Introduction
Les plantes produisent des graines, qui donnent naissance à la prochaine génération. Graines accumulent de grandes quantités de réserves de stockage, tels que des huiles, des glucides et des protéines, pour la croissance post-germinative. Les humains utilisent les semences des réserves de stockage en tant que sources d'alimentation humaine et animale, et donc des graines de plantes sont l'un des principaux fournisseurs de la matière organique comestible dans le monde entier. L'augmentation des rendements de semences est un défi important dans la science des plantes.
Puisque les réserves de stockage des semences sont des sources de valeur commerciale de nourriture et de matériaux industriels, les mécanismes moléculaires sous - jacents de la régulation du métabolisme de ces réserves ont été largement étudiés 1-6. élucidant En outre, ces mécanismes seront utiles pour augmenter les rendements de semences dans les cultures. Les graines se développent dans les ovaires de la plante après la fécondation, et ils mûrissent à travers une série de stades de développement 1,6,7. comprendre en outre le développement de mécanisme moléculaire sous-jacent de semences nécessite détaillée, Les profils d'expression génique précises d'une série de graines en développement à produire. Toutefois, les grandes quantités d'huiles, des protéines, des glucides et des polyphénols dans les graines de la plante, il est difficile d'isoler l'ARN hautement purifié, ce qui empêche le profilage précis de l'expression génique.
Ici, nous présentons un procédé efficace pour l'isolement d'ARN à partir de graines oléagineuses contenant de grandes quantités d'huiles, de protéines et de polyphénols. En utilisant cette méthode, les chercheurs seront en mesure de préparer l'ARN hautement purifié. Un tel ARN sera utile pour le suivi des changements de transcription dans les gènes clés qui contrôlent la régulation métabolique des réserves de stockage des semences dans le développement et les oléagineux matures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Extraction de l'ARN total à partir de graines végétales
- Préparer des ensembles de tampons, des colonnes de spin, 1,5 et 2,0 ml tubes en polypropylène, et des tubes de 1,5 mL polypropylène sans nucléase.
- Ajouter 1% (p / v) de polyvinylpyrrolidone de grade biologie moléculaire (appelé ci-après PVP) à la cellule tampon de lyse pour extraction d'ARN et vortexer vigoureusement. Incuber pendant 20 min à 25 ° C pour dissoudre complètement. Au bout de 20 minutes d'incubation, mélanger doucement le tampon en faisant tourner le tube à l'envers pour empêcher la formation de bulles. Stocker à température ambiante (15-25 ° C) avant utilisation.
- Fruits de récolte de plantes d' Arabidopsis thaliana et les placer dans 1,5 ml polypropylène tubes sur la glace. Placer les fruits sur des plaques d'aluminium maintenues à 4 ° C et à isoler les graines des fruits sous un microscope stéréo.
- Placez les graines isolées (environ 200 graines) dans 1,5 ml des tubes en polypropylène qui ont été stockés dans un rack d'aluminium sur la glace et placer les tubes dans un liquide n immédiatementitrogen.
- Retirer les tubes de l'azote liquide et les retourner à la grille d'aluminium sur la glace. Ajouter 100 pi de tampon contenant 1% de PVP et centrifuger pendant 1 min à 1000 x g à 4 ° C.
- Homogénéiser l'échantillon avec un pilon en acier inoxydable en utilisant un moteur broyeur pendant 60 secondes tout en maintenant le tube dans la grille en aluminium sur la glace.
- Ajouter 550 pi de tampon contenant 1% de PVP, mélanger le tampon doucement en tournant le tube à l'envers, et incuber pendant 10 min à 25 ° C.
- Centrifuger pendant 5 min à 8000 x g à 25 ° C et de transfert 550 ul du surnageant dans un nouveau tube de polypropylene de 1,5 ml.
- Centrifuger pendant 5 min à 10 000 g à 25 ° C et de transfert 450 ul du surnageant dans un nouveau tube de polypropylene de 1,5 ml.
- En utilisant le surnageant comme le lysat cellulaire pour l'extraction d'ARN. Ci-après, suivre la procédure décrite dans les instructions du fabricant dans le kit disponible dans le commerce.
- éluerL'ARN en utilisant un volume minimal de tampon d'élution afin d'assurer une concentration suffisamment élevée de l'ARN pour surveiller les profils d'expression des transcrits de bas niveau. Stocker l'ARN dans un congélateur jusqu'à utilisation.
2. Vérification de l'ARN Qualité
- Décongeler l'ARN total, mélanger en tapotant doucement et placer le tube dans un rack en aluminium sur la glace.
- Mesurer la concentration d'ARN, le rapport A260 / A280 et le rapport A260 / A230 en utilisant un spectrophotomètre microvolume.
- Diluer l'ARN total dans l'eau sans RNase à une concentration finale de 70 ng / ul.
3. Transcription inverse de l'ARN total à partir de graines
- Décongeler les ARN et tampons totaux ensembles à partir du kit commercial. Gardez les enzymes du kit sur la glace après tapotant doucement. Préparer des tubes de 0,2 mL polypropylène sans nucléase.
- Ajouter 5 ul de l'ARN total, 1 pl de Oligo dT (50 uM), et 1 uM de Random 6-mer (50 uM) à la mL polypropy 0,2tube lene sur la glace.
- Incuber pendant 15 min à 37 ° C et placer sur la glace.
- Ci-après, suivre la procédure décrite dans les instructions du fabricant dans le kit de transcription PCR inverse.
- Placer les produits de transcription inverse sur la glace avant utilisation.
4. Analyse quantitative PCR en temps réel
- Construire des plasmides hébergeant les séquences du gène cible en utilisant le protocole du fabricant.
- Ajustez les concentrations de 100-500,000 copies / ul pour les modèles d'ADN pour les courbes standard.
- La dilution des solutions d'ADNc (1: 100) avec de l'eau distillée.
- Ajouter 2 ul des solutions d'ADNc dilué et les plasmides pour les courbes standard au mélange maître de la trousse quantitative PCR en temps réel.
- Mettre en place la PCR en temps réel en utilisant les conditions suivantes à vélo: 95 ° C pendant 30 s, puis 40 cycles à 95 ° C pendant 5 s et 60 ° C pendant 35 s.
- Analyser les nombres de copies selon l'hommeles instructions données par le fabricant du système de PCR en temps réel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous avons d' abord étudié la concentration optimale de PVP à l' aide de graines matures Arabidopsis. L'ARN total a été isolé à partir d'environ 1000 graines selon le protocole décrit ci-dessus en utilisant un tampon de lyse cellulaire contenant 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% ou 2,0% de PVP. Après homogénéisation et centrifugation, le surnageant a été recueilli , tout en évitant la couche d'huile et des débris de graines (figure 1A).
Figure 1: Evaluation de la concentration optimale de la polyvinylpyrrolidone dans le tampon de lyse des cellules. L'ARN total a été extrait avec le tampon de lyse cellulaire contenant différentes concentrations de PVP. (A) Une photographie des graines après homogénéisation et centrifugation. (B) Les graphiques de la longueur d' onde d' absorption pour chaque échantillon sont indiqués. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Les quantités et la pureté des ARN isolés ont été estimés à partir du graphique de la longueur d' onde d' absorption (figure 1B), qui a montré que 1,0% de PVP a été la concentration la plus efficace pour isoler de grandes quantités d'ARN purifié à partir de graines.
Les graines en développement ont été isolés à partir de Arabidopsis thaliana fruits sur des plaques d'aluminium pré-réfrigérés sur glace sous une (2A Figures, 2B) stéréomicroscope. Les graines ont été homogénéisés avec un pilon en acier inoxydable et d'un moteur dans un tube broyeur sur une grille d'aluminium sur de la glace (figures 2C, 2D).
2.jpg "/>
Figure 2: Isolement et homogénéisation de développer des graines d'Arabidopsis thaliana. Les graines en développement sont isolés à partir de fruits sur une plaque d'aluminium à froid sous un stéréomicroscope (A). Carpelles sont pelés du pédicule (B), et les graines en développement sont collectées. Les graines sont homogénéisées dans du tampon de lyse contenant 1% (p / v) de polyvinylpyrrolidone à l' aide d' un pilon en acier inoxydable (C) dans des tubes dans un râtelier d'aluminium refroidi sur de la glace (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
L'ARN total a été isolé à partir des graines à 4, 8 et 12 jours après la floraison (ci-après dénommé DAF) à l'aide de notre procédé récemment mis au point ou la méthode classique. Les concentrations, les rapports A260 / A280 et A260 /Les rapports de l' ARN isolé à partir de graines de 200 A230 sont présentés dans le tableau 1.
| méthode | DAF | concentration d'ARN | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Conventionnel | 4 | 72,4 ± 7,4 | 1,90 ± 0,02 | 2,27 ± 0,06 |
| 8 | 10,8 ± 3,0 | 1,50 ± 0,08 | 1,40 ± 0,17 | |
| 12 | 4,9 ± 1,7 | 1,57 ± 0,10 | 0,76 ± 0,18 | |
| Nouveau | 4 | 63,7 ± 2,6 | 2,10 ± 0,08 | 2,29 ± 0,03 |
| 8 | 46,3 ± 4,9 | 2,15 ± 0,05 | 2,23 ± 0,09 | |
| 12 | 41,77; 3.1 | 2,09 ± 0,04 | 2,17 ± 0,07 |
Tableau 1: Concentrations, ratios A260 / A280 et A260 / A230 ratios d'ARN isolé à partir de graines d' Arabidopsis. L'ARN total a été isolé à partir d'environ 200 graines (de 190 à 206 graines) à 4, 8 et 12 DAF selon la méthode classique ou de notre procédé récemment mis au point. Les concentrations d'ARN, les rapports A260 / A280 et les rapports A260 / A230 ont été mesurés. Les valeurs représentent SD ± moyenne de trois expériences indépendantes.
Les résultats montrent que notre procédé nous a permis d'isoler des ARN hautement purifiée à partir de graines 8 et 12 DAF. L'ARN total a été transcrit en inverse en ADNc, et les solutions d'ADNc ont été dilués 100 fois. Le nombre de copies de WRI1 (ridée 1: AT3G54320), SDP1 (SUCRE charge1: AT5G04040) 7 </ sup> et EIF3K (traduction facteur d'initiation eucaryote 3K: AT4G33250) comme un contrôle interne 8 ont été mesurées et les quantités relatives des transcriptions ont été estimées par quantitative en temps réel des analyses PCR (Figure 3).
Figure 3: Quantification des faibles relevés de notes de niveau dans les graines en développement. L'ARN total a été extrait à partir de 4, 8 et 12 graines DAF en utilisant notre méthode, et des solutions d'ADNc ont été préparées. Les quantités relatives de WRI1 (A) et (B) SDP1 transcrits ont été mesurés par PCR quantitative en temps réel. EIF3K a été utilisé comme témoin interne. Les valeurs représentent SD de trois expériences indépendantes signifie. DAF; jours après la floraison. S'il vous plaît cliquez sur ilre pour voir une version plus grande de cette figure.
Bien que les quantités de wri1 et SDP1 transcriptions sont relativement faibles dans les graines en développement, il a été possible de détecter des changements d'expression entre les graines à différents stades de développement. Pour vérifier que notre méthode peut être utilisée dans d' autres graines oléagineuses, l' ARN total a été isolé à partir de graines matures de Brassica napus , Glycine max et. Les concentrations d'ARN, les rapports A260 / A280 et les rapports A260 / A230 sont présentés dans le tableau 2.
| méthode | Plante | concentration d'ARN | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Conventionnel | B. napus | 7,7 ± 0,8 | 1,5 ± 0,12 | 0,75 ± 0,11 |
| G. max | 1,61 ± 0,06 | 0,69 ± 0,09 | ||
| Nouveau | B. napus | 143,2 ± 19,0 | 2,17 ± 0,03 | 2,23 ± 0,13 |
| G. max | 152,3 ± 4,4 | 2,17 ± 0,02 | 2,30 ± 0,02 |
Tableau 2: Concentrations, ratios A260 / A280 et A260 / A230 rapports d'ARN isolés à partir de graines matures de Brassica napus et Glycine max. L' ARN total a été isolé à partir d' environ 100 mg de Brassica napus et Glycine max graines en utilisant la méthode classique ou notre nouvelle méthode. Les graines ont été préalablement broyés grossièrement et on homogénéise avec un mortier et un pilon refroidis dans de l'azote liquide. Les concentrations d'ARN, A260 / A280 rapports, et les rapports A260 / A230 ont été mesurés. Les valeurs représentent SD ± moyenne de trois expériences indépendantes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
les profils d'expression des gènes contribuent à notre compréhension de la physiologie des plantes; Par conséquent, les méthodes d'isolement d'ARN spécifiques ont été développés pour chaque condition échantillon 9-12. Nous avons étudié les processus qui ont été inhibée lors de l'isolement de l'ARN à partir de graines et ont trouvé que la liaison ARN aux membranes de silice a été sévèrement inhibée. De grandes quantités d'huile, les protéines et les polyphénols inhibent l'isolement de l'ARN. Nous avons modifié le processus d'extraction de l'ARN pour éliminer ces composés avec une solution de lyse avant que le processus de liaison d'ARN aux membranes de silice. Les importantes modifications comprenaient l'addition de 1% de PVP (étape 1.2) et la collecte du surnageant de la solution de lyse centrifugée (étapes 1.7, 1.8). Le but de l'addition de 1% de PVP est d'éliminer les polyphénols. Nous avons examiné la concentration la plus efficace de PVP à utiliser et a confirmé que 1% de PVP est la concentration la plus efficace pour ce processus. Le but de recueillir le surnageant de la solution de lyse centrifugéeest d'enlever l'huile et des protéines. Le surnageant doit être prélevé avec soin pour éviter de conserver une couche d'huile dans le surnageant et le culot dans le tube. Ces deux modifications simples considérablement amélioré la récupération, les rapports A260 / A280, et les rapports de l'ARN isolé A260 / A230 à partir de graines au milieu et les phases tardives de développement (tableau 1).
Notre méthode, qui représente une simple modification du protocole standard, utilisant des kits disponibles dans le commerce pour l'isolement de l'ARN. Ainsi, notre méthode est pratique pour l'isolement d'ARN hautement purifiée à partir de graines, sans le besoin d'étapes supplémentaires lourdes telles que l'extraction au phénol-chloroforme et précipitation à l'éthanol en utilisant du chlorure de lithium. Notre méthode est également efficace pour une utilisation avec le colza matures et les graines de soja (tableau 2), ce qui indique que les modifications fonctionnent bien pour les semences de cultures de pétrole et riches en protéines. Les taux de 4 graines DAF (tableau 1) et les jeunes racines récupération de l' ARNs, feuilles et tiges ont été inférieurs à l'aide de notre procédé, ce qui indique que notre procédé ne convient pas pour l'isolement d'ARN à partir de tissus qui sont pauvres en huile et des protéines. Par conséquent, le procédé est avantageux que pour l'isolement de l'ARN à partir de tissus contenant de l'huile, protéines et les polyphénols, tels que les semences et les fruits.
Dans l'ensemble, notre procédé est approprié pour l'acquisition d'ARN hautement purifiée à partir de graines de plantes sans l'utilisation de phénol, de chloroforme ou d'autres procédés pour la purification de l'ARN. Cette méthode permet de faciliter le profilage plus précise de l'expression génétique dans les graines.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous remercions le personnel de Génomique Fonctionnelle Facility et spectrographie et Bioimaging Facility, Nibb de base des installations de recherche, et des installations Model Plant Research, Nibb bioressources Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
