Introduction
식물은 다음 세대를 야기 종자를 생산한다. 씨앗은 후 germinative 성장을위한 오일, 탄수화물, 단백질, 같은 저장 매장량의 많은 양의 축적. 인간은 식품 및 동물 사료의 소스로 종자 저장 보유고를 활용, 따라서 식물 씨앗은 전 세계적으로 식용 유기 물질의 주요 공급 업체 중 하나입니다. 종자 생산량 증가는 식물 과학에서 중요한 도전이다.
종자 저장 매장량 식품 및 산업용 소재의 상업적 가치있는 소스이기 때문에, 이러한 매장량의 신진 대사의 규제를 기본 분자 메커니즘 널리 1-6 조사되었다. 또한 이러한 메커니즘을 해명하는 것은 작물 종자 수확량을 증가 도움이 될 것입니다. 씨앗은 수정 후 식물의 난소에서 개발, 그들은 발달 단계 1,6,7의 시리즈를 통해 성숙. 또한 분자 메커니즘 기본 종자 개발을 이해하는 상세한 필요씨앗, 현상하는 일련의 정확한 유전자 발현 프로파일을 생성한다. 그러나, 식물의 씨앗 오일, 단백질, 탄수화물, 폴리 페놀의 다량 어려운 유전자 발현의 정확한 프로파일을 배제 고순도 RNA를 분리 할 수 있습니다.
여기서는 오일, 단백질, 폴리 페놀을 다량 함유 종자로부터 RNA를 분리하기위한 효율적인 방법을 소개한다. 이 방법을 사용하여, 연구자는 고도로 정제 된 RNA를 제조 할 수있을 것이다. 이러한 RNA 개발 및 성숙 종자에서 종자 저장 매장량의 대사 조절을 제어하는 핵심 유전자의 전사 변화를 모니터링하는 데 유용 할 것입니다.
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Protocol
식물 씨앗에서 총 RNA 1. 추출
- 버퍼 세트, 스핀 열, 1.5 및 2.0 mL의 폴리 프로필렌 튜브 및 뉴 클레아없는 1.5 ML의 폴리 프로필렌 튜브를 준비합니다.
- (V / W) (이하, PVP라고 함), 분자 생물학 등급의 폴리 비닐 피 롤리 돈을 적극적 RNA 추출 및 와류에 대한 용해 완충액 셀 1 % 추가. 완전히 용해시키기 위해 25 ℃에서 20 분 동안 인큐베이션. 20 분 배양 후, 기포의 형성을 방지하기 위해 거꾸로 튜브를 부드럽게 돌려서 버퍼를 섞는다. 사용하기 전에 실내 온도 (15-25 °에 C)에 보관하십시오.
- 얼음에 1.5 mL의 폴리 프로필렌 튜브에 애기 장대 식물과 장소에서 수확 과일입니다. 알루미늄 판에 장소 과일 4 ° C로 유지하고 스테레오 현미경 열매에서 씨앗을 격리 할 것.
- 액 N의 튜브를 배치 즉시 얼음에 알루미늄 랙에 저장되어있는 1.5ml의 폴리 프로필렌 튜브로 절연 종자 (종자 약 200)를 놓고itrogen.
- 액체 질소에서 튜브를 제거하고 얼음에 알루미늄 랙에 반환. 4 ° C에서 1,000 XG에서 1 % 1 분 동안 PVP와 원심 분리기를 포함하는 버퍼 100 μL를 추가합니다.
- 얼음 알루미늄 랙 튜브를 유지하면서 60 초 동안 모터 분쇄기를 사용하여 스테인리스 봉과 시료 균질화.
- 1 % PVP를 함유하는 완충액 550 μL를 추가 거꾸로 튜브를 돌려 버퍼를 부드럽게 혼합하고 25 ° C에서 10 분 동안 배양한다.
- 5 25 ° C에서 8,000 XG에 분하고 새로운 1.5 ML의 폴리 프로필렌 튜브로 전송 상층 액 550 μL에 대한 원심 분리기.
- 5 25 ° C에서 10,000 XG에 분하고 새로운 1.5 ML의 폴리 프로필렌 튜브로 전송 상층 액 450 μL에 대한 원심 분리기.
- RNA 추출을위한 세포 용 해물로 뜨는을 사용합니다. 이하, 시판 키트 제조업체의 지침에 설명 된 절차를 따르십시오.
- 용출RNA는 낮은 수준의 전 사체의 발현 양상을 모니터링하기 위해 RNA의 충분히 높은 농도를 확인하기 위해 용출 버퍼의 최소량을 사용. 사용까지 깊은 냉동고에서 RNA를 저장합니다.
RNA 품질의 2. 확인
- 총 RNA를 녹여 부드러운 도청에 의해 혼합하고 얼음에 알루미늄 랙에 튜브를 배치합니다.
- microvolume 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도 A260 / A280 비율 및 A260 / A230의 비율을 측정한다.
- 70 NG / μL 최종 농도의 RNase가없는 물에서 총 RNA를 희석한다.
씨앗에서 총 RNA의 3 역전사
- 상업 키트에서 총 RNA와 버퍼 세트를 해동. 부드러운 태핑 후 얼음에 키트에서 효소를 유지합니다. 클레아없는 0.2 ML의 폴리 프로필렌 튜브를 준비합니다.
- 0.2 ML의 polypropy 5 총 RNA의 μL, 1 μL 올리고의 DT 프라이머 (50 μM), 1 임의의 μM 6 량체 (50 μM)를 추가얼음 렌 튜브.
- 37 ºC에서 15 분 동안 품어과 얼음에 배치합니다.
- 이하, 역전사-PCR 키트 제조업체의 지침에 설명 된 절차를 따르십시오.
- 사용하기 전에 얼음에 역전사 제품을 놓습니다.
4. 정량적 실시간 PCR 분석
- 제조자의 프로토콜을 사용하여 표적 유전자 서열을 보유하는 플라스미드를 구축.
- 표준 곡선에 대한 DNA 템플릿 100-500,000 복사 / μL로 농도를 조절합니다.
- 증류수로 다음의 cDNA 솔루션 (100 일)을 희석.
- 이 희석 된 cDNA 솔루션의 μL 및 정량적 실시간 PCR 키트에서 마스터 믹스로 표준 곡선의 플라스미드를 추가합니다.
- 30 초 동안 95 ° C 다음 5 초 동안 95 ° C에서 40주기와 35 초 동안 60 ° C : 다음 사이클링 조건을 사용하여 실시간 PCR을 설정합니다.
- 사람에 따라 복사 번호 분석실시간 PCR 시스템 제조 회사의 지시.
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Representative Results
우리는 먼저 애기 장대 성숙한 씨앗을 사용하여 PVP의 최적 농도를 조사 하였다. 총 RNA는 0 %, 0.25 %, 0.5 %, 1.0 % 또는 2.0 %의 PVP를 함유하는 세포 용해 완충액을 이용하여 전술 한 프로토콜에 따라 약 1,000 종자로부터 단리 하였다. 오일 층과 시드 파편 (도 1A)를 피하면서 균질화하고, 원심 분리 후 상청을 회수 하였다.
도 1 : 세포 용해 완충액에서 최적의 폴리 비닐 피 롤리 돈 농도 추정. 총 RNA는 PVP의 상이한 농도를 함유하는 세포 용해 완충액으로 추출 하였다. (A) 균질화 및 원심 분리 후 씨의 사진. (B) 각 샘플에 대한 파장의 흡광도의 그래프를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
단리의 RNA의 양과 순도 1.0 %의 PVP 씨앗으로부터 정제 RNA 다량 분리하는 가장 효과적인 농도였다 파장 흡광도의 그래프 (도 1b)로부터 추정 하였다.
개발 씨앗 실체 현미경 (도 2A, 2B)에서 얼음에 미리 냉장 알루미늄 판에 애기 장대의 과일에서 고립되었다. 씨앗은 얼음에 알루미늄 랙 (도 2C, 2D)에 튜브 스테인레스 스틸 봉과 모터 분쇄기와 균질화 하였다.
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그림 2 : 분리 및 애기 장대의 종자를 개발 균질화. 개발 씨앗 실체 현미경 (A)에서 차가운 알루미늄 접시에 과일에서 격리됩니다. 심피는 척추 경 (B)로부터 박리하고, 개발 씨앗 수집됩니다. 씨앗을 얼음 (D)에서 냉각 알루미늄 랙 튜브 스테인리스 유봉 (C)를 사용하여 폴리 비닐 피 롤리 돈 (/ V W) 1 %를 함유하는 용해 완충액에서 균질화된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
총 RNA는 새롭게 개발 된 방법 또는 통상적 인 방법을 사용하여 (이하 DAF 라 함) 개화 후 4, 8, 12 일째에 종자로부터 단리 하였다. 농도, A260 / A280 비율 및 A260 /종자 (200)로부터 분리 된 RNA의 A230 비율을 표 1에 나타내었다.
| 방법 | DAF | RNA 농도 | A260 / A280 | A260 / A230 |
| 전통적인 | 4 | 72.4 ± 7.4 | 1.90 ± 0.02 | 2.27 ± 0.06 |
| 8 | 10.8 ± 3.0 | 1.50 ± 0.08 | 1.40 ± 0.17 | |
| (12) | 4.9 ± 1.7 | 1.57 ± 0.10 | 0.76 ± 0.18 | |
| 새로운 | 4 | 63.7 ± 2.6 | 2.10 ± 0.08 | 2.29 ± 0.03 |
| 8 | 46.3 ± 4.9 | 2.15 ± 0.05 | 2.23 ± 0.09 | |
| (12) | 41.77; 3.1 | 2.09 ± 0.04 | 2.17 ± 0.07 |
표 1 : 애기 장대 종자에서 분리 된 RNA의 농도, A260 / A280 비율 및 A260 / A230 비율. 총 RNA는 4, 8에서 약 200 씨앗 (190 206 씨앗)에서 분리하고, 12 DAF는 종래의 방법 또는 우리의 새로 개발 된 방법을 사용하여. RNA의 농도, A260 / A280 비율 및 A260 / A230의 비율을 측정 하였다. 값은 3 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SD를 나타냅니다.
결과는 우리의 방법은 8, 12 DAF 씨앗에서 고순도 RNA를 분리 할 수있게 보여줍니다. 총 RNA는 cDNA를로 역전사시키고, cDNA의 용액을 100 배 희석 하였다. 복사 WRI1의 수 (주름 1 : AT3G54320), SDP1 (SUGAR DEPENDENT1 : AT5G04040) 7 </ SUP> 및 EIF3K (진핵 번역 개시 인자 3K : AT4G33250) 내부 제어 8 등을 측정하고, 그 성적의 상대적인 양은 정량적 PCR 분석 실시간 (도 3)에 의해 추정 하였다.
그림 3 : 개발 씨앗에서 낮은 수준의 성적 증명서의 정량화. 총 RNA는 우리의 방법을 사용하여 4, 8, 12 DAF 씨앗으로부터 추출하고, cDNA의 용액을 제조 하였다. WRI1 (A) 및 SDP1 (B) 전 사체의 상대적인 양을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정 하였다. EIF3K는 내부 대조군으로서 사용 하였다. 값은 3 개의 독립적 인 실험의 SD를 의미 나타냅니다. DAF; 꽃 후 일. 그는를 클릭 해주세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 다시.
WRI1 및 SDP1 사체의 양이 현상 씨앗 상대적이지만, 상이한 발달 단계에서 종자 간의 발현의 변화를 검출 할 수 있었다. 우리의 방법이 다른 종자에 이용 될 수 있는지 확인하려면 총 RNA는 브라 시카 napus와 글리신 최대의 성숙한 종자에서 분리 하였다. RNA의 농도, A260 / A280 비율 및 A260 / A230 비는 표 2에 나타내었다.
| 방법 | 식물 | RNA 농도 | A260 / A280 | A260 / A230 |
| 전통적인 | B. napus와 | 7.7 ± 0.8 | 1.5 ± 0.12 | 0.75 ± 0.11 |
| G. 최대 | 1.61 ± 0.06 | 0.69 ± 0.09 | ||
| 새로운 | B. napus와 | 143.2 ± 19.0 | 2.17 ± 0.03 | 2.23 ± 0.13 |
| G. 최대 | 152.3 ± 4.4 | 2.17 ± 0.02 | 2.30 ± 0.02 |
표 2 : RNA의 농도, A260 / A280 비율 및 A260 / A230 비율은 브라 시카 napus와 글리신 최대의 성숙한 씨앗에서입니다. 총 RNA는 브라 시카 napus와 종래의 방법 또는 우리의 새로 개발 된 방법을 사용하여 글리신 최대 종자의 약 100 mg을 분리 하였다. 씨앗은 이전에 분쇄와 액체 질소에 냉각 박격포와 유 봉 대략 균질화 하였다. RNA의 농도 A260 / A280 비 및 A260 / A230의 비율을 측정 하였다. 값은 3 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SD를 나타냅니다.
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Discussion
유전자 발현 프로파일은 식물 생리에 대한 우리의 이해에 기여; 따라서, 특정 RNA 분리 방법은 각각의 샘플 조건 9-12 개발되었다. 우리는 씨앗에서 RNA 분리하는 동안 억제와 RNA는 실리카 막에 결합하는 것은 심각하게 저해 것을 발견 과정을 조사 하였다. 오일, 단백질, 폴리 페놀 다량의 RNA 분리를 억제한다. 우리는 RNA 실리카 막에 결합하는 과정 전에 분해 용액으로 이들 화합물을 제거하는 RNA 추출 과정을 수정. 중요한 변형 (1.7 단계 1.8) 1 % PVP (단계 1.2) 원심 분해 용액의 상청액 수집의 첨가를 포함했다. 1 % PVP의 추가의 목적은 폴리 페놀을 제거하는 것이다. 우리가 사용하는 PVP의 효과적인 농도를 조사하고, 1 % PVP이 프로세스에 가장 효과적인 농도 인 것을 확인했다. 원심 분리를 용해 액 상등액을 수집 목적오일 및 단백질을 제거하는 것이다. 상등액을 상등액 오일 층과 튜브의 펠렛을 유지 않도록주의를 수집한다. 이러한 두 가지 간단한 변형 대폭 중간에 씨앗 개발 후기 단계 (표 1)로부터 복구, A260 / A280 비율 및 절연 RNA의 A260 / A230 비를 개선 하였다.
표준 프로토콜의 간단한 수정을 대표하는 우리의 방법은, RNA 분리에 대한 시판 키트를 사용합니다. 따라서, 우리의 방법은 염화 리튬을 사용하는 페놀 - 클로로포름 추출 및 에탄올 침전 등의 번거로운 추가 단계를 필요로하지 않고 고순도 종자로부터 RNA를 분리하는 실용적이다. 우리의 방법은 수정이 석유와 단백질이 풍부한 작물 종자 잘 작동을 나타내는, 또한 성숙한 유채와 콩 씨앗 (표 2)와 함께 사용하기에 효과적이다. 4 DAF 씨앗 (표 1)과 젊은 루트에서 RNA의 회수율의, 잎과 줄기는 우리의 방법은 기름과 단백질 가난한 조직에서 RNA 분리에 적합하지 않은 것을 나타내는, 우리의 방법을 사용 낮았다. 따라서, 방법은 그러한 종자 및 과일과 같은 오일, 단백질, 폴리 페놀을 함유하는 조직으로부터 RNA의 분리에 유리하다.
전반적으로, 우리의 방법은 RNA를 정제 페놀, 클로로포름, 또는 추가의 공정을 사용하지 않고 식물의 씨앗을 고도로 정제 된 RNA를 획득하기에 적합하다. 이 방법은 종자의 유전자 발현의 더 정확한 프로파일을 용이하게한다.
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Acknowledgments
우리는 기능 유전체학 시설과 분광법 및 Bioimaging 시설, NIBB 핵심 연구 시설 및 모델 식물 연구 시설, NIBB 생물 자원 센터의 직원을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
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