Magnetisk Levitation Sammen med Portable Imaging og Analyse for sygdomsdiagnostik

Introduction

Her præsenteres en teknologisk platform og en teknik, der anvender magnetisk levitation koblet med automatiseret billeddannelse og analyse til at analysere tætheden distribution af en patients celler som en indikator for sygdom. Denne alsidige fremgangsmåde til densitet-baserede cytometrisk analyse kan i sidste ende anvendes til en række diagnostik sygdomstilstande. Men for at være forenelig med point-of-care test og brug i udviklingslandene, skal teknikken opfylde kravene til lave omkostninger, portabilitet og brugervenlighed. Enheden og forbrugsstoffer skal let opnås til en lav pris. Forberedelsen Prøven skal være enkel, bør analyse automatiseres med minimale krav til brugerinput eller fortolkning, og resultaterne skal returneres hurtigt. Endvidere skal anordningen være kompakt og bærbar at være nyttige i kliniske omgivelser samt udviklingslande. Således har vi udviklet et apparat og metode til at bruge magnetisk levitation i point-of-care-kompatibel teknologi ved kobling automatiseret billedbehandling og billedanalyse at returnere resultater vedrørende tætheden fordeling af en population af en patients celler.

Point-of-care teknologier giver en bemærkelsesværdig fordel i forhold til de nuværende kliniske procedurer laboratorieundersøgelser. Den eksisterende teknologis er for dyrt at være ejet af en kliniker eller for komplekse til at blive udført af medicinsk personale. Mange af disse procedurer kræver arbejdskraftintensive protokoller, som skal udføres af en uddannet tekniker. Af disse grunde er patientprøver såsom blod eller urin generelt indsamlet i lægens kontor derefter overført til en fjern, centraliseret laboratorium til klinisk afprøvning, der kan tage flere dage for lægen at modtage resultaterne af testen. Dette kan medføre forsinkelser eller komplikationer i løbet af behandlingen i nogle tilfælde gør denne test meget dyrt og ineffektivt (forårsager en økonomisk byrde for forsikring betalere), og yderligere gør mangediagnostik utilgængelige i ressourcesvage indstillinger og udviklingslande.

Her præsenteres en magnetisk levitation teknik kombineret med automatiseret billeddannelse og analyse i både en enhed med indbygget billedbehandling og forarbejdning (figur 1) og en indretning smartphone-kompatibel (figur 2). Disse magnetiske levitation-baserede enheder repræsenterer en bredt anvendelig platform teknologi, som har potentialet til at blive anvendt på en række forskellige medicinske diagnostiske anvendelser. De magnetiske funktioner tilgang levitation baseret på en ligevægt mellem to kræfter: en magnetisk kraft og en opdriftskraft ^{1, 2, 3.} Når en partikel er suspenderet i en paramagnetisk medium og indsat i et magnetfelt genereret af to magneter med ens poler vender mod hinanden, en magnetisk kraft virker på partiklen i retningen mod midterlinien mellem de to MAGN ets. Opdriften er forårsaget af den relative massefylde af partiklen i forhold til suspensionsmediet og er opad i tilfælde af partikler mindre tætte end mediet og nedad i tilfælde af partikler med højere densitet end det omgivende medium. Baseret på disse to kræfter, vil partiklerne når en ligevægt levitation position inden der afbalancerer disse to kræfter; denne stilling er direkte relateret til densiteten af ​​partiklen, med tungere partikler leviterende lavere i marken end mindre tætte partikler. Et billeddannende modul, enten et indbygget smartphone kamera ^{4, 5, 6} eller uafhængige optiske komponenter udstyret med en forstørrelseslinse ^{7, 8,} anvendes til at visualisere placeringen af partiklerne. Billedbehandling, enten via en smartphone-applikation ^{4, 5,}= "xref"> 6 eller en indlejret processeringsenhed ^{7, 8,} fremgangsmåder derefter det optagne billeder til at kvantificere den rumlige fordeling og dermed tætheden fordeling af befolkningen. For at analysere større prøver (såsom dem med kun et par partikler af interesse per milliliter, kan flowet integreres direkte i enheden sådanne partiklerne leviteret og analyseres som de passerer gennem den billeddannende region (figur 2).

Figur 1: Selvstændig Magnetic Levitation Platform. (A) Kompakt magnetisk levitation enhed, herunder en magnetisk fokus modul, billedbehandling komponenter (en lysdiode (LED), en optisk linse, og et kamera detektor), og en behandlingsenhed med en skærm. (B) Magnetisk feltstyrke på cross-sektion af området mellem magneterne hvor der er indsat prøven. Feltstyrken er størst ved overfladen af ​​magneterne og nærmer sig nul på midterlinien mellem dem. (C) partikler, såsom celler, inden for de magnetiske felt opleve flere kræfter: en magnetisk kraft (F _m) mod midterlinien mellem magnetisme, med størrelsesorden varierende på basis af positionen af partiklen; en tyngdekraft (F _G '), som afhænger af partikel tæthed i forhold til den for suspenderingsmedium, og en friktionskraft (F _d) modsætter partiklen bevægelse. Gengivet med tilladelse fra Yenilmez, et al. ⁸ Klik her for at se en større version af dette tal.

figure 2: Smartphone-kompatibel Flow-assisteret Magnetic Levitation Platform. (A - c) Front (a), side (b), og tilbage (c) visninger af magnetisk levitation indretning (d) Komponenterne af indretningen omfatter: 1) Magnetisk levitation modul, herunder permanente magneter, en forstørrelseslinse, og en LED og lysspreder, 2) smartphone case, 3) elektronik, herunder en microcontroller, pumpe driver, og Bluetooth-modtager, 4) mikro-pumpe holder, 5) justerbar blænde, 6) affald rør holder, 7) batteriholder, 8 ) prøve indehaver, 9) dobbelt formål stativ og låg. (E) Flow skematisk viser pumpning af prøven gennem magnetfeltet. (F) Tværsnit af den magnetiske levitation modul, der viser, hvordan partikler med forskellige densiteter vil bringe som de er pumpet gennem feltet; mindre tætte partikler, såsom Particle 1, vil ligevægt ved en højere levitation højde tHan tættere partikler, såsom Partikel 2. Gengivet med tilladelse fra Amin, et al. ¹ Klik her for at se en større version af dette tal.

De minimumskrav til brug af enhver prøve til distribution density analyse i dette system omfatter muligheden for at opnå en suspension af celler eller partikler større end ca. 5 um og mindre end ca. 250 um i størrelse (for billedbehandling og billedbehandling) og dens forenelighed med blanding i en opløsning af en paramagnetisk opløsning såsom den gadobutrol bruges her. Til diagnostik sygdomstilstande, kompatible programmer indbefatter dem, hvori (i) celler af interesse i sig selv har en ændret densitet når de bærer en sygdom sammenlignet med raske kontroller, (ii) en densitet ændring kan induceres i cellen ved tilsætning af et reagens eller nogle alternativ behandling for en kort icubation tid, eller (iii) forskellige celletyper bliver identificeret i en enkelt prøve, og i sagens natur (eller via nogle behandling) har unikke karakteristiske tætheder.

Seglcellesygdom er en genetisk sygdom forårsager en muteret form af hæmoglobin, HbS, der skal produceres i en persons røde blodlegemer (RBC), hvilket kan resultere i intermitterende vasookklusive begivenheder og kronisk hæmolytisk anæmi ^9. Det er diagnosticeret ved hjælp af enten hæmoglobin isoelektrisk fokusering, højtydende væskekromatografi (HPLC) fraktionering eller hæmoglobin elektroforese som er meget præcis, men skal udføres i et klinisk laboratorium, fordi de er uforenelige med point-of-care-indstillinger. Opløselighed og papirbaserede test for seglcelleanæmi er blevet foreslået, men generelt kræver subjektive bruger fortolkning og bekræftende test. Her bruger vi en massefylde tilgang til at identificere segl RBC, som opnår en højere densitet end RBCs fra folk uden seglcelleanæmi. Den mekanisme involverer polymerisation af den muterede form af hæmoglobin, HbS, som forårsager RBC dehydrering i seglcellesygdom RBC'er under deoxygeneret betingelser ^{10, 11, 12, 13.}

Kan også anvendes denne tæthed tilgang til at adskille celler af forskellige typer på grundlag af massefylde: hvide blodlegemer (WBCs) og RBC'er ^7. WBCs er generelt ansvarlige for at bekæmpe infektioner i kroppen. WBC cytometri kan anvendes til at kvantificere antallet af disse celler i blodet og fungerer som en nyttig diagnostisk værktøj. WBC tæller højere end normalt (generelt anses for større end 11.000 celler pr uL) kan indikere infektion, immunsystemet lidelser, eller leukæmi. WBC-tal under normalområdet (omkring 3.500 celler pr pi) kan være forårsaget af autoimmune lidelser eller conditioner, som skader knoglemarv. I modsætning til alternative teknologier, er den proces, der præsenteres her ikke stole på lyse af de røde blodlegemer eller pletter for at identificere WBCs. Denne celle-baseret test drager fordel af de unikke iboende densiteter af de to celletyper til at udføre separation, som WBC befolkningstæthed er blevet rapporteret at være lavere end den RBC befolkning som beregnet tidligere anvendelse af densitetsgradientcentrifugering ^{2, 3.}

Sammenlignet med alterative testning på fjerne steder, denne test er hurtig, med simpel prøveforberedelse (figur 3), adskillelse af celler i indretningen inden for 10 - 15 min, og automatiseret billeddannelse og analyse, der kræver mindre end 1 min. På denne måde kan enheden returnere resultater hurtigt for bedre at informere medicinske beslutninger, tillade behandling, der skal administreres straks at lindre fysisk og psykisk smerte, og mindske risikoen for komplikationer associeredeated med en forsinkelse i medicinsk behandling. Denne teknik kan udføres på stedet, enten i kliniske omgivelser på grund af simpel prøveforberedelse og automatiseret billedbehandling og analyse, der returnerer et resultat med minimal brugerinput eller fortolkning. På grund af anvendelsen af ​​en enkel fremgangsmåde ved anvendelse permanente magneter til prøveanalyse og anvendelse af enten en smartphone eller simple elektriske komponenter til billeddannelse og billedbehandling, enheden samt omkostningerne pr-test er minimale sammenlignet med nogle sofistikerede testprocedurer.

Protocol

Etisk Statement: Alle procedurer, der involverer humane blodprøver blev udført i henhold til de institutionelle bestemmelser. Alle protokoller blev revideret og godkendt af Institutional Review Board. En informeret samtykke blev givet af alle deltagere.

1. Prøve Forberedelse til seglcellesygdom Diagnose ^{5, 8}

1. Forbered en 50 mM opløsning af gadobutrol i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
2. Opløs 10 mM natriummetabisulfit i gadolinium opløsning.
   BEMÆRK: Natriummetabisulfit er giftig ved indånding og stærkt irriterer hud og væv. Det er en ætsende syre ved blanding med vand. Det kan dekomponere til at udsende giftige oxide røg af svovl og natrium, når det opvarmes til høje temperaturer.
3. Opnå blodprøve via enten fingerprik eller venepunktur.
   1. Tegn blod ved hjælp af en fingerprikker med en ren, engangs lancet. Aplags pres nær gennemboret stedet og tørre blodet dråbe dannede tre til fire gange, før opsamling af blod ved hjælp af en pipette; passe på ikke at "mælk" fingeren ved at klemme væv, da dette vil medføre kontaminering af prøven med vævsvæske.
   2. Alternativt trække blod ved hjælp af standard blodprøvetagning ^14.
      BEMÆRK: Hvis prøverne skal opbevares i mere end et par timer, indsamle blodet ind i en vacutainer med en antikoagulant, såsom EDTA.
4. Tilføj mindre end 1 pi blod til 100 pi af gadolinium-natriummetabisulfit-opløsning.

2. Prøve Forberedelse til WBC cytometri ⁷

1. Opnå blodprøve via enten fingeren eller venepunktur, som i afsnit 1.
2. Valgfrit: Lyse RBC med en RBC lysis buffer. Afpipetteres 5 pi blod i 500 pi RBC lysebuffer og inkuberes ved stuetemperatur i 3 - 5 min.
   BEMÆRK:dette kan gøres for at bekræfte levitation vifte af en isoleret population af WBCs. Det er dog ikke nødvendigt at udføre dette trin, da resultaterne præsenteret her viser, at RBC svæve på en markant lavere position end WBCs.
3. Fortynd fuldblod 1: 1.000 i 25 mM Gd i HBSS
   NB: hvis cellelyse blev udført, fortyndes den lyserede prøve 9: 1 lyserede prøve: 250 mM Gd at opnå en prøve indeholdende 25 mM Gd.

3. Analyse af prøver Brug af Magnetic Levitation Platform ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Start den magnetiske levitation enhed:
   1. For den selvstændige enhed, tilslutte enheden, gør det muligt at magten op, og læg på en flad, plan overflade.
   2. For den version smartphone-kompatibel, starte programmet smartphone og skubbe til venstre for at indtaste billedecapture mode, og sted på en plan, vandret overflade.
2. For statisk magnetisk levitation:
   1. Indlæse forberedt prøve i et kvadratisk glas mikrokapillære rør ved at dyppe ende i opløsningen og lade prøven fylde kapillaret via kapillarvirkning.
   2. Forsegle enden med et rør tætningsmiddel ved langsomt at trykke den ene ende kapillarrøret i materialet.
   3. Indsæt kapillarrøret mellem magneterne i den magnetiske levitation enhed, så kun 1 cm af røret forbliver synlig (se figur 3 for en illustration prøvefremstillingen).
      BEMÆRK: Dette trin forbliver den samme for både smartphone-kompatible og selvstændig enhed.
   4. Vent 10 min uden at forstyrre enheden eller kapillarrøret.
3. For flow-assisteret magnetisk levitation:
   1. Læg prøven i prøverøret.
   2. Tilslut indløbsrøret mellem prøvebeholderen og microcapillary og tilslut slangen stikkontakt mellem mikrokapillærrøret og affaldsbeholder.
   3. Sæt LED intensitet og flow parametre.
4. Sørg for, at cellerne er synlige i synsfeltet, og tryk derefter på knappen capture at tage et billede (knap 3 på selvstændig enhed, og kameraet knappen i bunden af ​​skærmen i ansøgningen smartphone).
   BEMÆRK: Hvis der bruges en USB til at gemme billeder, oprette en mappe kaldet "billeder" og indsætte USB før du tænder for enheden. Hvis der ikke drev er til stede, vil enheden gemme billederne i den interne hukommelse og overføres senere.
   BEMÆRK: Flere billeder kan indfanges og analyseres for at reducere risikoen for uregelmæssigheder ved at bevæge den kapillære ind eller ud omkring ½ cm mellem billedoptagelse.
   BEMÆRK: Hvis antallet af celler i synsfeltet er for høj eller for lav (som påvist og rapporteret på brugergrænsefladen), flytte kapillær ind eller ud af apparatet eller forberede en anden sample.
5. Fjern prøven og kassere prøven i henhold til de institutionelle eller lokale regler. Kapillærer skal bortskaffes som en skarp.

Figur 3: Prøve Forberedelse og brugergrænseflade. (A) Den prøveforberedelse involverer at stikke hul emnet finger, danner en dråbe blod, overføre bloddråben til stikprøvekontrol løsning, omrøring af prøven og påfyldning af et kapillarrør via kapillarvirkning, og indsætte prøven i den magnetiske levitation enhed. (B) Disse trin prøveforberedelse vises også på skærmen af enheden til at guide prøveforberedelse. (C) Enheden indeholder fire knapper: en knap for at zoome ind i prøven billedet med henblik på korrekt justere fokus ved hjælp af justeringsknappen; en knap for at opnå en enkelt measurement (en 5 forsinkelse er implementeret for at give tid for brugeren at indsætte prøven); en tidsforskudt måling (6 billeder taget ved 5 s intervaller); og en knap til at slukke apparatet efter brug. Gengivet med tilladelse fra Yenilmez, et al. ⁸ Klik her for at se en større version af dette tal.

4. Image Analysis ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Kør billedet analyse software inkluderet på enheden for passende prøve (celle distribution eller celletype separation).
   BEMÆRK: den selvstændige enhed, analysen udføres automatisk og vises på den grafiske brugergrænseflade. For enheden smartphone-kompatibel, at foretage analysen, gå til galleriet ennd vælge den ønskede videofil, der skal analyseres.
2. Observere og registrere udgangssignalet fra analysen vises på skærmen.
   BEMÆRK: celle fordeling analyse (såsom seglcelleanæmi diagnose), vil udgangen være bredden af ​​indespærring af cellepopulationen.
   BEMÆRK: celletype separation (f.eks WBC identifikation), vil output være et billede med WBC befolkning identificeret. For at beregne antallet af celler pr mikroliter, formere det gennemsnitlige antal WBCs pr billedet med en faktor på 2.000. For eksempel, hvis der blev observeret 5 WBCs, ville dette indikere 10.000 WBCs / pl. Den normale område anses generelt for at være 3.500 - 11.000 WBCs / uL.
3. Gentage analysen ved at bevæge prøveglas i eller ud af indretningen om ½ cm og opfange et andet billede, der skal analyseres som beskrevet ovenfor.
   BEMÆRK: Det anbefales at gentage analysen 5 - 6 gange pr prøve at undgå fejl.

Representative Results

For celledensitet fordeling analyse, som er den teknik, der anvendes til seglcellesygdom diagnose, er målet at identificere bredden af ​​fordelingen af ​​cellepopulationen. Blodlegemer patienter uden seglcellesygdom vil ligge inden for en forudsigelig bredde. Celler fra patienter med seglcellesygdom vil blive fordelt overalt i en bredere område, med en nedadgående skævhed i cellen distribution (se figur 4.) For enhver særlig anvendelse, kan en tærskel indstilles mellem fordelingen bredde kontrolprøver versus det sunde prøver som en cutoff mellem "sunde" og "positiv for sygdommen" ^{5, 8.}

Figur 4: Eksempel på Magnetic Levitation at Analyser Density Distribution som en indikator for seglcellesygdom i blodprøver. Til venstre er røde blodlegemer godt begrænset inden for et snævert område. På højre, en delmængde af røde blodlegemer opnå en større tæthed og derfor en lavere levitation højde, skævvridning fordelingen nedad og øge bredden af ​​indespærring. Scale bar = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

For at analysere tætheden distribution af en prøve, der er en beregningsmæssige algoritme implementeret i enheden. Først bliver pixel intensitet gradienter langs de lodrette og vandrette akser beregnet. De magnet kanter og kapillar kanter detekteres som toppene i de lodrette pixel gradient profiler. Afstanden mellem de indvendige kapillære kanter, i pixel, er kendt for at være 0,7 mm og anvendes derfor som et Scaling faktor til at konvertere afstande fra pixels til millimeter. Pixelintensiteten gradient langs den horisontale akse er størst, hvor cellerne er placeret. Denne gradient profil analyseres og passer til en Gauss kurve. Værdien 4 gange standardafvigelsen af ​​denne kurve rapporteres som indespærring bredde.

Resultater i figur 5 viser indespærring bredder for både kontrol og seglcellesygdom prøver. Her ville prøver med en større indespærring bredde (over 50 um) betragtes seglcellesygdom positive og dem under denne grænse ville blive anset for at være negativ for sygdommen. Det skal bemærkes, at andre fremgangsmåder til analyse af seglcelle fordeling er blevet undersøgt og rapporteret af Yenilmez, et al. ⁸

Figur5: Kvantificering af indespærring Bredde for seglcellesygdom Diagnose. Eksperimentelle resultater for indespærring bredde af kontrol (n = 48 billeder over 4 fag) og seglcellesygdom (n = 93 billeder over 10 forsøgspersoner) røde blodlegemer. Resultaterne er statistisk signifikant ifølge en Mann-Whitney-Wilcoxon to-sidet test (normal tilnærmelse, n ₁ = 3, ₂ = 10, Z = -2,6764, p = 0,0074). De whiskers repræsenterer minimum og maksimum indeslutning bredder fra prøverne testet og asterisk repræsenterer outliers. Gengivet med tilladelse fra Yenilmez, et al. ⁸ Klik her for at se en større version af dette tal.

For partikel separation, som kan anvendes til at identificere WBCs i blodprøver, er det målet at identificere to særskilte potioner. Hvis populationer har forskellige densiteter, vil de blive observeret i forskellige regioner i synsfeltet. Således kan homogene populationer af to eller flere partikler med forskellige densiteter kan svæve, og efter separation, kan de multiple populationer iagttages i billedet og påvist under anvendelse af billedanalyse algoritmen ⁴ (se figur 6).

For at analysere adskillelsen af ​​to forskellige celletyper, er en algoritme, der implementeres som adskiller de to adskilte populationer ved ligevægt. På en måde svarende til den, der er beskrevet for seglcellesygdom analyse, to Gaussian fordelinger er egnet til prøven, snarere end en enkelt kurve. Hver top i pixelintensiteten gradienter repræsenterer en anden cellepopulation. Gauss kurver passer til disse data giver både den gennemsnitlige levitation højde (i forhold til positionen af ​​den nederste magnet) som gennemsnittet af den gaussiske kurve ogindespærringen bredde som standardafvigelsen af kurven ^7.

Figur 6: Eksempel på Magnetic Levitation af en blandet population af mikropartikler med Distinct Tætheder. (A) Kalibreringskurver korrelerer mikrosfære tæthed med levitation højde i fem forskellige Gd koncentrationer i området fra 12,5 til 200 mM. Hældningen er størst ved de laveste koncentrationer af Gd, hvilket giver en større opløsning (dvs. følsomhed over for små densitetsforskelle). Hældningen er lavest for højere koncentrationer af Gd, hvilket viser forøget område for påvisning, men med lavere opløsning. (B) Time-afhængig separation af en homogen prøve mikrosfærer med to forskellige densiteter i løbet af to minutter. Ved ligevægt (højre), er to distinkte bånd detekteret ved billedet analysis algoritme. Gengivet med tilladelse fra Yenilmez, et al. ⁷ Klik her for at se en større version af dette tal.

For at identificere de enkelte celletyper med forskellige tætheder for en given applikation, er det tilrådeligt at først svæve én celletype ad gangen for at kvantificere den forventede levitation højde. Figur 7a viser levitation højden af WBCs fra en blodprøve, hvor RBC'erne er blevet lyseret. Dette definerer regionen indespærring af WBCs til yderligere analyse. Resultaterne indikerer, at RBC svæve lavere end WBCs og således kan WBCs skelnes fra blodprøver baseret på levitation position. Volumen indenfor en given synsfelt er 0,5 uL. I prøver, som blev fortyndet 1: 1.000, antallet af WBCs / pi kan beregnes ved at tælleantallet af WBCs i synsfeltet og multiplicere med en faktor på 2.000 ^7.

Figur 7: WBC cytometri i fuldblod. (A) Levitation af WBCs fra blod efter RBC lysis. Dette definerer det område, hvor WBCs svæve i det magnetiske felt i 25 mM Gd. (B) Eksempel på WBC optælling (WBCs markeret med blå pile). Toprammen indlæg viser WBCs og bundrammen og bundrammen indlæg viser RBC befolkning. Gengivet med tilladelse fra Yenilmez, et al. ⁷ Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Kritiske trin i protokollen
Kritiske faktorer i denne proces, omfatter korrekt tilpasning af magneterne. Hvis magneterne løsne eller adskilt mere end normalt i enheden, kan det påvirke resultaterne. For at kontrollere for denne fejl eller andre i processen, en densitet-kontrolleret partikel, såsom polystyren mikrokugler, kan anvendes periodisk til at kontrollere for ændringer over tid. Endvidere levitation tid er vigtigt at give cellerne til at nå ligevægt. For røde blodlegemer, 10 min er tilstrækkelig til, at alle celler til at nå ligevægt. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at mindre partikler eller celler kan kræve længere tid til at nå ligevægt. Dette kan vurderes ved at tage tid bortfalder billeder på en 5 s interval og plotte indespærring bredde over tid; ligevægt kan bestemmes som det punkt, hvor ændringen i indespærring bredde er ubetydelig.

Andre kritiske skridt i protokollen omfatter præparation af gadolinium løsning på det præcise koncentration som dette i høj grad påvirker prøve levitation højde. Dette kan ske før tid og anvendes fra en stamopløsning, men skal forsegles korrekt for at undgå fordampning af opløsningen og en utilsigtet stigning i koncentration. Endvidere skal man være omhyggelig for at opretholde sundhedstilstanden af ​​cellerne, der anvendes. Til human blod udtaget via fingerprik, bør det anvendes inden for en time blodprøve og ikke lov at tørre ved opbevaring i en forseglet beholder. Til human blod udtaget ved venepunktur, bør prøverne opbevares ved 4 ° C i ikke mere end en uge med antikoagulant (ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), en fælles antikoagulant, blev anvendt her). For adhærente cellelinier, bør døde celler vaskes grundigt fra før trypsinisering og celler skal inkuberes indtil brug kulturen. Sundheden af ​​cellerne på tidspunktet for levitation er kritisk, fordi celle sundhed er kendt for at påvirke tæthed og derfor levitation taghøjdet.

Ændringer og fejlfinding
Vi har påvist separationen og indespærring af celler fra to forskellige densiteter på forudsigelig steder i magnetfeltet. For at udvide denne teknik til andre anvendelser kan forskellige formuleringer af det paramagnetiske medium anvendes til at opnå et ønsket område for påvisning for alternative anvendelser ^3. Koncentrationen af gadolinium regulerer opløsning på detektion samt intervallet (se figur 6a). Fordi større koncentrationer af gadolinium øge styrken af ​​den magnetiske kraft, der påføres cellerne, jo større koncentrationen af ​​gadolinium i den suspenderende opløsning, jo mindre forskel i levitation højde vil være for eventuelle forskelle i celledensitet. Mens dette begrænser beslutning, defineret som evnen til at skelne mellem små forskelle i celledensitet, øger udvalget af densiteter, som kan analysered. Tilsvarende vil reducere koncentrationen af ​​gadolinium øge opløsningen, men formindske række detektion. Endvidere kan massefylden af ​​mediet ændres for at flytte detektionsgrænserne opad eller nedad. Den anden kraft, som styrer levitation højde er opdriften, som afhænger af den relative massefylde af cellen sammenlignet med den af ​​suspensionsmediet. Her er en vandbaseret suspension der anvendes, hvilket betyder, at celler med en densitet, som er den samme som for mediet levitate på midterlinien mellem de to magneter med mindre tætte eller tungere celler levitating over eller under centerlinien, henholdsvis (med et område kontrolleret af magnetisk kraft som tidligere beskrevet). Fordi opdrift afhænger af relativ massefylde, øge densiteten af ​​mediet vil flytte området detektion til en højere række celledensiteter. Ligeledes vil anvendelse af en lavere densitet medium forskyde række detektion mod en nedre område for celledensiteter. < / P>

Vi har også undersøgt ydelsen af flow-assisteret magnetisk fokuseringsindretning ved at kvantificere den normaliserede partikel tælling over kapillære bredde (dvs. sandsynligheden for en partikel til at strømme med en afstand på tværs af kapillære bredde). Lavere flow har mere indespærring af partikler, men resultere i en lavere volumen gennemløb, hvilket kan være en ulempe for sjælden objekt detektion i store mængder prøver. Dette kan imidlertid løses ved flere passager i det magnetiske felt eller via længere magneter. Adskillelse mellem flere celletyper, kan også udnyttes i fremtidige undersøgelser for at isolere partiklerne af forskellige densiteter ved at udnytte en mikrofluid separator i slutningen af ​​det magnetiske felt.

Ved adskillelse af flere celletyper, kan det være nyttigt at svæve hver population individuelt for at fastslå den gennemsnitlige højde og udvalget af hver celletype før svævende den homogen population.

e_content "> Begrænsninger af teknikken
Fremgangsmåden præsenteres her er begrænset til separation af partikler af særskilte densiteter. For at opnå en pålidelig identifikation af multiple celletyper, er det vigtigt, at de har diskrete befolkningstæthed, som ikke overlapper. Endvidere er partikler, der kan detekteres af begrænset størrelse. De skal være i stand til at bevæge sig frit inden for mikrokapillær rør - 200 um er den anbefalede øvre grænse for partikeldiameteren. Endvidere skal partiklerne være stor nok til at blive afbildet tydeligt - 5 um er den anbefalede nedre grænse af diameteren.

Betydningen af ​​Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder
Denne tilgang til celleanalyse er enkel, så brugervenlig analyse på stedet. Mange medicinske diagnostiske procedurer skal udføres i kliniske prøvningslaboratorier og kræver specialiseret udstyr og procedurer udføres af en uddannet laboratorium specialis testt. Men denne protokol kræver en simpel anordning, der er mere tilgængelig for sundhedsklinikker. Prøvepræparationen er enkel og analysen er automatiseret, hvilket minimerer risikoen for brugerfejl.

Denne enhed vil sikre en hurtig, on-site testning for en række medicinske tilstande. Enheden er brugervenlige, label-fri, og bærbare, hvilket gør den ideel til point-of-care sygdomsdiagnostik. Sammenlignet med den nuværende standard af fjernstyret kliniske laboratorieprøver, vil denne fremgangsmåde give læger til hurtigt at træffe kvalificerede beslutninger om patientpleje og potentielt forebygge komplikationer som følge af forsinkelser i pleje. Platformen er designet med let tilgængelige og billige komponenter, så udbredt brug af denne metode i klinisk og udviklingslande og forbedre verdensomspændende adgang til sundhedspleje.

Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering denne teknik
Det er vigtigt at bemærke, atprøver beskrevet her, er endnu ikke valideret i stor målestok patientpopulation. Til dato har segl diagnose celle sygdom blevet bekræftet i en lille patient kohorte ^{2, 5} og WBC cytometri er blevet påvist som en proof of concept. Kliniske forsøg med disse applikationer og dem udvikles i fremtiden skal udføres for at validere denne metode forud for klinisk anvendelse, men resultaterne præsenteres her viser lovende for eventuel brug af denne teknologi og teknik til point-of-care klinisk diagnostik.

Brug af denne fremgangsmåde for tæthed-baserede cytometrisk analyse kan i sidste ende udvides til yderligere sygdomstilstande diagnostiske anvendelser. Denne tilgang af magnetisk levitation af enkeltceller til sygdomsdiagnostik som beskrevet her kræver anvendelse af enkelt-cellesuspensioner af en patients celler og til celler, som kan afbildes ved hjælp af den nuværende system med sine begrænsninger opløsning på grund af brugaf en smartphone kamera eller billige optik. Endvidere er denne teknik anvendes på sygdomme, der opfylder en af ​​følgende betingelser: (i) celler af interesse skal opnå en ændret tæthed, når de bærer sygdommen sammenlignet med raske kontroller, (ii) en celle tæthed forandring skal være inducerbar ved tilsætning af et reagens (eller enhver tilgængelig alternativ behandling), eller (iii) den diagnostiske skal sigte mod at afdække forskellige typer celler i en enkelt prøve, der enten i sig selv eller via en eller anden behandling har unikke densiteter. Fremtidige ansøgninger til andre sygdomme ved hjælp af den samme platform enhed kan have en enorm indflydelse på den globale sundhed. Disse kan omfatte påvisning af biologiske komponenter, som udmærker sig ved tætheden. Visse celletyper, celler, som gennemgår celledød og syge celler har alle vist sig at have unikke density signaturer og dermed forskellige magnetiske mønstre, og kan derfor kvantificeres og separeres ved hjælp af denne platform. Celler i meget lave tal kan også be opdaget ved at udnytte væske flow i strømmen-assisteret magnetisk levitation enhed.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201