластине под стереомикроскопа (A). Плодолистики очищенные от ножку (B), и развивающиеся семена собирают. Семена гомогенизируют в буфере для лизиса , содержащего 1% (вес / объем) поливинилпирролидона с использованием нержавеющей стали пестиком (С) в трубах в алюминиевой стойке охлаждали на льду (D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Общую РНК выделяли из семян на 4, 8 и 12 дней после цветения (далее именуемые как DAF) с помощью нашего недавно разработанный метод или обычный метод. Концентрации, отношения A260 / A280 и A260 /A230 соотношения РНК , выделенной из 200 семян, приведены в таблице 1.
| метод | DAF | концентрация РНК | A260 / A280 | A260 / A230 |
| общепринятый | 4 | 72,4 ± 7,4 | 1,90 ± 0,02 | 2,27 ± 0,06 |
| 8 | 10,8 ± 3,0 | 1,50 ± 0,08 | 1,40 ± 0,17 | |
| 12 | 4,9 ± 1,7 | 1,57 ± 0,10 | 0,76 ± 0,18 | |
| новый | 4 | 63,7 ± 2,6 | 2.10 ± 0.08 | 2,29 ± 0,03 |
| 8 | 46,3 ± 4,9 | 2,15 ± 0,05 | 2,23 ± 0,09 | |
| 12 | 41,77; 3.1 | 2,09 ± 0,04 | 2,17 ± 0,07 |
Таблица 1: концентрации, соотношения A260 / A280 и A260 / A230 соотношения РНК , выделенной из семян Arabidopsis. Общую РНК выделяли из приблизительно 200 семян (от 190 до 206 семян) на 4, 8, 12 и ДАФ с использованием традиционного метода или наш недавно разработанный метод. Были измерены концентрации РНК, отношения A260 / A280 и A260 отношения / A230. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов.
Результаты показывают, что наш метод позволил нам выделить высокоочищенного РНК из 8 и 12 семян DAF. Общую РНК обратной транскрипции в кДНК, и кДНК растворы разбавляли в 100 раз. В копии номера WRI1 (морщинистый 1: AT3G54320), SDP1 (САХАР DEPENDENT1: AT5G04040) 7 </ SUP> и EIF3K (эукариотических фактор инициации перевода 3K: AT4G33250) в качестве внутреннего контроля 8 были измерены, и относительные количества транскриптов оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени анализирует (рисунок 3).
Рисунок 3: Количественное транскриптов низкого уровня в развивающихся семян. Суммарную РНК экстрагировали из 4-х, 8, и 12 семян DAF с помощью нашего метода, и готовили растворы кДНК. Относительные количества WRI1 (А) и SDP1 (В) транскриптов были измерены с помощью количественного ПЦР реального времени. EIF3K был использован в качестве внутреннего контроля. Значения представляют среднее SD трех независимых экспериментов. DAF; дней после цветения. Пожалуйста , нажмите онповторно просмотреть большую версию этой фигуры.
Хотя количество WRI1 и SDP1 транскриптов относительно низки в развивающихся семенах, можно было обнаружить изменения экспрессии между семенами на разных стадиях развития. Для того, чтобы убедиться в том , что наш метод может быть использован в других масличных культур, общая РНК выделяли из зрелых семян Brassica париз и глицин макс. Концентрации РНК, отношени A260 / A280 и отношения А260 / A230 приведены в таблице 2.
| метод | Растение | концентрация РНК | A260 / A280 | A260 / A230 |
| общепринятый | B. париз | 7,7 ± 0,8 | 1,5 ± 0,12 | 0,75 ± 0,11 |
| G. макс | 1,61 ± 0,06 | 0,69 ± 0,09 | ||
| новый | B. париз | 143,2 ± 19,0 | 2,17 ± 0,03 | 2,23 ± 0,13 |
| G. макс | 152,3 ± 4,4 | 2,17 ± 0,02 | 2,30 ± 0,02 |
Таблица 2: концентрации, соотношения A260 / A280 и A260 / A230 соотношения РНК , выделенной из зрелых семян Brassica париз и Глицин макс. Общую РНК выделяли из приблизительно 100 мг Brassica париз и глицин макс семян с использованием традиционного метода или наш недавно разработанный метод. Семена были предварительно измельченный и грубо гомогенизируют с помощью ступки и пестика, охлажденной в жидком азоте. Концентрации РНК, A260 / Aбыли измерены 280 отношения и отношения A260 / A230. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
профили экспрессии генов способствуют нашему пониманию физиологии растений; Поэтому, методами выделения специфической РНК, были разработаны для каждого образца состояния 9-12. Мы исследовали процессы, которые были заторможены в процессе выделения РНК из семян и обнаружили, что РНК-связывание с кремнеземных мембран была сильно тормозится. Большое количество масел, белков и полифенолов ингибируют выделения РНК. Мы модифицировали процесс экстракции РНК для удаления этих соединений с раствором для лизиса до процесса связывания РНК с кремнеземных мембран. Важные изменения включали добавление 1% PVP (шаг 1.2) и сбор супернатанта от центрифугирования раствора для лизиса (шаги 1.7, 1.8). Цель добавления 1% PVP является удаление полифенолов. Мы рассмотрели наиболее эффективной концентрации PVP в использовании и подтвердили, что 1% PVP, является наиболее эффективной концентрации для этого процесса. Цель сбор супернатанта из центрифугированного раствора для лизисачтобы удалить масло и протеины. Жидкость над осадком следует собирать осторожно, чтобы избежать сохранения слоя масла в супернатант и осадок в пробирке. Эти две простые модификации значительно улучшили восстановление, соотношение A260 / и и 280 A260 / A230 соотношения выделенной РНК из семян в середине и конце фазы развития (таблица 1).
Наш метод, который представляет собой простую модификацию стандартного протокола, использует коммерчески доступные наборы для выделения РНК. Таким образом, наш метод был практичным для выделения высокоочищенной РНК из семян без необходимости громоздких дополнительных шагов, таких как экстракции фенолом и хлороформом и осаждением этанолом с использованием хлорида лития. Наш метод также эффективен для использования со зрелыми семян рапса и семян сои (Таблица 2), что свидетельствует о том , что изменения работают хорошо для масло- и богатых белком семян сельскохозяйственных культур. Скорости восстановления РНК из 4 семян DAF (таблица 1) и молодой кореньS, листья и стебли были ниже, с помощью нашего метода, указывая, что наш метод не пригоден для выделения РНК из тканей, которые бедны в масле и белков. Таким образом, способ имеет преимущество только для выделения РНК из тканей, содержащих масло, белки и полифенолы, такие как семена и плоды.
В целом, наш метод пригоден для получения высокой степени очистки РНК из семян растений без использования фенола, хлороформа или дополнительных процессов для очистки РНК. Этот метод будет способствовать более точной профилирование экспрессии генов в семенах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим сотрудников фонда функциональной геномики и спектрографирование и биоимиджинга фонда, NIBB Основные научно-исследовательских учреждений, а также модель исследовательского фонда растений, NIBB центр биоресурсов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
