Siamo riusciti a stabilire un metodo per l'isolamento dell'RNA da semi di piante contenenti grandi quantità di oli, proteine e polifenoli, che hanno effetti inibitori sull'isolamento dell'RNA ad alta purezza. Il nostro metodo è adatto per monitorare l'espressione di geni con trascritti di basso livello nei semi.
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Articolo metodologico
Un metodo efficace per l'isolamento di RNA altamente purificato da semi per l'utilizzo in Quantitative Analysis trascrittoma
In questo articolo
Sommario
Abstract
I semi delle piante accumulano grandi quantità di riserve di stoccaggio che comprendono materia organica biodegradabile. Gli esseri umani fanno affidamento sulle riserve di stoccaggio delle sementi per il cibo e come materiali industriali. I profili di espressione genica sono strumenti potenti per studiare la regolazione metabolica nelle cellule vegetali. Pertanto, per la selezione delle colture sono necessari profili di espressione genica dettagliati e accurati durante lo sviluppo delle sementi. L'acquisizione di RNA altamente purificato è essenziale per la produzione di questi profili. Sono necessari metodi efficienti per isolare l'RNA altamente purificato dai semi. Qui, descriviamo un metodo per isolare l'RNA da semi contenenti grandi quantità di oli, proteine e polifenoli, che hanno effetti inibitori sull'isolamento dell'RNA ad alta purezza. Il nostro metodo consente di ottenere RNA altamente purificato dai semi senza l'uso di fenolo, cloroformio o processi aggiuntivi per la purificazione dell'RNA. Questo metodo è applicabile ai semi di Arabidopsis, colza e soia. Il nostro metodo sarà utile per monitorare i pattern di espressione di trascritti di basso livello in semi in via di sviluppo e maturi.
Introduzione
Le piante producono semi, che danno origine alla generazione successiva. I semi accumulano grandi quantità di riserve di stoccaggio, come gli oli, carboidrati e proteine, per la crescita post-germinativo. Gli esseri umani utilizzano le riserve di stoccaggio di semi come fonti di alimenti e mangimi, e quindi semi di piante sono uno dei principali fornitori di materia organica commestibili in tutto il mondo. Aumentare le rese di semi è una sfida importante in scienza delle piante.
Poiché le riserve di riserva dei semi sono valore commerciale fonti di cibo e materiali industriali, i meccanismi molecolari alla base della regolazione del metab....
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Protocollo
1. Estrazione di RNA totale da Pianta semi
- Preparare i set di tampone, colonne di rotazione, 1,5 e 2,0 ml tubi di polipropilene, e tubi da 1,5 ml in polipropilene priva di nucleasi.
- Aggiungere 1% (w / v) di biologia molecolare grado polivinilpirrolidone (di seguito denominato PVP) per cella tampone di lisi per l'estrazione di RNA e vortice vigorosamente. Incubare per 20 minuti a 25 ° C per sciogliere completamente. Dopo 20 min di incubazione, miscelare il buffer delicatamente ruotando il tubo capovolto per evitare la formazione di bolle. Conservare a temperatura ambiente (15-25 ° C) prima dell'uso.
- Raccolta della frutta dalle pi....
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Risultati
In primo luogo abbiamo studiato la concentrazione ottimale di PVP utilizzando Arabidopsis semi maturi. L'RNA totale è stato isolato da circa 1.000 semi secondo il protocollo descritto sopra utilizzando tampone di lisi cellulare contenente 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% o 2,0% PVP. Dopo omogeneizzazione e centrifugazione, il surnatante è stato raccolto evitando lo strato di olio di semi e detriti (Figura 1A).
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Discussione
profili di espressione genica contribuiscono alla nostra comprensione della fisiologia vegetale; Pertanto, metodi di isolamento specifica di RNA sono stati sviluppati per ogni condizione di esempio 9-12. Abbiamo studiato i processi che sono stati inibiti durante l'isolamento di RNA dai semi e ha scoperto che l'RNA di legame alle membrane di silice è stato gravemente inibito. Grandi quantità di olio, proteine e polifenoli inibiscono l'isolamento di RNA. Abbiamo modificato il processo di estrazion.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo lo staff di Genomica Funzionale Struttura e Spettrografia e Bioimmagini strumento, nibb fondamentali strutture di ricerca, e modello di ricerca delle piante Fondo, nibb Bioresource Center.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polivinilpirrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| OMOGENEIZZATORE S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| Kit di reagenti PrimeScript RT (perfetto in tempo reale) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Kit qPCR veloce | Kapa biosystems | KK4601 |
Riferimenti
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J.
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Ristampe e permessi
