Introduction
Le piante producono semi, che danno origine alla generazione successiva. I semi accumulano grandi quantità di riserve di stoccaggio, come gli oli, carboidrati e proteine, per la crescita post-germinativo. Gli esseri umani utilizzano le riserve di stoccaggio di semi come fonti di alimenti e mangimi, e quindi semi di piante sono uno dei principali fornitori di materia organica commestibili in tutto il mondo. Aumentare le rese di semi è una sfida importante in scienza delle piante.
Poiché le riserve di riserva dei semi sono valore commerciale fonti di cibo e materiali industriali, i meccanismi molecolari alla base della regolazione del metabolismo di queste riserve sono stati ampiamente studiati 1-6. Ulteriori chiarire questi meccanismi sarà utile per aumentare le rese di semi di colture. I semi si sviluppano in ovaie di piante dopo la fecondazione, e maturano attraverso una serie di fasi di sviluppo 1,6,7. Inoltre la comprensione del meccanismo molecolare dello sviluppo del seme di base richiede dettagliata, Precisi profili di espressione genica di una serie di sviluppo semi da produrre. Tuttavia, elevate quantità di oli, proteine, carboidrati e polifenoli in semi di piante rendono difficile isolare RNA altamente purificato, che preclude precisa profili di espressione genica.
Qui, si introduce un metodo efficiente per l'isolamento di RNA da semi oleosi contenenti grandi quantità di oli, proteine e polifenoli. Usando questo metodo, i ricercatori saranno in grado di preparare RNA altamente purificato. Tale RNA sarà utile per il monitoraggio dei cambiamenti trascrizionali di geni chiave che controllano la regolazione del metabolismo delle riserve di stoccaggio di semi in via di sviluppo e dei semi oleosi maturi.
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Protocol
1. Estrazione di RNA totale da Pianta semi
- Preparare i set di tampone, colonne di rotazione, 1,5 e 2,0 ml tubi di polipropilene, e tubi da 1,5 ml in polipropilene priva di nucleasi.
- Aggiungere 1% (w / v) di biologia molecolare grado polivinilpirrolidone (di seguito denominato PVP) per cella tampone di lisi per l'estrazione di RNA e vortice vigorosamente. Incubare per 20 minuti a 25 ° C per sciogliere completamente. Dopo 20 min di incubazione, miscelare il buffer delicatamente ruotando il tubo capovolto per evitare la formazione di bolle. Conservare a temperatura ambiente (15-25 ° C) prima dell'uso.
- Raccolta della frutta dalle piante di Arabidopsis thaliana e posto in provette da 1,5 ml in polipropilene su ghiaccio. Inserire frutta su lastre di alluminio conservati a 4 ° C ed isolano semi dai frutti sotto un microscopio stereo.
- Mettere i semi isolati (circa 200 semi) in provette da 1,5 ml in polipropilene che sono stati memorizzati in un rack di alluminio sul ghiaccio e collocare immediatamente i tubi in n liquidoitrogen.
- Rimuovere le provette e azoto liquido e restituirli al rack alluminio su ghiaccio. Aggiungere 100 microlitri di tampone contenente 1% PVP e centrifugare per 1 min a 1000 xga 4 ° C.
- Omogeneizzare il campione con un pestello in acciaio legato con un motore-smerigliatrice per 60 s, mantenendo il tubo nel rack alluminio su ghiaccio.
- Aggiungere 550 microlitri di tampone contenente 1% PVP, miscelare il buffer delicatamente ruotando il tubo capovolto, e incubare per 10 min a 25 ° C.
- Centrifugare per 5 min a 8000 xga 25 ° C ed il trasferimento 550 ml del surnatante in una nuova provetta 1,5 ml di polipropilene.
- Centrifugare per 5 min a 10.000 xga 25 ° C ed il trasferimento 450 ml del surnatante in una nuova provetta 1,5 ml di polipropilene.
- Utilizzare il surnatante come lisato cellulare per l'estrazione di RNA. D'ora in avanti, seguire la procedura descritta nelle istruzioni del produttore del kit disponibile in commercio.
- eluire ilRNA utilizzando un volume minimo di tampone di eluizione per garantire una sufficiente concentrazione di RNA per il monitoraggio dei pattern di espressione di trascritti di basso livello. Conservare il RNA in un congelatore fino all'uso.
2. Verifica di RNA Qualità
- Scongelare l'RNA totale, mescolare delicatamente intercettazioni, e porre il tubo in un rack di alluminio sul ghiaccio.
- Misurare la concentrazione di RNA, il rapporto A260 / A280, e il rapporto A260 / A230 utilizzando uno spettrofotometro microvolumi.
- Diluire il RNA totale in acqua priva di RNasi ad una concentrazione finale di 70 ng / mL.
3. trascrizione inversa di RNA totale da Seeds
- Scongelare gli RNA e tampone set totali dal kit commerciale. Mantenere gli enzimi del kit sul ghiaccio dopo lieve intercettazioni. Preparare le provette 0,2 ml in polipropilene priva di nucleasi.
- Aggiungere 5 ml di RNA totale, 1 ml di Oligo dT Primer (50 micron), e 1 micron di Random 6-mer (50 micron) al 0,2 ml polipropiTubo lene sul ghiaccio.
- Incubare per 15 minuti a 37 ° C e disporli sul ghiaccio.
- D'ora in avanti, seguire la procedura descritta nelle istruzioni del produttore nel kit di trascrizione inversa-PCR.
- Posizionare i prodotti di trascrizione inversa sul ghiaccio prima dell'uso.
4. Analisi quantitativa Real-time PCR
- Costruire plasmidi che ospitano le sequenze di geni bersaglio utilizzando il protocollo del produttore.
- Regolare le concentrazioni di 100-500,000 copie / ml per i modelli di DNA per le curve standard.
- Diluire le soluzioni cDNA (1: 100) con acqua distillata.
- Aggiungere 2 ml di soluzioni cDNA diluiti e plasmidi per le curve standard al master mix dal real-time PCR quantitativa kit.
- Impostare PCR in tempo reale utilizzando le seguenti condizioni di ciclismo: 95 ° C per 30 s e poi 40 cicli a 95 ° C per 5 s e 60 ° C per 35 s.
- Analizzare i numero di copie secondo l'uomoistruzioni di produttori di realizza- re per il sistema PCR in tempo reale.
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Representative Results
In primo luogo abbiamo studiato la concentrazione ottimale di PVP utilizzando Arabidopsis semi maturi. L'RNA totale è stato isolato da circa 1.000 semi secondo il protocollo descritto sopra utilizzando tampone di lisi cellulare contenente 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% o 2,0% PVP. Dopo omogeneizzazione e centrifugazione, il surnatante è stato raccolto evitando lo strato di olio di semi e detriti (Figura 1A).
Figura 1: Stima della concentrazione ottimale polivinilpirrolidone nel buffer di lisi cellulare. RNA totale è stato estratto con il tampone di lisi cellulare contenente diverse concentrazioni di PVP. (A) Una fotografia dei semi dopo omogeneizzazione e centrifugazione. (B) I grafici di lunghezza d'onda di assorbanza per ciascun campione sono indicati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Le quantità e la purezza di RNA isolati sono stati stimati dal grafico della lunghezza d'onda di assorbanza (Figura 1B), che ha dimostrato che 1,0% PVP era la concentrazione più efficace per isolare grandi quantità di RNA purificato da semi.
Semi in via di sviluppo sono stati isolati da frutti Arabidopsis thaliana su lastre di alluminio pre-refrigerati su ghiaccio sotto un (2A figure, 2B) stereomicroscopio. I semi sono stati omogeneizzati con un pestello in acciaio inox e motore-smerigliatrice in un tubo su un supporto di alluminio su ghiaccio (figure 2C, 2D).
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Figura 2: Isolamento e omogeneizzazione di sviluppare semi di Arabidopsis thaliana. Semi in via di sviluppo sono isolati da frutta su una lastra di alluminio fredda allo stereomicroscopio (A). Carpelli sono pelati dal peduncolo (B), ed i semi in via di sviluppo sono raccolti. I semi vengono omogeneizzati in tampone di lisi contenente 1% (w / v) polivinilpirrolidone con un pestello in acciaio inossidabile (C) in provette in un rack di alluminio raffreddata in ghiaccio (D). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
L'RNA totale è stato isolato dai semi a 4, 8, e 12 giorni dopo la fioritura (di seguito denominato DAF) con il nostro metodo di nuova concezione o il metodo convenzionale. Le concentrazioni, rapporti A260 / A280 e A260 /Rapporti A230 di RNA isolati da 200 semi sono riportati in Tabella 1.
| metodo | DAF | concentrazione di RNA | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Convenzionale | 4 | 72.4 ± 7.4 | 1.90 ± 0.02 | 2.27 ± 0.06 |
| 8 | 10.8 ± 3.0 | 1,50 ± 0,08 | 1.40 ± 0.17 | |
| 12 | 4.9 ± 1.7 | 1.57 ± 0.10 | 0,76 ± 0,18 | |
| Nuovo | 4 | 63.7 ± 2.6 | 2.10 ± 0.08 | 2.29 ± 0.03 |
| 8 | 46.3 ± 4.9 | 2.15 ± 0.05 | 2.23 ± 0.09 | |
| 12 | 41.77; 3.1 | 2.09 ± 0.04 | 2.17 ± 0.07 |
Tabella 1: Concentrazioni, rapporti A260 / A280 e A260 / A230 rapporti di RNA isolata dai semi di Arabidopsis. L'RNA totale è stato isolato da circa 200 semi (da 190 a 206 semi) a 4, 8, e 12 DAF utilizzando il metodo convenzionale o il nostro metodo di nuova concezione. Le concentrazioni di RNA, rapporti A260 / A280, A260 e rapporti / A230 sono stati misurati. I valori rappresentano SD ± media di tre esperimenti indipendenti.
I risultati mostrano che il nostro metodo ci ha permesso di isolare l'RNA altamente purificata da 8 e 12 semi DAF. L'RNA totale è stato retrotrascritto in cDNA, e le soluzioni di cDNA sono stati diluiti 100 volte. Il numero di copie di WRI1 (rugose 1: AT3G54320), SDP1 (zucchero DEPENDENT1: AT5G04040) 7 </ sup>, e EIF3K (traduzione eucariotica fattore di iniziazione 3K: AT4G33250) come controllo interno 8 sono stati misurati, e le quantità relative di trascrizioni sono stati stimati mediante real-time PCR quantitativa analisi (Figura 3).
Figura 3: Quantificazione di trascrizioni di basso livello in semi in via di sviluppo. L'RNA totale è stato estratto da 4, 8, e 12 semi DAF con il nostro metodo, e soluzioni di cDNA sono stati preparati. Le quantità relative di WRI1 (A) e SDP1 trascritti (B) sono state misurate mediante quantitativa PCR in tempo reale. EIF3K è stato utilizzato come controllo interno. I valori rappresentano significare SD di tre esperimenti indipendenti. DAF; giorni dopo la fioritura. Si prega di cliccare luinuovamente per vedere una versione più grande di questa figura.
Anche se la quantità di WRI1 e SDP1 trascrizioni sono relativamente bassi nei semi in via di sviluppo, è stato possibile rilevare i cambiamenti di espressione tra i semi a diversi stadi di sviluppo. Per verificare che il metodo può essere utilizzato in altri semi oleosi, l'RNA totale è stato isolato da semi maturi di Brassica napus e Glycine max. Le concentrazioni di RNA, rapporti A260 / A280, A260 e rapporti / A230 sono riportati nella tabella 2.
| metodo | pianta | concentrazione di RNA | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Convenzionale | B. napus | 7.7 ± 0.8 | 1.5 ± 0.12 | 0.75 ± 0.11 |
| G. max | 1.61 ± 0.06 | 0.69 ± 0.09 | ||
| Nuovo | B. napus | 143.2 ± 19.0 | 2.17 ± 0.03 | 2.23 ± 0.13 |
| G. max | 152,3 ± 4.4 | 2.17 ± 0.02 | 2.30 ± 0.02 |
Tabella 2: le concentrazioni, rapporti A260 / A280 e A260 / A230 rapporti di RNA isolati da semi maturi di Brassica napus e Glycine max. L'RNA totale è stato isolato da circa 100 mg di Brassica napus e Glycine max semi utilizzando il metodo convenzionale o il nostro metodo di nuova concezione. I semi sono stati precedentemente schiacciati e circa omogeneizzato con un mortaio e pestello raffreddato in azoto liquido. Le concentrazioni di RNA, A260 / A280 rapporti, e rapporti A260 / A230 sono stati misurati. I valori rappresentano SD ± media di tre esperimenti indipendenti.
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Discussion
profili di espressione genica contribuiscono alla nostra comprensione della fisiologia vegetale; Pertanto, metodi di isolamento specifica di RNA sono stati sviluppati per ogni condizione di esempio 9-12. Abbiamo studiato i processi che sono stati inibiti durante l'isolamento di RNA dai semi e ha scoperto che l'RNA di legame alle membrane di silice è stato gravemente inibito. Grandi quantità di olio, proteine e polifenoli inibiscono l'isolamento di RNA. Abbiamo modificato il processo di estrazione di RNA per rimuovere questi composti con una soluzione di lisi prima che il processo di RNA legame alle membrane di silice. Le modifiche importanti inclusa l'aggiunta di 1% PVP (passo 1.2) e la raccolta del surnatante dalla soluzione di lisi centrifugato (passi 1.7, 1.8). Lo scopo dell'aggiunta di 1% PVP è rimuovere polifenoli. Abbiamo esaminato la concentrazione più efficace di PVP da utilizzare e confermato che 1% PVP è la concentrazione più efficace per questo processo. Lo scopo di raccogliere il surnatante dalla soluzione di lisi centrifugatoè quello di rimuovere l'olio e proteine. Il surnatante deve essere raccolto con attenzione per evitare mantenendo un livello dell'olio nel surnatante ed il pellet nel tubo. Queste due semplici modifiche drasticamente migliorato il recupero, rapporti A260 / A280 e A260 rapporti / A230 della RNA isolata dai semi al centro e fasi tardive di sviluppo (Tabella 1).
Il nostro metodo, che rappresenta una semplice modifica del protocollo standard, utilizza kit disponibili in commercio per l'isolamento di RNA. Così, il nostro metodo è pratico per isolare l'RNA altamente purificato da semi senza la necessità di ulteriori passaggi ingombranti come estrazione con fenolo-cloroformio e precipitazione con etanolo usando cloruro di litio. Il nostro metodo è efficace anche per l'uso con colza matura e semi di soia (Tabella 2), indicando che le modifiche funzionano bene per i semi delle colture petrolio e ricchi di proteine. I tassi di recupero di RNA da 4 semi DAF (Tabella 1) e giovani radices, foglie e steli erano inferiori con il nostro metodo, indicando che il metodo non è adatto per l'isolamento di RNA da tessuti che sono poveri in olio e proteine. Pertanto, il metodo è vantaggioso solo per l'isolamento di RNA dai tessuti contenenti olio, proteine e polifenoli, come semi e frutti.
Nel complesso, il nostro metodo è adatto per acquisire RNA altamente purificato da semi di piante senza l'uso di fenolo, cloroformio, o processi aggiuntivi per la purificazione dell'RNA. Questo metodo faciliterà più precisa profili di espressione genica in semi.
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Acknowledgments
Ringraziamo lo staff di Genomica Funzionale Struttura e Spettrografia e Bioimmagini strumento, nibb fondamentali strutture di ricerca, e modello di ricerca delle piante Fondo, nibb Bioresource Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
