Magnetische levitatie In combinatie met Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Introduction

Hier presenteren we een technologieplatform en een techniek die magnetische levitatie combinatie met geautomatiseerde beeldvorming en analyse gebruikt om de dichtheidsverdeling van cellen van een patiënt te analyseren als indicator voor de ziekte. Deze veelzijdige benadering dichtheid gebaseerde cytometrische analyse kan uiteindelijk worden toegepast op een reeks van diagnostiek. Om echter verenigbaar met point-of-care testen en gebruik in ontwikkelingslanden, moet de techniek vereisten voor goedkope, draagbaarheid en bruikbaarheid voldoen. Het apparaat en verbruiksgoederen moet gemakkelijk worden verkregen tegen een lage kostprijs. Het monster voorbereiding moet eenvoudig zijn, moet de analyse worden geautomatiseerd met minimale eisen voor de invoer van de gebruiker of de interpretatie, en de resultaten moeten snel worden geretourneerd. Verder moet het apparaat compact en draagbaar bruikbaar in klinische en ontwikkelingslanden te zijn. Zo hebben wij een inrichting en werkwijze ontwikkeld magnetische levitatie gebruiken point-of-care-compatibele technolgie door koppeling geautomatiseerde beeldvorming en analyse resultaten betreffende de verdeling densiteit van een populatie van cellen van een patiënt.

Point-of-care technologieën bieden een opmerkelijk voordeel ten opzichte van de huidige klinische laboratoriumtests procedures. De technologie die momenteel beschikbaar is te duur om te worden bezeten door een arts of te complex uitgevoerd door medisch personeel worden uitgevoerd. Veel van deze procedures vereisen arbeidsintensieve protocollen die door een vakman moeten worden uitgevoerd. Daarom worden patiënten monsters zoals bloed of urine in het algemeen opgevangen in de dokterspraktijk vervolgens overgebracht naar een externe, gecentraliseerde testlaboratorium voor klinische testen, die verscheidene dagen duren voordat de arts om de resultaten van de test te ontvangen. Dit kan vertragingen of complicaties tijdens behandeling in sommige gevallen veroorzaken, maakt deze tests zeer kostbaar en inefficiënt (waardoor een financiële last op de verzekering betalers), en verder maakt veeldiagnostiek ontoegankelijke in low-resource-instellingen en de ontwikkelingslanden.

Hier presenteren we een magnetische levitatie techniek in combinatie met geautomatiseerde beeldvorming en analyse zowel een inrichting met ingebedde beeldvorming en verwerking (figuur 1) en een smartphone-compatibel apparaat (figuur 2). Deze magnetische levitatie-gebaseerde apparaten vormen een breed toepasbare platform technologie die het mogelijk moet worden toegepast op een reeks van verschillende medische diagnostische toepassingen. De magnetische levitatie benadering van enerzijds een evenwicht tussen twee krachten: een magnetische kracht en drijfvermogen ^{1, 2, 3.} Wanneer een deeltje gesuspendeerd in een paramagnetisch medium en in een magnetisch veld dat door twee magneten met gelijke polen tegenover elkaar, een magnetische kracht werkt op het deeltje in de richting van de hartlijn tussen de twee magn ingevoegd ets. Het drijfvermogen wordt veroorzaakt door de relatieve dichtheid van de deeltjes ten opzichte van het suspenderende medium en opwaarts in het geval van deeltjes minder dicht dan het medium en neer bij deeltjes dichter dan het omringende medium. Op basis van deze twee krachten, zullen deeltjes een evenwicht levitatie in het domein waarin deze twee krachten in evenwicht te bereiken; deze positie is direct gerelateerd aan de dichtheid van het deeltje, met dichtere deeltjes zweven lager in het gebied van minder dichte deeltjes. Een beeldvormende module, hetzij een ingebouwde camera smartphone ^{4, 5, 6} of onafhankelijke optische componenten voorzien van een vergrotende lens ^{7, 8,} worden gebruikt om de posities van de deeltjes zichtbaar. Beeldverwerking, hetzij door middel van een smartphone applicatie ^{4, 5,}= "xref"> 6 of een ingebedde verwerkingseenheid ^{7, 8,} verwerkt vervolgens de opgenomen beelden op de ruimtelijke verdeling kwantificeren en derhalve de verdeling van de dichtheid bevolking. Om grotere monsters (zoals die met slechts enkele deeltjes per milliliter plaats te analyseren, kan de telefoon rechtstreeks worden geïntegreerd in de inrichting, de deeltjes zweven en geanalyseerd zoals deze door het beeldgebied passen (figuur 2).

Figuur 1: Onafhankelijk magnetische levitatie Platform. (A) Compacte magnetische levitatie inrichting een magnetische module richten, imaging componenten (a light-emitting diode (LED), een optische lens en een camera detector) en een verwerkingseenheid met een beeldscherm. (B) De magnetische veldsterkte in de cross gedeelte van het gebied tussen de magneten waar het monster wordt aangebracht. De veldsterkte het grootst aan het oppervlak van de magneten en nul benadert bij de middellijn tussen hen. (C) Deeltjes, zoals cellen, in het magneetveld zijn verscheidene krachten: een magnetische kracht (F _m) naar de middellijn tussen het magnetisme, met een kracht variërend op basis van de positie van het deeltje; een zwaartekracht _(Fg) die afhangt van de deeltjesdichtheid ten opzichte van die van het suspenderende medium en een sleepkracht _(Fd) verzet tegen de beweging van de deeltjes. Gereproduceerd, met toestemming, uit Yenilmez, et al. ⁸ Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

vijgure 2: Smartphone-compatibele Flow-geassisteerde magnetische levitatie Platform. (A - c) Voor (a), de zijkant (b), en terug (c) standpunten van magnetische levitatie apparaat (d) De onderdelen van het toestel zijn onder meer: 1) magnetische levitatie module, met inbegrip van permanente magneten, een vergrootglas, en een LED en lichte diffuser, 2) smartphone geval, 3) elektronica, met inbegrip van een microcontroller, pomp driver en Bluetooth-ontvanger, 4) houder micro-pomp, 5) instelbare opening, 6) afval buis houder, 7) batterijhouder, 8 ) monsterhouder, 9) dual-purpose stand en deksel. (E) Flow schema, waarin pompen van het monster door het magnetische veld. (F) Doorsnede van de magnetische levitatie module toont hoe deeltjes met verschillende dichtheden wordt uitgelijnd als ze door de velden worden gepompt; minder dichte deeltjes, zoals Deeltje 1, zal evenwicht bij hogere levitatie hoogte than dichtere deeltjes, zoals Particle 2. Overgenomen, met toestemming, van Amin, et al. ¹ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De minimale voorgeschreven om een ​​monster voor dichtheidsverdeling analyse in dit systeem zijn de mogelijkheid om een ​​suspensie van cellen of deeltjes groter dan ongeveer 5 urn en minder dan ongeveer 250 urn in grootte (voor beeldvorming en beeldverwerking) en de verenigbaarheid ervan met krijgen mengen in een oplossing van een paramagnetische oplossing zoals gadobutrol hier gebruikt. Voor diagnostiek, compatibele toepassingen omvatten die waarin (i) cellen plaats inherent een veranderde densiteit als ze dragen een ziekte vergeleken met gezonde controles, (ii) een verandering van dichtheid in de cel worden geïnduceerd door toevoeging van een reagens of een alternatieve behandeling voor een kortcubation tijd, of (iii) verschillende celtypen worden geïdentificeerd in een enkel monster en intrinsiek (of via enige vorm van behandeling) hebben unieke eigenschap dichtheden.

Sikkelcelanemie is een genetische aandoening veroorzaakt een gemuteerde vorm van hemoglobine, HbS, worden geproduceerd in iemands rode bloedcellen (RBC's), die kan leiden tot onregelmatige vaso-occlusieve gebeurtenissen en chronische hemolytische anemie ^9. Het is gediagnosticeerd met behulp van hemoglobine iso-elektrische focussering, high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) fractionering, of hemoglobine elektroforese die zeer nauwkeurig zijn, maar moet worden uitgevoerd in een klinisch laboratorium, omdat zij onverenigbaar zijn met point-of-care-instellingen. Oplosbaarheid en op papier gebaseerde tests voor sikkelcelziekte zijn voorgesteld, maar over het algemeen vereisen subjectief gebruiker interpretatie en bevestigende testen. Hier gebruiken we een dichtheid gebaseerde benadering van sikkel RBC's te identificeren, die een hogere dichtheid dan RB bereikenCs van mensen zonder sikkelcelziekte. Het mechanisme omvat polymerisatie van de gemuteerde vorm van hemoglobine, HbS, waarin RBC uitdroging veroorzaakt bij sikkelcelziekte RBCs onder zuurstofarme omstandigheden ^{10, 11, 12, 13.}

Deze benadering dichtheid gebaseerde kan ook worden toegepast op cellen van verschillende soorten gescheiden op basis van de dichtheid: witte bloedcellen (WBC's) en RBC ^7. WBC's zijn over het algemeen verantwoordelijk zijn voor het bestrijden van infecties in het lichaam. WBC cytometrie kan worden gebruikt om het aantal van deze cellen in het bloed te kwantificeren en dient als een nuttig diagnostisch instrument. WBC telt hoger dan normaal (algemeen beschouwd als meer dan 11.000 cellen per pl) kan infectie, aandoeningen van het immuunsysteem, of leukemie te geven. WBC tellingen lager dan normaal (ongeveer 3500 cellen per ui) worden veroorzaakt door auto-immuunstoornissen of conditionen die schade beenmerg. In tegenstelling tot alternatieve technologieën, heeft het proces hier gepresenteerde geen beroep doen op lysis van de rode bloedcellen of vlekken om WBC's te identificeren. Deze celgebaseerde proef maakt gebruik van de unieke inherente dichtheden van de twee celtypen te scheiden voeren, als WBC bevolkingsdichtheid gerapporteerd lager dan die van de RBC bevolking eerder berekend met dichtheidsgradiënt centrifugatie ^{2, 3} te zijn.

Tegenover alterative testen op afgelegen plaatsen, deze test is een snelle, eenvoudige monstervoorbereiding (figuur 3), scheiding van cellen in de inrichting binnen 10 - 15 min, en geautomatiseerde beeldvorming en analyse die minder dan 1 minuut nodig. Op deze wijze kan de inrichting resultaten snel naar medische beslissingen beter te informeren, zodat behandeling onmiddellijk te worden toegediend aan fysieke en psychologische pijn te verlichten, en het risico op complicaties verminderen Associated met een vertraging in de medische zorg. Deze techniek kan worden uitgevoerd op locatie of in klinische settings door eenvoudige monstervoorbereiding en geautomatiseerde beeldvorming en analyse die een resultaat met minimale gebruikersinvoer of interpretatie geeft. Door het gebruik van een eenvoudige benadering gebruiken permanente magneten voor monsteranalyse en het gebruik van hetzij een smartphone of eenvoudige elektrische componenten voor beeldvorming en beeldverwerking, het apparaat en de kosten per test zijn minimaal in vergelijking met enkele geavanceerde testprocedures.

Protocol

Ethische verklaring: Alle procedures met menselijke bloedmonsters werden volgens de institutionele voorschriften uitgevoerd. Alle protocollen zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board goedgekeurd. Een geïnformeerde toestemming werd gegeven door alle deelnemers.

1. Monstervoorbereiding voor sikkelcelziekte Diagnose ^{5, 8}

1. Bereid een 50 mM oplossing van gadobutrol in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
2. Los 10 mM natriummetabisulfiet in het gadolinium oplossing.
   LET OP: Natriummetabisulfiet is giftig bij inademing en sterk irriterend voor de huid en weefsel. Het is een corrosief zuur indien gemengd met water. Kan ontleden giftige dampen oxide zwavel en natrium uitzenden bij verhitting tot hoge temperaturen.
3. Verkrijgen bloedmonster via ofwel vingerprik of venapunctie.
   1. Teken bloed met behulp van een prikpen met een schone, wegwerpbare lancet. Apply druk in de buurt van de doorboorde plaats en veeg het bloed druppel gevormd drie tot vier keer voor het verzamelen van bloed met behulp van een pipet; let op dat "melk" de vinger door knijpen het weefsel, omdat dit zal leiden tot verontreiniging van het monster met weefselvloeistof.
   2. Als alternatief, trekken bloed met behulp van standaard venapunctie procedures ^14.
      OPMERKING: Indien monsters langer worden bewaard dan enkele uren, laat het bloed in een vacutainer met een antistollingsmiddel, zoals EDTA.
4. Voeg minder dan 1 pi van bloed naar 100 gl van de gadolinium-natriummetabisulfietoplossing.

2. Monstervoorbereiding voor WBC Cytometry ⁷

1. Verkrijgen bloedmonster via ofwel vingerprik of venapunctie, zoals in deel 1.
2. Optioneel: Lyse RBC met een RBC lysisbuffer. Pipetteer 5 ul bloed in 500 pi van RBC lysis buffer en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 3-5 min.
   NOTITIE:dit kan worden gedaan om de levitatie bereik van een geïsoleerde populatie van WBC bevestigen. Het is echter niet nodig deze stap uit te voeren, omdat de hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat RBCs zweven met een duidelijk lagere positie dan WBC.
3. Verdund volbloed 1: 1000 in 25 mM Gd in HBSS
   NB: als cellysis werd uitgevoerd, verdunnen de gelyseerde monster 9: 1 gelyseerde monster: 250 mM Gd om een ​​monster dat 25 mM Gd te verkrijgen.

3. Analyse van monsters met behulp van de magnetische levitatie Platform ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Start de magnetische levitatie apparaat:
   1. Voor de zelfstandige inrichting, de stekker in het apparaat, laat het aan de macht, en te plaatsen op een vlakke ondergrond.
   2. Voor de smartphone-compatibele versie, start u de smartphone-applicatie en veeg naar links imago aan te gaanopnamemodus, en leg ze op een vlakke ondergrond.
2. Voor statische magnetische levitatie:
   1. Plaats de voorbereide monster in een vierkante glazen microcapillaire buis door dompelen het einde in de oplossing en het toestaan ​​van het monster naar de capillaire vullen via capillaire werking.
   2. Seal het einde van een tube kit door langzaam te duwen het ene uiteinde van de capillair in het materiaal.
   3. Plaats de capillaire tussen de magneten van de magnetische levitatie apparaat, zodat slechts 1 cm van de buis zichtbaar blijft (zie figuur 3 voor een afbeelding van het monster voorbereiding).
      LET OP: Deze stap blijft hetzelfde voor zowel de smartphone-compatibel en op zichzelf staand apparaat.
   4. Wacht 10 minuten zonder dat het toestel of capillaire verstoren.
3. Voor-flow bijgestaan magnetische levitatie:
   1. Laad het monster in de monsterbuis.
   2. Sluit de inlaat slang tussen de monsterhouder en microcapillary en sluit de uitlaat slang tussen de microcapillaire en afvalcontainer.
   3. Stel de LED intensiteit en stromingsparameters.
4. Zorg ervoor dat cellen zichtbaar zijn in het gezichtsveld en druk op de opnameknop om een ​​beeld vast te leggen (knop 3 op de zelfstandige apparaat en de camera-knop aan de onderkant van het scherm in de smartphone-applicatie).
   LET OP: Als er een USB wordt gebruikt om de beelden op te slaan, maakt u een map genaamd "images" en steek de USB voorafgaand aan het aanzetten van het apparaat. Als er geen schijf aanwezig is, zal het toestel de beelden in het interne geheugen op te slaan en later overgebracht.
   OPMERKING: Verscheidene beelden kunnen worden vastgelegd en geanalyseerd om de kans op afwijkingen te verminderen door het bewegen van de capillair in of uit ongeveer ½ cm tussen beeld vastleggen.
   LET OP: Als het aantal cellen binnen het gezichtsveld te hoog of te laag is (zoals gedetecteerd en gerapporteerd aan de user interface), verschuiven de capillaire in of uit het apparaat of voor te bereiden een andere sample.
5. Verwijder het monster en gooi de steekproef op basis van de institutionele of lokale regelgeving. Haarvaten dient te worden vernietigd als een scherp.

Figuur 3: Monstervoorbereiding en User Interface. (A) bereiding van het monster omvat prikken vinger van de patiënt, waardoor een druppel bloed, het overbrengen van de bloeddruppel de testen oplossing, roeren van het monster en laden in een capillaire buis via capillaire werking, en het invoegen van het monster in de magnetische levitatie apparaat. (B) Deze monstervoorbereiding stappen worden ook weergegeven op het scherm van het apparaat om monstervoorbereiding te begeleiden. (C) Het apparaat is voorzien van vier knoppen: een knop om te zoomen afbeelding van het monster in om de scherpstelling goed aan te passen met behulp van de regelknop; een knop om één meter werd verkregeneasurement (a 5 s vertraging geïmplementeerd om tijd te geven voor de gebruiker om het monster te voegen); een time-lapse meting (6 foto's zijn genomen op 5 s intervallen); en een knop om de stroom uit te schakelen na gebruik. Gereproduceerd, met toestemming, uit Yenilmez, et al. ⁸ Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Beeldanalyse ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Voer de beeldanalyse software op het apparaat voor de juiste sample (cel distributie of celtype scheiding).
   LET OP: Voor de zelfstandige inrichting, de analyse wordt automatisch uitgevoerd en weergegeven op de grafische gebruikersinterface. Voor de smartphone-compatibel apparaat, om de analyse uit te voeren, gaat u naar de galerie eennd het gewenste videobestand te selecteren om te worden geanalyseerd.
2. Observeren en registreren de output van de analyse wordt weergegeven op het scherm.
   OPMERKING: celverdeling analyse (zoals sikkelcelziekte diagnose), zal de output de breedte van opsluiting van de celpopulatie is.
   LET OP: Voor celtype scheiding (zoals WBC identificatie), zal de output een beeld met de WBC bevolking geïdentificeerd zijn. Om het aantal cellen per microliter vermenigvuldigt het gemiddelde aantal leukocyten per beeld met een factor 2000. Als bijvoorbeeld 5 WBC's werden waargenomen, dit erop wijst 10.000 WBC / ul. Het normale bereik wordt algemeen beschouwd als 3500 - 11.000 WBC / ul.
3. Moet de analyse van het bewegen van de monsterbuis in of uit het apparaat ongeveer ½ cm en vastleggen van een beeld worden geanalyseerd zoals hierboven beschreven.
   LET OP: Het is aanbevolen om de analyse 5 herhalen - 6 keer per monster om fouten te voorkomen.

Representative Results

Celdichtheid distributieanalyse, de techniek die voor sikkelcelziekte diagnose, het doel is de breedte van de verdeling van de celpopulatie te identificeren. Bloedcellen van patiënten zonder sikkelcelanemie wordt ingesloten in een voorspelbare breedte. Cellen van patiënten met sikkelcelziekte wordt verdeeld over een groter gebied, met een neerwaartse scheve in de celverdeling (zie figuur 4) Voor een bepaalde toepassing kan een drempel worden ingesteld tussen de verdelingsbreedte van controlemonsters versus die van gezonde monsters als scheiding tussen "gezonde" en "positief voor de ziekte" ^{5, 8.}

Figuur 4: Voorbeeld van magnetische levitatie naar Densit Analysereny Distribution als indicator voor sikkelcelziekte in bloedmonsters. Aan de linkerkant, zijn rode bloedcellen goed opgesloten binnen een smal gebied. Rechts een subset van rode bloedcellen bereiken van een grotere dichtheid en derhalve een lagere hoogte levitatie, vertekening distributie beneden en verhoging van de breedte van de bevalling. Schaal bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de distributie dichtheid van een monster te analyseren, wordt een computationeel algoritme geïmplementeerd binnen het apparaat. Eerst worden de pixelintensiteit hellingen langs de verticale en horizontale assen berekend. De magneet randen en de capillaire randen worden gedetecteerd als pieken in de verticale pixels gradiënt profielen. De afstand tussen de binnenste capillair randen, in pixels, is bekend dat 0,7 mm en wordt daarom gebruikt als Scaling factor afstanden zetten van pixels naar millimeters. De pixel intensiteit gradiënt langs de horizontale as is het grootst bij cellen liggen. Deze gradiënt profiel wordt geanalyseerd en geschikt om een ​​Gauss-curve. De waarde 4 maal de standaardafwijking van de curve wordt gerapporteerd als de opsluiting breedte.

Resultaten in Figuur 5 tonen de opsluiting breedten zowel controle en monsters sikkel cel ziekte. Hier zou monsters met een grotere breedte bevalling (meer dan 50 pm) sikkelcelanemie positief worden beschouwd en die onder deze drempel worden als negatief voor de ziekte. Opgemerkt wordt dat andere analysemethoden van de sikkel cel distributie werden onderzocht en gerapporteerd door Yenilmez, et al. ⁸

Figuur5: Kwantificering van de opsluiting breedte voor sikkelcelziekte Diagnose. Experimentele resultaten voor opsluiting breedte controle (n = 48 beelden gedurende 4 patiënten) en sikkelcel ziekte (n = 93 beelden gedurende 10 proefpersonen) rode bloedcellen. De resultaten zijn statistisch significant volgens een Mann-Whitney-Wilcoxon tweezijdig-test (normale benadering, n ₁ = 3, n ₂ = 10, Z = -2,6764, p = 0,0074). De whiskers vertegenwoordigt de minimum en maximum breedtes opsluiting van de geteste monsters en sterretjes geven uitschieters. Gereproduceerd, met toestemming, uit Yenilmez, et al. ⁸ Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voor deeltjes scheiding, die kunnen worden gebruikt om WBC's identificeren bloedmonsters, het doel is om twee verschillende bev identificerenties. Als de populaties verschillende dichtheden, zullen deze worden waargenomen in verschillende gebieden in het gezichtsveld. Aldus kunnen homogene populaties van twee of meer deeltjes met verschillende dichtheden zweven en na scheiding, kan het meerdere populaties in het beeld worden geobserveerd en gedetecteerd met de beeldanalyse algoritme ⁴ (zie figuur 6).

De scheiding van twee verschillende celtypen te analyseren, wordt een algoritme gebruikt die de twee gescheiden populaties in evenwicht onderscheidt. Op soortgelijke wijze als beschreven voor sikkelcelziekte analyse, twee Gaussische verdelingen geschikt zijn om het monster, in plaats van enkel gebogen. Elke piek in de pixelintensiteit gradiënten vertegenwoordigt een andere celpopulatie. Gaussiaans krommen geschikt om deze informatie geven zowel de gemiddelde lengte levitatie (ten opzichte van de positie van de onderste magneet) als het gemiddelde van de Gauss-curve ende opsluiting breedte als standaardafwijking van de curve ^7.

Figuur 6: Voorbeeld van magnetische levitatie van een gemengde populatie van micropartikels met verschillende dichtheden. (A) IJkkrommen correleren microsfeer dichtheid met levitatie hoogte in vijf verschillende concentraties variërend Gd 12,5-200 mM. De helling is het grootst bij de laagste concentraties van Gd, waardoor een grotere resolutie (bijvoorbeeld gevoeligheid voor kleine dichtheidsverschillen) aanbieden. De helling is het laagst voor hogere concentraties van Gd, waaruit de toegenomen aanbod van detectie, maar met een lagere resolutie. (B) Time-afhankelijke scheiding van een homogeen monster microsferen met twee verschillende dichtheden in de loop van twee minuten. Bij evenwicht (rechts), zijn twee verschillende banden gedetecteerd door het beeld analetion algoritme. Gereproduceerd, met toestemming, uit Yenilmez, et al. ⁷ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om individuele celtypen met verschillende dichtheden voor een bepaalde toepassing te identificeren, is het raadzaam om een ​​eerste zweven celtype tegelijk de verwachte levitatie hoogte kwantificeren. Figuur 7a toont de levitatie hoogte WBC's uit een bloedmonster waarbij RBC werden gelyseerd. Dit definieert de regio opsluiting van WBC's voor verdere analyse. De resultaten geven aan dat RBC's zweven lager dan WBC's en derhalve kan WBC worden onderscheiden van bloedmonsters op basis van de levitatie positie. Het volume binnen een bepaald gebied van mening is 0,5 pi. In monsters die werden verdund 1: 1000, het aantal WBC / ul kan worden berekend door het tellenhet aantal WBC's in het gezichtsveld en vermenigvuldigen met een factor 2000 ^7.

Figuur 7: WBC Cytometry in volbloed. (A) levitatie van de WBC's uit het bloed na RBC lysis. Dit bepaalt het gebied waarin WBC zweven in het magnetische veld in 25 mM Gd. (B) Voorbeeld van WBC telling (WBC gemarkeerd met blauwe pijlen). Het bovenste frame inlay toont WBC en het onderste frame en het onderste frame inlay toont de RBC-populatie. Gereproduceerd, met toestemming, uit Yenilmez, et al. ⁷ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Kritische stappen in het protocol
Kritische factoren in dit proces zijn de juiste uitlijning van de magneten. Als de magneten verdreven worden of gescheiden meer dan normaal in het apparaat, kan dit invloed hebben op de resultaten. Te controleren voor deze fout of andere in het proces, een dichtheid gecontroleerde deeltje, zoals polystyreen microbolletjes kunnen worden gebruikt om periodiek te controleren voor veranderingen in de tijd. Verder, levitatie tijd is het belangrijk om de cellen om evenwicht te bereiken. Voor rode bloedcellen, 10 min is voldoende om alle cellen op elkaar kunnen. Het is echter belangrijk op te merken dat kleinere deeltjes of cellen een langere tijd op elkaar kunnen vereisen. Dit kan worden beoordeeld door het nemen van time lapse beelden met een 5 s interval en het uitzetten van de opsluiting breedte in de tijd; evenwicht kan worden bepaald als het punt waarbij de verandering in breedte opsluiting verwaarloosbaar.

Andere kritische stappen in het protocol zijn de prereiding van de gadolinium oplossing bij de precieze concentratie, omdat dit van grote invloed op sample levitatie hoogte. Dit kan van tevoren worden uitgevoerd en gebruikt van een voorraadoplossing, maar moet goed worden afgedicht om verdamping van de oplossing en een onverwachte toename van de concentratie voorkomen. Verder moet erop worden gelet dat de gezondheidstoestand van de gebruikte cellen te behouden. Voor menselijk bloed getrokken via een vingerprik, moet het worden gebruikt binnen één uur na bloedafname en niet te drogen door de opslag in een gesloten verpakking. Voor menselijk bloed getrokken door venapunctie moeten de monsters worden bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een week met anticoagulant (ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), een gemeenschappelijk antistollingsmiddel, werd hier gebruikt). Voor hechtende cellijnen, dode cellen grondig worden uit de kweek voorafgaand aan behandeling met trypsine en cellen worden geïncubeerd tot gebruik gewassen. De gezondheid van de cellen bij het levitatie is essentieel omdat celgezondheid is bekend dat de dichtheid en derhalve levitatie heigh beïnvloedent.

Wijzigingen en problemen oplossen
We hebben de scheiding en opsluiting van cellen van twee verschillende dichtheden op voorspelbare locaties in het magnetische veld getoond. Om deze techniek uit te breiden naar andere toepassingen kan verschillende formuleringen paramagnetische medium worden gebruikt om een gewenste detectiebereik te verkrijgen voor alternatieve toepassingen ^3. De concentratie van gadolinium regelt de resolutie van detectie, evenals het bereik (zie figuur 6a). Vanwege grotere concentraties van gadolinium verhoging van de sterkte van de magnetische kracht op de cellen, hoe hoger de concentratie van gadolinium in de hangende oplossing, hoe kleiner het verschil in hoogte levitatie zullen eventuele verschillen in celdichtheid. Hoewel dit de resolutie, gedefinieerd als het vermogen om onderscheid te maken tussen de kleine verschillen in celdichtheid beperkt, verhoogt het bereik van dichtheden kunnen worden geanalyseerdd. Ook het verminderen van de concentratie van gadolinium wordt de resolutie te verhogen, maar het detectiebereik verkleinen. Verder kan de dichtheid van het medium worden gewijzigd volgens de detectielimieten omhoog of omlaag te verschuiven. De tweede kracht die levitatie -hoogteregelingen is de opwaartse kracht, die afhangt van de relatieve dichtheid van de cellen vergeleken met die van het suspenderende medium. Hier wordt een op water gebaseerde suspenderende oplossing gebruikt, betekent dat cellen met een densiteit die gelijk is aan die van het medium zweven op de hartlijn tussen de twee magneten met minder dichte of dichter cellen zweven boven of onder de middenlijn respectievelijk (met een bereik dat door magneetkracht zoals eerder beschreven). Omdat opwaartse kracht afhankelijk is van densiteit, waardoor de dichtheid van het medium zal het detectiebereik verschuiven naar een hoger bereik van celdichtheden. Ook een lagere dichtheid medium zal het detectiebereik naar een lager bereik van celdichtheden verschuiven. < / P>

We hebben ook onderzocht de prestaties van stroom geassisteerde magnetische focusseerinrichting door het kwantificeren van de genormaliseerde deeltjestelling over de capillaire breedte (dat wil zeggen een deeltje zich te stromen op een afstand over de capillaire breedte). Lagere stroomsnelheden meer vasthouden van deeltjes, maar resulteren in een lagere doorzet op volumebasis, die een nadeel voor zeldzame objectdetectie in high-volume monsters kan worden. Dit kan echter door meerdere doorgangen worden behandeld in het magnetische veld of via meer magneten. Scheiding tussen meerdere celtypes kunnen eveneens worden ingezet in toekomstige studies om de deeltjes met verschillende dichtheden te isoleren door gebruik van een microfluïdische scheider aan het einde van het magnetisch veld.

Bij het scheiden van meerdere celtypes, kan het nuttig zijn om elke populatie afzonderlijk zweven om de gemiddelde hoogte en het bereik van elk celtype voorafgaand aan het zweven homogene populatie vast.

e_content "> Beperkingen van de Techniek
De werkwijze die hier wordt beperkt tot het scheiden van deeltjes van verschillende dichtheden. Om betrouwbare identificatie van verschillende celtypes te bereiken, is het belangrijk dat zij afzonderlijk densiteit bereiken die niet overlappen. Verder kunnen de deeltjes die kunnen worden gedetecteerd zijn beperkt in omvang. Zij moeten in staat zijn om vrij binnen de microcapillaire buis te verplaatsen - 200 pm is de aanbevolen bovengrens op het deeltje diameter. Verder moet deeltjes groot genoeg zijn om duidelijk te beelden zijn - 5 urn is de aanbevolen ondergrens van de diameter.

Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods
Deze benadering van cellulaire analyse is eenvoudig, waardoor gebruiksvriendelijke analyses op het terrein. Veel medische diagnostische procedures moeten in klinische laboratoria worden uitgevoerd en vereisen gespecialiseerde testen van apparatuur en procedures uitgevoerd door een getrainde laboratorium specialist. Echter, dit protocol vereist een eenvoudig apparaat dat is meer toegankelijk voor de gezondheidszorg klinieken. De monstervoorbereiding is eenvoudig en de analyse is geautomatiseerd, het minimaliseren van de risico's voor de gebruiker fout.

Dit toestel zal een snelle, on-site testen van een verscheidenheid aan medische aandoeningen mogelijk maken. Het apparaat is gebruiksvriendelijk, label-free, en draagbaar, waardoor het ideaal is voor de ziekte van diagnose point-of-care. In vergelijking met de huidige standaard van remote klinisch laboratorium testen, zal deze aanpak artsen te snel weloverwogen beslissingen met betrekking tot de patiëntenzorg te maken mogelijk te maken en mogelijk te voorkomen complicaties als gevolg van vertragingen in de zorg. Het platform is ontworpen met gemakkelijk toegankelijke en goedkope componenten, waardoor wijdverbreide gebruik van deze methode in klinische settings en ontwikkelingslanden en het verbeteren van de hele wereld toegang tot de gezondheidszorg.

Toekomstige toepassingen of richtingen na beheersen van deze techniek
Het is belangrijk op te merken dat detesten hier beschreven zijn nog niet gevalideerd op een grote schaal patiëntenpopulatie. Tot op heden heeft sikkelcelziekte diagnose bevestigd in een kleine patiëntenpopulatie ^{2, 5} en WBC cytometrie is aangetoond als proof of concept. Klinische proeven met deze toepassingen die zijn ontwikkeld in de toekomst moeten worden uitgevoerd om deze methode vóór klinisch gebruik valideren, maar de hier gepresenteerde resultaten zijn veelbelovend voor uiteindelijk gebruik van deze technologie en techniek voor point-of-care klinische diagnostiek.

Met deze aanpak voor dichtheid gebaseerde cytometrische analyse kan uiteindelijk worden uitgebreid met bijkomende ziekten diagnostische toepassingen. Deze benadering van magnetische levitatie van enkele cellen voor diagnostica zoals hier beschreven is het gebruik van enkele-celsuspensies van cellen van een patiënt en naar cellen die kunnen worden afgebeeld met behulp van het huidige systeem zijn beperkingen van de resolutie door gebruikvan een smartphone camera of low-cost optiek. Verder is deze techniek toepasbaar ziekten die een van de volgende voorwaarden: (i) cellen plaats moet een veranderde dichtheid bereiken wanneer zij dragen de ziekte vergeleken met gezonde controles, (ii) een celdichtheid verandering moet induceerbaar door toevoeging van zijn een reagens (of alle beschikbare alternatieve behandeling), of (iii) de diagnose moet nagegaan welke verschillende celtypen in één monster die hetzij intrinsiek of via enige behandeling unieke dichtheden. Toekomstige toepassingen voor andere aandoeningen met behulp van hetzelfde platform apparaat kan een enorme impact hebben op de wereldwijde gezondheid. Deze kunnen detectie van biologische componenten, die worden onderscheiden door dichtheid. Bepaalde celtypen, cellen die celdood ondergaan, en zieke cellen zijn allemaal aangetoond unieke signaturen dichtheid en dus verschillende magnetische patronen, en kan worden gekwantificeerd en gescheiden onder toepassing van dit platform. Cellen in zeer lage aantallen kan ook be gedetecteerd door gebruik te maken van vloeistofstroom in de flow-geassisteerde magnetische levitatie apparaat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201