Levitazione magnetica Accoppiato con Imaging portatile e analisi per la malattia di diagnostica

Introduction

Qui, presentiamo una piattaforma tecnologica e una tecnica che utilizza la levitazione magnetica accoppiata con imaging e analisi automatizzata per analizzare la distribuzione della densità delle cellule del paziente come indicatore per la malattia. Questo approccio versatile per l'analisi di citometria di densità basata in ultima analisi può essere applicata a una vasta gamma di diagnostica delle malattie. Tuttavia, al fine di essere compatibile con i test point-of-care e l'uso in paesi in via di sviluppo, la tecnica deve soddisfare le esigenze di basso costo, portabilità e usabilità. Il dispositivo e consumabili devono essere ottenuti facilmente a basso costo. La preparazione del campione deve essere semplice, analisi dovrebbe essere automatizzato con i requisiti minimi per l'input dell'utente o di interpretazione, ed i risultati devono essere restituiti rapidamente. Inoltre, il dispositivo deve essere compatto e portatile per essere utile in situazioni cliniche così come i paesi in via di sviluppo. Così, abbiamo sviluppato un dispositivo e il metodo da utilizzare levitazione magnetica in point-of-care-compatibile TECHNOLlogia per accoppiamento automatico imaging e immagine analisi per restituire risultati per quanto riguarda la distribuzione della densità di una popolazione di cellule del paziente.

Point-of-care tecnologie offrono una notevole vantaggio rispetto attuali procedure di test clinici di laboratorio. La tecnologia attualmente disponibile è troppo costosi per essere posseduta dal medico o troppo complesso per essere effettuata da personale medico. Molte di queste procedure richiedono protocolli alta intensità di lavoro, che devono essere effettuate da un tecnico qualificato. Per queste ragioni, i campioni dei pazienti come il sangue o nelle urine sono generalmente raccolti in ufficio del medico poi trasferito in un laboratorio di analisi centralizzata a distanza per la sperimentazione clinica, che può richiedere diversi giorni per il medico per ricevere i risultati del test. Ciò può causare ritardi o complicazioni nel corso del trattamento, in alcuni casi, rende questo test molto costoso e inefficiente (causando un onere finanziario contribuenti assicurazione), e rende ulteriormente moltidiagnostica inaccessibili in ambienti con scarsa risorsa e nei paesi in via di sviluppo.

Qui, presentiamo una tecnica levitazione magnetica accoppiata con l'imaging automatizzato e analisi sia un dispositivo con immagini embedded e trasformazione (figura 1) ed un dispositivo smartphone compatibile (Figura 2). Questi dispositivi levitazione basati magnetici rappresentano una piattaforma tecnologica ampiamente applicabile, che ha il potenziale di essere applicata ad una gamma di diverse applicazioni diagnostiche mediche. Le funzioni magnetici approccio levitazione basati su un equilibrio tra due forze: una forza magnetica e una forza di galleggiamento ^{1, 2, 3.} Quando una particella viene sospesa in un mezzo paramagnetico e inserito in un campo magnetico generato da due magneti con poli come fronte all'altro, una forza agisce magnetica sulla particella nella direzione verso la linea centrale tra i due magn ETS. La forza di galleggiamento è causato dalla densità relativa della particella rispetto al mezzo di sospensione ed è alto nel caso di particelle meno dense rispetto alla media e verso il basso nel caso di particelle più dense del mezzo circostante. Sulla base di queste due forze, particelle raggiungono una posizione di equilibrio levitazione nel campo che equilibra queste due forze; questa posizione è direttamente correlata alla densità della particella, con particelle più dense levitare inferiore nel campo di particelle meno dense. Un modulo di imaging, sia incorporato smartphone telecamera ^{4, 5, 6} o componenti ottici indipendenti dotati di una lente di ingrandimento ^{7, 8,} vengono utilizzati per visualizzare le posizioni delle particelle. L'elaborazione delle immagini, sia attraverso una applicazione per smartphone ^{4, 5,}= "xref"> 6 o un'unità di elaborazione incorporato ^{7, 8,} quindi elabora le immagini catturate per quantificare la distribuzione spaziale e, di conseguenza, la distribuzione della densità della popolazione. Per analizzare campioni più grandi (come quelli con solo poche particelle di interesse per millilitro, il flusso può essere integrato direttamente nel dispositivo di tali particelle rimangono sospesi ed analizzato che passano attraverso la regione di imaging (Figura 2).

Figura 1: Self-contained piattaforma levitazione magnetica. (A) un dispositivo di levitazione magnetica compatto con un modulo magnetico focalizzazione, componenti di imaging (un diodo (LED emettitori di luce), una lente ottica, e un rivelatore fotocamera), ed un'unità di elaborazione con uno schermo di visualizzazione. (B) l'intensità del campo magnetico nella cross-sezione dell'area tra i magneti in cui viene inserito il campione. L'intensità del campo è massima in corrispondenza della superficie dei magneti e si avvicina a zero in corrispondenza della mezzeria tra loro. (C) Particelle, come le cellule, nei magnetico esperienza campo diverse forze: una forza magnetica (F _m) verso l'asse tra magnetismo, con ampiezza variabile in base alla posizione della particella; una forza gravitazionale (F _g '), che dipende dalla densità delle particelle rispetto a quella del mezzo di sospensione, e una forza di trascinamento (F _d) resistendo moto delle particelle. Riprodotto, con il permesso, da Yenilmez, et al. ⁸ Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figuraure 2: compatibile con Smartphone Flow-assistita piattaforma levitazione magnetica. (A - c) anteriore (a), laterale (b), e viceversa (c) vista dispositivo magnetico di levitazione (d) I componenti del dispositivo includono: 1) Modulo di levitazione magnetica, compresi magneti permanenti, una lente di ingrandimento, e un diffusore a LED e luce, 2) caso smartphone, 3) l'elettronica, tra cui un microcontrollore, autista pompa, e il ricevitore Bluetooth, 4) porta micro-pompa, 5) orifizio regolabile, 6) supporto tubo di scarico, 7) porta-batteria, 8 ) supporto del campione, 9) supporto dual-purpose e la copertura. (E) di flusso schematico che mostra pompaggio del campione attraverso il campo magnetico. (F) Sezione del modulo levitazione magnetica, che mostra come le particelle di densità diverse saranno allineati come sono pompati attraverso il campo; meno dense di particelle, come ad esempio particelle 1, sarà equilibrare a una maggiore altezza di levitazione than particelle più dense, come particelle 2. riprodotto, con il permesso, da Amin, et al. ¹ Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

I requisiti minimi relativi all'uso di qualsiasi campione per analisi distribuzione di densità di questo sistema includono la capacità di ottenere una sospensione di cellule o particelle maggiori di circa 5 micron e meno di circa 250 micron di dimensione (per l'imaging e di elaborazione delle immagini) e la sua compatibilità con miscelazione in soluzione di una soluzione paramagnetico come il gadobutrolo usato qui. Per la diagnosi di malattie, applicazioni compatibili includono quelli in cui (i) cellule di interesse ha intrinsecamente una densità alterata quando realizzano una malattia rispetto ai controlli sani, (ii) un cambiamento di densità può essere indotta nella cella mediante aggiunta di un reagente o qualche trattamento alternativo per un brevetempo cubation, o (iii) diversi tipi cellulari sono stati identificati in un singolo campione e intrinsecamente (o attraverso trattamento) hanno densità caratteristiche uniche.

L'anemia falciforme è una malattia genetica che causa una forma mutata di emoglobina, HbS, ad essere prodotto nei globuli rossi di una persona (RBC), che può causare intermittenti eventi vaso-occlusivi e anemia emolitica cronica ^9. Esso viene diagnosticata utilizzando emoglobina isoelettrofocalizzazione, cromatografia liquida ad alta prestazione elettroforesi (HPLC) di frazionamento o di emoglobina che sono estremamente preciso, ma deve essere eseguita in un laboratorio di analisi cliniche, perché sono incompatibili con le impostazioni point-of-care. Solubilità e test a base di carta per anemia falciforme sono stati proposti, ma in genere richiedono interpretazione utente soggettiva e test di conferma. Qui, usiamo un approccio di densità a base di identificare i globuli rossi falciformi, che raggiungere una densità maggiore di RBCs da persone senza anemia falciforme. Il meccanismo prevede polimerizzazione della forma mutata di emoglobina, HbS, che provoca RBC disidratazione falce globuli rossi malattie cellula in condizioni deossigenate ^{10, 11, 12, 13.}

Questo approccio densità basato può essere applicato anche per separare le cellule di tipo diverso sulla base della densità: globuli bianchi (WBC) e RBC ^7. Leucociti sono generalmente responsabile per combattere le infezioni nel corpo. WBC citometria può essere usata per quantificare il numero di queste cellule nel sangue e serve come un utile strumento diagnostico. WBC conta più alto del normale (generalmente considerata superiore a 11.000 cellule per mL) possono indicare infezioni, disturbi del sistema immunitario, o leucemia. WBC conta al di sotto del range di normalità (circa 3.500 cellule per mL) possono essere causati da malattie autoimmuni o Conditioni che danni del midollo osseo. A differenza delle tecnologie alternative, il processo qui presentato non si basa su lisi dei globuli rossi o macchie per identificare globuli bianchi. Questo test cell-based sfrutta le densità intrinseche uniche dei due tipi di cellule di eseguire la separazione, come la densità di popolazione WBC è stato segnalato per essere inferiore a quello della popolazione RBC calcolato precedentemente con gradiente di densità centrifugazione ^{2, 3.}

Rispetto ai test alterative in posizioni remote, questo test è rapido, con semplice preparazione del campione (figura 3), la separazione delle cellule nel dispositivo in 10 - 15 min, imaging e analisi automatizzata che richiede meno di 1 min. In questo modo, il dispositivo può restituire risultati rapidamente per informare meglio le decisioni mediche, permettere un trattamento da somministrare immediatamente per alleviare il dolore fisico e psicologico, e ridurre il rischio di complicanze Associated con un ritardo nelle cure mediche. Questa tecnica può essere eseguita sul posto sia in ambito clinico causa di semplice preparazione del campione e di imaging automatizzati e analisi che restituisce un risultato con il minimo input dell'utente o interpretazione. A causa dell'uso di un approccio semplice mediante magneti permanenti per l'analisi del campione e l'utilizzo della propria smartphone o componenti elettrici semplici per l'imaging e di elaborazione delle immagini, il dispositivo così come i costi per test sono minime rispetto ad alcune procedure di test sofisticati.

Protocol

Dichiarazione etica: Tutte le procedure che coinvolgono campioni di sangue umano sono state effettuate secondo le norme istituzionali. Tutti i protocolli sono stati esaminati e approvati dal Institutional Review Board. Un consenso informato è stato dato da tutti i partecipanti.

Preparazione 1. Esempio per anemia falciforme Diagnosi ^{5, 8}

1. Preparare una soluzione 50 mm di gadobutrolo in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS).
2. Sciogliere 10 mM sodio metabisolfito nella soluzione gadolinio.
   NOTA: metabisolfito di sodio è tossico per inalazione e fortemente irritante per la pelle e dei tessuti. È un acido corrosivo in miscela con acqua. Si può decomporsi emettere fumi tossici di ossidi di zolfo e sodio quando riscaldato ad alta temperatura.
3. Ottenere campione di sangue sia tramite polpastrello o prelievo venoso.
   1. Prelevare il sangue con un pungidito con un panno pulito Lancet, usa e getta. Appressione ply nei pressi del sito trafitto e pulire la goccia di sangue formata da tre a quattro volte prima di raccogliere il sangue con una pipetta; fare attenzione a non "latte" il dito comprimendo il tessuto, in modo da provocare la contaminazione del campione con tessuto fluido.
   2. In alternativa, prelevare il sangue con procedure di venipuntura standard di ^14.
      NOTA: Se i campioni saranno conservati per più di un paio d'ore, raccogliere il sangue in un Vacutainer con un anticoagulante, come EDTA.
4. Aggiungere meno di 1 ml di sangue per 100 ml di soluzione di metabisolfito di sodio gadolinio.

2. Preparazione del campione per la WBC citometria a ⁷

1. Ottenere campione di sangue sia tramite dito o prelievo venoso, come nella sezione 1.
2. Optional: Lyse globuli rossi con un tampone di lisi RBC. Pipettare 5 ml di sangue in 500 ml di tampone di lisi RBC e incubare a temperatura ambiente per 3-5 min.
   NOTA:ciò può essere fatto per confermare la gamma levitazione di una popolazione isolata di globuli bianchi. Tuttavia, non è necessario eseguire questo passaggio, i risultati qui presentati dimostrano che globuli rossi levitare in una posizione nettamente inferiore leucociti.
3. Diluire sangue intero 1: 1.000 in 25 mM Gd in HBSS
   NOTA: se è stata eseguita la lisi cellulare, diluire il campione lisato 9: 1 campione lisato: 250 mM Gd di ottenere un campione contenente 25 mM Gd.

3. Analisi di campioni che utilizzano la piattaforma di levitazione magnetica ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Avviare il dispositivo di levitazione magnetica:
   1. Per il dispositivo self-contained, collegare il dispositivo, permettono di accendere, e posto su una superficie piana.
   2. Per la versione smartphone compatibile, avviare l'applicazione per smartphone e scorrere a sinistra per entrare immaginemodalità di cattura, e posto su una superficie piana.
2. Per levitazione magnetica statica:
   1. Caricare il campione preparato in un microcapillare vetro quadrato immergendo l'estremità nella soluzione e consentendo il campione per riempire il capillare tramite azione capillare.
   2. Sigillare l'estremità con un sigillante tubo spingendo lentamente una estremità del capillare nel materiale.
   3. Inserire il capillare tra i magneti del dispositivo di levitazione magnetica in modo che solo 1 cm del tubo rimane visibile (si veda la Figura 3 per un'illustrazione la preparazione del campione).
      NOTA: Questo passaggio rimane la stessa sia per il dispositivo compatibile con lo smartphone e autosufficiente.
   4. Attendere 10 min senza disturbare il dispositivo o il capillare.
3. Per levitazione magnetica flow-assistita:
   1. Caricare il campione nella provetta.
   2. Collegare il tubo di ingresso tra il contenitore del campione e microcapillary e collegare il tubo di uscita tra il microcapillare e contenitore di rifiuti.
   3. Impostare i parametri di intensità e portata a LED.
4. Assicurarsi che le cellule sono visibili nel campo visivo, premere il pulsante di acquisizione per acquisire un'immagine (pulsante 3 sul dispositivo autonomo e il pulsante della fotocamera sulla parte inferiore della schermata nell'applicazione smartphone).
   NOTA: Se si utilizza una porta USB per archiviare le immagini, creare una cartella chiamata "immagini" e inserire il cavo USB prima di accendere il dispositivo. Se nessuna unità è presente, il dispositivo memorizza le immagini nella sua memoria interna e trasferito in seguito.
   NOTA: Diverse immagini possono essere catturate e analizzati per ridurre il rischio di anomalie spostando il capillare dentro o fuori circa ½ cm tra cattura delle immagini.
   NOTA: Se il numero di cellule all'interno del campo visivo è troppo alta o troppo bassa (come rilevato e segnalato sull'interfaccia utente), spostare il capillare in o fuori del dispositivo o preparare un altro sample.
5. Rimuovere il campione e scartare il campione secondo le norme istituzionali o locali. Capillari devono essere smaltiti come un forte.

Figura 3: Preparazione del campione e interfaccia utente. (A) La procedura di preparazione del campione comporta pungidito dito del soggetto, formando una gocciolina di sangue, trasferendo la goccia di sangue per la soluzione di test del campione, agitando il campione e il caricamento in un tubo capillare tramite azione capillare, e inserendo il campione nella levitazione magnetica dispositivo. (B) Queste fasi di preparazione del campione vengono visualizzati anche sullo schermo del dispositivo per guidare la preparazione del campione. (C) Il dispositivo include quattro pulsanti: un pulsante per lo zoom nell'immagine di esempio, al fine di regolare correttamente la messa a fuoco utilizzando la manopola di regolazione; un pulsante per ottenere un singolo measurement (a 5 s ritardo viene implementata per consentire il tempo per l'utente di inserire il campione); una misura di time-lapse (6 immagini sono prese a intervalli di 5 s); e un pulsante per spegnere il dispositivo dopo l'uso. Riprodotto, con il permesso, da Yenilmez, et al. ⁸ Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

4. Image Analysis ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Eseguire il software di analisi di immagine incluso nel dispositivo per il campione appropriato (distribuzione cellulare o tipo cellulare di separazione).
   NOTA: Per il dispositivo autonomo, l'analisi viene eseguita automaticamente e visualizzato sull'interfaccia utente grafica. Per il dispositivo smartphone compatibile, per eseguire l'analisi, andare alla galleria di unND selezionare il file video desiderato da analizzare.
2. Osservare e registrare l'uscita dell'analisi visualizzata sullo schermo.
   NOTA: Per l'analisi della distribuzione delle cellule (ad esempio falce diagnosi malattia a cellule), l'uscita sarà la larghezza del confinamento della popolazione cellulare.
   NOTA: Per il tipo di cellule di separazione (quali l'identificazione WBC), l'uscita sarà un'immagine con la popolazione WBC identificato. Per calcolare il numero di cellule per microlitro, moltiplicare il numero medio di leucociti per immagine di un fattore 2.000. Ad esempio, se sono stati osservati 5 leucociti, questo indicherebbe 10.000 leucociti / ml. Il range di normalità è generalmente considerato come 3.500 - 11.000 leucociti / ml.
3. Ripetere l'analisi spostando il tubo campione dentro o fuori del dispositivo di circa ½ cm e catturare un'altra immagine da analizzare come descritto sopra.
   NOTA: Si consiglia di ripetere l'analisi 5 - 6 volte per campione per evitare errori.

Representative Results

Per l'analisi della distribuzione della densità delle cellule, che è la tecnica usata per la diagnosi della malattia falce cella, lo scopo è di individuare la larghezza della distribuzione della popolazione cellulare. Cellule del sangue da pazienti senza anemia falciforme saranno confinati all'interno di una larghezza prevedibile. Le cellule da pazienti con anemia falciforme saranno distribuiti in tutta una regione più ampia, con una inclinazione verso il basso nella distribuzione delle cellule (vedi Figura 4.) Per ogni particolare applicazione, una soglia può essere impostato tra la larghezza di distribuzione dei campioni di controllo rispetto a quello della salute campioni come cutoff tra "sana" e "positivo per la patologia" ^{5, 8.}

Figura 4: Esempio di levitazione magnetica per analizzare Densitày Distribution come indicatore di anemia falciforme nei campioni di sangue. A sinistra, i globuli rossi sono ben confinati all'interno di una regione stretta. Sulla destra, un sottogruppo di globuli rossi raggiungere una maggiore densità e quindi una altezza di levitazione inferiore, alterando la distribuzione verso il basso e aumentare la larghezza del parto. Barra di scala = 200 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Per analizzare la distribuzione della densità di un campione, un algoritmo di calcolo è implementato all'interno del dispositivo. Innanzitutto, i gradienti di intensità dei pixel lungo gli assi verticale e orizzontale sono calcolati. I bordi magnete ei bordi capillari vengono rilevati come i picchi nei profili pixel gradiente verticale. La distanza fra i bordi interni capillari, in pixel, è noto per essere di 0,7 mm ed è quindi utilizzata come scaling fattore per convertire distanze da pixel a millimetri. Il gradiente di intensità dei pixel lungo l'asse orizzontale è più grande in cui si trovano le cellule. Questo profilo di gradiente viene analizzata e forma una curva gaussiana. Il valore 4 volte la deviazione standard di questa curva viene segnalato come la larghezza di confinamento.

Risultati in figura 5 mostrano le larghezze di confinamento sia per il controllo e la falce campioni di malattia delle cellule. Qui, i campioni con una maggiore larghezza di confinamento (oltre 50 micron) sarebbero considerati anemia falciforme positivi e quelli di sotto di tale soglia sarebbero stati considerati negativi per la malattia. Va notato che altri metodi di analisi della distribuzione falciforme sono stati studiati e riportata da Yenilmez, et al. ⁸

figura5: Quantificazione del larghezza confinamento per anemia falciforme diagnosi. I risultati sperimentali per la larghezza confinamento di controllo (n = 48 immagini oltre 4 soggetti) e anemia falciforme (n = 93 immagini oltre 10 soggetti) globuli rossi. I risultati sono statisticamente significativi secondo un test Mann-Whitney-Wilcoxon due lati (approssimazione normale, n ₁ = 3, n = ₂ 10, Z = -2,6764, p = 0,0074). I baffi rappresentano le larghezze massime di confinamento minimo e dai campioni testati e asterischi rappresentano valori anomali. Riprodotto, con il permesso, da Yenilmez, et al. ⁸ Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Per la separazione di particelle, che può essere utilizzato per identificare leucociti nei campioni di sangue, lo scopo è quello di individuare due distinte apprezzioni. Se le popolazioni hanno densità differenti, saranno osservati in regioni distinte nel campo visivo. Così, popolazioni omogenee di due o più particelle con densità distinti possono essere levitare e, all'atto della separazione, le popolazioni multiple possono essere osservati in immagine e rilevati utilizzando l'algoritmo di analisi di immagine ⁴ (vedere Figura 6).

Per analizzare la separazione di due diversi tipi di cellule, un algoritmo è implementato che distingue le due popolazioni separate all'equilibrio. In un modo simile a quello descritto per l'analisi anemia falciforme, due distribuzioni Gaussiane sono idonei al campione, piuttosto che una singola curva. Ogni picco nei gradienti di intensità pixel rappresenta una popolazione di cellule diverso. Le curve gaussiane adatti a questi dati forniscono sia l'altezza di levitazione media (rispetto alla posizione del magnete inferiore) come media della curva gaussiana eil confinamento della larghezza, la deviazione standard della curva ^7.

Figura 6: Esempio di levitazione magnetica di una popolazione mista di microparticelle con densità Distinct. (A) Le curve di calibrazione correlazione densità microsfere con altezza di levitazione in cinque diverse concentrazioni Gd vanno da 12,5 a 200 mM. La pendenza è maggiore alle concentrazioni più basse di Gd, offrendo così una risoluzione maggiore (cioè sensibilità alle differenze di densità di piccole dimensioni). La pendenza è più basso per alte concentrazioni di Gd, che dimostrano la maggiore gamma di rilevamento, ma con una risoluzione inferiore. (B) in funzione del tempo di separazione di una omogenea microsfere campione con due densità distinti nel corso di due minuti. All'equilibrio (a destra), due bande distinte vengono rilevati dal anale immaginealgoritmo Ysis. Riprodotto, con il permesso, da Yenilmez, et al. ⁷ Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Per identificare i tipi di cellule individuali con densità distinti per ogni applicazione, è consigliabile levitare primo tipo cellulare alla volta per quantificare l'altezza di levitazione previsto. La Figura 7a mostra l'altezza di levitazione di leucociti da un campione di sangue in cui sono state lisate globuli rossi. Questo definisce la regione di confinamento di leucociti per ulteriori analisi. I risultati indicano che i globuli rossi levitare inferiore leucociti e, in tal modo, globuli bianchi possono essere distinti da campioni di sangue in base alla posizione di levitazione. Il volume all'interno di un determinato campo di vista è di 0,5 ml. In campioni che sono stati diluiti 1: 1000, il numero di leucociti / ml può essere calcolato contandoil numero di leucociti nel campo visivo e moltiplicando per un fattore di 2.000 ^7.

Figura 7: WBC Citometria nel sangue intero. (A) Levitazione di globuli bianchi dal sangue seguenti RBC lisi. Questo definisce l'intervallo in cui leucociti levitare nel campo magnetico in 25 mM Gd. (B) Esempio di conteggio WBC (globuli bianchi segnato da frecce blu). L'intarsio cornice superiore mostra globuli bianchi e la cornice inferiore e l'intarsio frame inferiore mostra la popolazione RBC. Riprodotto, con il permesso, da Yenilmez, et al. ⁷ Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

I passaggi critici all'interno del protocollo
Fattori critici in questo processo includono il corretto allineamento dei magneti. Se i magneti diventano sloggiato o separati più del normale all'interno del dispositivo, questo può influenzare i risultati. Per controllare questo guasto o altri nel processo, una particella di densità controllata, ad esempio microsfere di polistirene, può essere utilizzato periodicamente per controllare le variazioni nel tempo. Inoltre, il tempo di levitazione è importante per permettere alle cellule di raggiungere l'equilibrio. Per globuli rossi, 10 min è sufficiente per consentire tutte le celle di raggiungere l'equilibrio. Tuttavia, è importante notare che le particelle o cellule più piccole possono richiedere più tempo per raggiungere l'equilibrio. Questo può essere valutata prendendo immagini lasso di tempo in un intervallo di 5 s e tracciando la larghezza di confinamento nel corso del tempo; equilibrio può essere determinato come il punto in cui la variazione di larghezza di confinamento è trascurabile.

Altri passaggi critici all'interno del protocollo sono il preparazione della soluzione gadolinio alla concentrazione precisa come questo influenza notevolmente l'altezza di levitazione campione. Ciò può essere effettuato prima del tempo ed utilizzato da una soluzione madre, ma deve essere sigillato correttamente per evitare l'evaporazione della soluzione e un aumento non intenzionale della concentrazione. Inoltre, la cura deve essere presa per mantenere lo stato di salute delle cellule utilizzate. Per il sangue umano disegnata con dito, esso deve essere utilizzato entro un'ora di prelievo del sangue e non lascia asciugare memorizzando in un contenitore sigillato. Per sangue umano disegnato da prelievo venoso, i campioni devono essere conservati a 4 ° C per non più di una settimana con anticoagulante (acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), un anticoagulante comuni, è stato utilizzato qui). Per le linee di cellule aderenti, le cellule morte devono essere lavati accuratamente dalla cultura prima tripsinizzazione e le cellule devono essere incubate fino al momento dell'uso. La salute delle cellule al momento della levitazione è fondamentale, perché la salute delle cellule è noto per influenzare la densità e quindi la levitazione altezzat.

Modifiche e risoluzione dei problemi
Abbiamo dimostrato la separazione e il confinamento delle cellule di due densità differenti in posizioni prevedibili nel campo magnetico. Per estendere questa tecnica per altre applicazioni, diverse formulazioni del mezzo paramagnetico possono essere utilizzati per ottenere un intervallo desiderato di rilevamento per applicazioni alternative ^3. La concentrazione di gadolinio governa la risoluzione del rilevamento e l'intervallo (fare riferimento alla Figura 6a). Poiché una maggiore concentrazione di gadolinio aumentano la resistenza della forza magnetica applicata alle cellule, maggiore è la concentrazione di gadolinio in soluzione di sospensione, minore è la differenza di altezza di levitazione sarà Qualsiasi differenza di densità cellulare. Mentre questo limita la risoluzione, definita come la capacità di distinguere tra piccole differenze di densità cellulare, aumenta la gamma di densità che può essere analizzanod. Analogamente, diminuendo la concentrazione di gadolinio aumenta la risoluzione ma ridurre il campo di rilevamento. Inoltre, la densità del fluido può essere alterato per spostare i limiti di rilevamento ascendente o discendente. La seconda forza che controlla l'altezza di levitazione è la forza di galleggiamento, che dipende dalla densità relativa della cella rispetto a quella del mezzo di sospensione. Qui, una soluzione di sospensione a base di acqua viene utilizzata, significa che le cellule con una densità che è la stessa di quella della levitare supporto in corrispondenza della mezzeria tra i due magneti con cellule meno densi o dense levitare sopra o sotto la linea centrale, rispettivamente, (con un intervallo controllato dalla forza magnetica come descritto in precedenza). Poiché spinta idrostatica dipende densità relativa, aumentando la densità del mezzo sposterà la gamma di rilevamento ad una più alta gamma di densità cellulari. Allo stesso modo, usando un mezzo di densità inferiore si sposterà il campo di rilevamento verso un rapporto inferiore di densità cellulari. < / P>

Abbiamo anche studiato le prestazioni del dispositivo di focalizzazione magnetica flusso assistita quantificando il conteggio particellare normalizzato attraverso la larghezza capillare (cioè probabilità di una particella a scorrere a distanza attraverso la larghezza capillare). portate inferiori hanno più confinamento di particelle, ma producono un flusso volume più basso, che può essere uno svantaggio per il rilevamento di oggetti rari in campioni ad alto volume. Tuttavia, questo può essere affrontato da più passaggi nel campo magnetico o tramite magneti più lunghi. Separazione tra diversi tipi di cellule può anche essere sfruttato in studi futuri per isolare le particelle di densità differenti sfruttando un separatore microfluidica alla fine del campo magnetico.

Nel separare più tipi di cellule, può essere utile levitare ciascuna popolazione singolarmente per stabilire l'altezza media e la gamma di ogni tipo di cellula prima levitare popolazione omogenea.

e_content "> limiti della tecnica
Il processo qui presentato è limitata alla separazione di particelle di densità distinti. Per realizzare l'identificazione affidabile di più tipi di cellule, è importante che hanno intervalli di densità discrete che non si sovrappongono. Inoltre, le particelle che possono essere rilevati sono limitate dimensioni. Essi devono essere in grado di muoversi liberamente nel microcapillare - 200 micron è il limite superiore consigliato sul diametro delle particelle. Inoltre, le particelle devono essere abbastanza grandi per essere ripreso chiaramente - 5 micron è il limite inferiore consigliata sul diametro.

Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /
Questo approccio alla analisi cellulare è semplice, consentendo analisi user-friendly in loco. Molte procedure diagnostiche mediche devono essere effettuate in laboratori clinici e richiedono specializzato attrezzature e procedure eseguite da un laboratorio di specialis addestrato testt. Tuttavia, questo protocollo richiede un dispositivo semplice che è più accessibile alle cliniche sanitarie. La preparazione del campione è semplice e l'analisi è automatizzato, minimizzando il rischio di errore dell'utente.

Questo dispositivo consentirà rapida, on-site test per una varietà di condizioni mediche. Il dispositivo è facile da usare, senza etichetta, e portatile, che lo rende ideale per point-of-care diagnostica delle malattie. Rispetto alla attuale standard di test di laboratorio clinico a distanza, questo approccio consentirà ai medici di prendere rapidamente decisioni informate per quanto riguarda la cura del paziente e potenzialmente prevenire le complicanze a causa di ritardi nella cura. La piattaforma è stata progettata con componenti facilmente accessibili e poco costosi, permettendo l'uso diffuso di questo metodo in ambito clinico e nei paesi in via di sviluppo e il miglioramento dell'accessibilità tutto il mondo per l'assistenza sanitaria.

Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica
È importante notare che iltest qui descritti non sono ancora validati su una popolazione di pazienti su larga scala. Fino ad oggi, la falce la diagnosi delle malattie delle cellule è stata confermata in un piccolo paziente coorte ^{2, 5} e WBC citometria è stato dimostrato come un proof of concept. Gli studi clinici con queste applicazioni e quelle sviluppate in futuro devono essere eseguite al fine di validare questo metodo prima di uso clinico, ma i risultati qui presentati mostrano la promessa per l'eventuale uso di questa tecnologia e la tecnica per point-of-care diagnostica clinica.

Usando questo approccio per l'analisi di citometria di densità basata in ultima analisi, può essere esteso a ulteriori applicazioni diagnostiche malattia. Questo approccio di levitazione magnetica di singole cellule per la diagnostica di malattie come qui descritto richiede l'uso di sospensioni monocellulari di cellule del paziente e alle cellule che possono essere esposte utilizzando il sistema attuale con i suoi limiti sulla risoluzione per usodi una macchina fotografica o smartphone ottica a basso costo. Inoltre, questa tecnica è applicabile a malattie che soddisfano una delle seguenti condizioni: (i) cellule di interesse deve raggiungere una densità alterata quando eseguono la malattia rispetto ai controlli sani, (ii) un cambiamento densità delle cellule devono essere inducibile mediante aggiunta di un reagente (o qualsiasi trattamento alternativo disponibile), o (iii) la diagnostica deve comportare identificare diversi tipi di cellule in un singolo campione che sia intrinsecamente o attraverso trattamento ha densità unici. Le future applicazioni ad altre malattie che utilizzano lo stesso dispositivo piattaforma può avere un enorme impatto sulla salute globale. Questi possono includere il rilevamento di componenti biologici, che si distinguono per la densità. Alcuni tipi di cellule, le cellule che stanno subendo la morte delle cellule, e le cellule malate hanno tutti dimostrato di avere le firme di densità uniche e quindi modelli magnetici distinti, e possono quindi essere quantificata e separati utilizzando questa piattaforma. Le cellule in numeri molto bassi possono anche Be rilevato sfruttando il flusso del fluido nel dispositivo levitazione magnetica del flusso-assistita.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201