Нам удалось разработать метод выделения РНК из семян растений, содержащих большое количество масел, белков и полифенолов, которые оказывают ингибирующее действие на выделение РНК высокой чистоты. Наш метод подходит для мониторинга экспрессии генов с низким уровнем транскриптов в семенах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эффективный метод для выделения высокоочищенного РНК из семян для использования в количественном анализе Транскриптом
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Семена растений накапливают большое количество запасов, содержащих биоразлагаемые органические вещества. Люди полагаются на запасы семян для хранения пищи и в качестве промышленных материалов. Профили экспрессии генов являются мощными инструментами для исследования метаболической регуляции в растительных клетках. Поэтому для селекции сельскохозяйственных культур необходимы подробные и точные профили экспрессии генов во время развития семян. Приобретение высокоочищенной РНК имеет важное значение для производства этих профилей. Необходимы эффективные методы выделения высокоочищенной РНК из семян. В данной работе мы описываем метод выделения РНК из семян, содержащих большое количество масел, белков и полифенолов, которые оказывают ингибирующее действие на выделение РНК высокой чистоты. Наш метод позволяет получать высокоочищенную РНК из семян без использования фенола, хлороформа или дополнительных процессов для очистки РНК. Этот метод применим к арабидопсису, рапсу и семенам сои. Наш метод будет полезен для мониторинга паттернов экспрессии транскриптов низкого уровня в развивающихся и зрелых семенах.
Введение
Растения производят семена, которые дают начало следующему поколению. Семена скапливаются большие объемы запасов хранения, таких как масла, углеводов и белков, для пост-герминативных роста. Люди используют семенные запасы хранения в качестве источника питания и кормов для животных, и, таким образом, семена растений являются одним из основных поставщиков пищевого органического вещества по всему миру. Увеличение урожайности семян является важной задачей в растительном науке.
Поскольку запасы хранения семян являются коммерчески ценным источником пищевых и промышленных материалов, молекулярные механизмы , лежащие в основе регуляции метаболизм....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Выделение тотальной РНК из семян растений
- Подготовьте наборы буферов, спиновые колонки, 1,5 и 2,0 мл полипропиленовые трубы и нуклеазы 1,5 мл полипропиленовые трубы.
- Добавить 1% (вес / об) молекулярной биологии класса поливинилпирролидона (далее именуемые как PVP) в буфере для лизиса клеток для экстракции РНК и вортексе. Инкубировать в течение 20 мин при 25 ° С до полного растворения. После 20-минутной инкубации, смешать буфер осторожно поворачивая трубку вверх дном, чтобы предотвратить образование пузырьков. Хранить при комнатной температуре (15-25 ° C) перед использованием.
- Урожай фруктов из Резуховидка Таля растений и мес....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сначала мы исследовали оптимальную концентрацию PVP с использованием Arabidopsis зрелых семян. Общую РНК выделяли из приблизительно 1000 семян в соответствии с протоколом, описанным выше, с использованием буфера для лизиса клеток, содержащего 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% или 2,0% PVP. После гомогенизации и центрифугирования супернатант собирали, избегая при этом слой масла и семян мусора (рисунок 1А).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
профили экспрессии генов способствуют нашему пониманию физиологии растений; Поэтому, методами выделения специфической РНК, были разработаны для каждого образца состояния 9-12. Мы исследовали процессы, которые были заторможены в процессе выделения РНК из семян и обнаружили, что РНК-связывание с кремнеземных мембран была сильно тормозится. Большое количество масел, белков и полифенолов ингибируют выделения РНК. Мы модифицировали процесс экстракции РНК для удаления этих соединений с раствором для лизиса до проце.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим сотрудников фонда функциональной геномики и спектрографирование и биоимиджинга фонда, NIBB Основные научно-исследовательских учреждений, а также модель исследовательского фонда растений, NIBB центр биоресурсов.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| поливинилпирролидон | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| ГОМОГЕНИЗАТОР S-303 | КАК ОДИН | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT Набор реактивов (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Набор для быстрой количественной ПЦР | Kapa biosystems | KK4601 |
Ссылки
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
