Introduction
Aqui, apresentamos uma plataforma tecnológica e uma técnica que utiliza levitação magnética juntamente com imagiologia e análise automatizada para analisar a distribuição da densidade de células de um paciente como um indicador para a doença. Esta abordagem versátil para análise de citometria de densidade baseada em última instância pode ser aplicado a uma gama de diagnóstico de doenças. No entanto, a fim de ser compatível com os testes point-of-care e uso em países em desenvolvimento, a técnica deve satisfazer os requisitos de baixo custo, portabilidade e facilidade de uso. O dispositivo e consumíveis deve ser facilmente obtidos a um custo baixo. A preparação da amostra deve ser simples, a análise deve ser automatizada com os requisitos mínimos para entrada do usuário ou interpretação, e os resultados devem ser devolvidos rapidamente. Além disso, o dispositivo deve ser compacto e portátil para ser útil em ambientes clínicos, bem como os países em desenvolvimento. Assim, desenvolvemos um dispositivo e método para usar levitação magnética no ponto de atendimento compatível com tecnogia por análise de imagem e imagem de acoplamento automatizado para retornar os resultados sobre a distribuição de densidade de uma população de células de um paciente.
tecnologias de ponto de cuidados oferecem uma vantagem notável sobre procedimentos de testes laboratoriais clínicos atuais. A tecnologia disponível atualmente é muito caro para ser possuído por um clínico ou demasiado complexo para ser realizada por pessoal médico. Muitos desses procedimentos exigem protocolos de trabalho intensivo que deve ser realizado por um técnico treinado. Por estas razões, as amostras dos doentes, tais como sangue ou urina são geralmente recolhidas no consultório do médico, em seguida, transferidas para um laboratório remota e centralizada de teste para testes clínicos, o que pode levar vários dias para o médico para receber os resultados do teste. Isto pode causar atrasos ou complicações no decurso do tratamento em alguns casos, faz com que este teste muito dispendioso e ineficiente (causando um encargo financeiro para os contribuintes de seguros), e faz com que muitos maisdiagnósticos de difícil acesso em ambientes de baixa renda e países em desenvolvimento.
Aqui, nós apresentamos uma técnica de levitação magnética acoplada com imagem automatizada e análise em ambos com um dispositivo de imagem incorporado e processamento (Figura 1) e um dispositivo de aparelho compatível (Figura 2). Estes dispositivos à base de levitação magnética representam uma tecnologia de plataforma amplamente aplicável, que tem o potencial de ser aplicado a uma variedade de diferentes aplicações de diagnóstico médico. As funções de abordagem de levitação magnética baseado num equilíbrio entre duas forças: uma força magnética e uma força de flutuação 1, 2, 3. Quando uma partícula é suspenso num meio paramagnético e inserido num campo magnético gerado por dois ímans com pólos como viradas uma para a outra, uma atos força magnética sobre as partículas na direcção para a linha central entre os dois magn ets. A força da impulsão é causada pela densidade relativa da partícula em relação ao meio de suspensão e é ascendente, no caso de partículas menos densas do que o meio e para baixo no caso de partículas mais densas do que o meio circundante. Com base nestas duas forças, as partículas vão chegar a uma posição de equilíbrio do campo de levitação em que equilibra estas duas forças; esta posição está directamente relacionada com a densidade da partícula, com as partículas mais densas levitação menor no campo do que as partículas menos densas. Um módulo de imagem, quer uma câmara integrada aparelho 4, 5, 6 ou componentes ópticos independentes equipado com uma lente de ampliação de 7, 8, são utilizadas para visualizar as posições das partículas. Processamento de imagem, quer através de um aplicativo de smartphone 4, 5,= "refex"> 6 ou uma unidade de processamento embebido 7, 8, em seguida, processa as imagens capturadas para quantificar a distribuição espacial e, por conseguinte, a distribuição da densidade da população. A fim de analisar as amostras maiores (tais como aqueles com apenas algumas partículas de interesse por mililitro, o fluxo pode ser integrado directamente no dispositivo tal que as partículas são levitado e analisadas à medida que passam através da região de imagem (Figura 2).
Figura 1: Auto-contido Plataforma levitação magnética. (A) dispositivo de levitação magnética compactos, incluindo um módulo magnético focagem, componentes de imagem (um díodo emissor de luz (LED), uma lente óptica, e um detector de câmara), e uma unidade de processamento com um ecrã de visualização. (B) a força do campo magnético no croSS-secção da área entre os ímans que se insere a amostra. A intensidade do campo é maior na superfície dos ímans e se aproxima de zero na linha central entre eles. (C) As partículas, tais como células, dentro da experiência de campo magnético várias forças: a força magnética (F m) para a linha central entre os magnetos, com magnitude variando com base na posição da partícula; uma força gravitacional (F G ') que depende da densidade das partículas em relação à do meio de suspensão, e uma força de arrastamento (f d) resistindo ao movimento das partículas. Reproduzido, com permissão, de Yenilmez, et al. 8 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
FIGure 2: Smartphone compatível Flow-assistida Plataforma levitação magnética. (A - c) Frontal (a), lateral (b), e de volta (c) pontos de vista de dispositivo magnético de levitação (d) Os componentes do dispositivo incluem: 1) módulo de levitação magnética, incluindo ímãs permanentes, uma lente de aumento e um difusor LED e luz, 2) caso do smartphone, 3) eletrônica, incluindo um microcontrolador, controlador da bomba, e um receptor Bluetooth, 4) titular micro-bomba, 5) orifício ajustável, 6) suporte de tubos de resíduos, 7) suporte da bateria, 8 ) suporte de amostras, 9) suporte dual-purpose e cobertura. (E) fluxo esquemático, que mostra o bombeamento da amostra através do campo magnético. (F) Secção transversal do módulo de levitação magnética, que mostra como as partículas de diferentes densidades irá alinhar como eles são bombeados através do campo; menos partículas densas, como a partícula 1, irá equilibrar-se a um maior levitação altura than partículas mais densas, como a partícula 2. Reproduzido, com permissão, de Amin, et al. 1 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os requisitos mínimos para o uso de qualquer amostra para análise da distribuição de densidade neste sistema incluem a capacidade para se obter uma suspensão de células ou partículas maiores do que cerca de 5 um e menos do que cerca de 250 um em tamanho (para imagens e processamento de imagens) e da sua compatibilidade com a mistura em uma solução de uma solução paramagnética como o gadobutrol usado aqui. Para o diagnóstico de doenças, aplicações compatíveis incluem aqueles em que (i) as células de interesse inerentemente tem uma densidade alterada quando executam uma doença em comparação com controlos saudáveis, (ii) uma alteração da densidade pode ser induzida na célula através da adição de um reagente ou alguns tratamento alternativo para uma curta emcubation tempo, ou (iii) diferentes tipos de células estão a ser identificados numa única amostra e inerentemente (ou através de algum tipo de tratamento) têm densidades características únicas.
A doença das células falciformes é uma desordem genética que causa uma forma mutada da hemoglobina, da HbS, a ser produzido em células vermelhas do sangue de uma pessoa (RBCs), que pode resultar em efeitos vaso-oclusivas intermitentes e anemia hemolítica crónica 9. Ela é diagnosticada usando hemoglobina focalização isoeléctrica, cromatografia líquida de alta eficiência eletroforese (HPLC) fracionamento, ou hemoglobina, que são altamente precisos, mas deve ser realizado em um laboratório de ensaio clínico porque são incompatíveis com as configurações de ponto-de-cuidado. Solubilidade e testes baseados em papel para a doença falciforme têm sido propostas, mas geralmente exigem interpretação usuário subjetiva e teste de confirmação. Aqui, utilizamos uma abordagem baseada em densidade para identificar hemácias falciformes, que alcançam uma densidade mais elevada do que RBCs de pessoas sem doença falciforme. O mecanismo envolve a polimerização da forma mutada da hemoglobina, HbS, o que provoca a desidratação RBC nas hemácias falciformes em condições desoxigenadas 10, 11, 12, 13.
Esta abordagem baseada em densidade também pode ser aplicado para separar as células de diferentes tipos com base na densidade: células brancas do sangue (leucócitos) e hemácias 7. Glóbulos brancos são geralmente responsáveis pelo combate a infecções no corpo. citometria de WBC pode ser utilizado para quantificar o número destas células no sangue e funciona como uma ferramenta de diagnóstico útil. As contagens de WBC elevado do que o normal (geralmente considerado maior do que 11.000 células por uL) pode indicar uma infecção, perturbações do sistema imunitário, ou leucemia. As contagens de WBC abaixo do intervalo normal (cerca de 3.500 células por uL) pode ser causada por distúrbios auto-imunes ou Conditiões que danos medula óssea. Ao contrário de tecnologias alternativas, o processo aqui apresentado não depende de lise dos glóbulos vermelhos ou manchas, a fim de identificar os glóbulos brancos. Este teste baseado em células aproveita as densidades inerentes únicas dos dois tipos de células para realizar a separação, tal como a densidade de população de GB tem sido relatada como sendo menor do que a da população de glóbulos vermelhos, como calculado anteriormente, utilizando o gradiente de densidade de centrifugação 2, 3.
Em comparação com os testes alterativo em locais remotos, este ensaio é rápido, simples com a preparação da amostra (Figura 3), a separação das células no dispositivo dentro de 10 - 15 min, e de imagem e análise automatizada que requer menos de 1 min. Desta forma, o dispositivo pode retornar resultados rapidamente para informar melhor as decisões médicas, permitir o tratamento a ser administrado imediatamente para aliviar a dor física e psicológica, e reduzir o risco de complicações associado a um atraso no atendimento médico. Esta técnica pode ser realizado no local, quer em situações clínicas, devido a uma preparação simples da amostra e análise de imagem automatizado e que retorna um resultado com a entrada ou a interpretação mínima do utilizador. Por causa da utilização de uma abordagem simples utilizando ímans permanentes para a análise da amostra e o uso de qualquer um aparelho ou componentes eléctricos simples para imagiologia e de processamento de imagem, o dispositivo, bem como o custo por teste são mínimos em comparação com alguns procedimentos de teste sofisticados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Declaração de ética: Todos os procedimentos envolvendo amostras de sangue humano foram realizadas de acordo com as normas institucionais. Todos os protocolos foram revisados e aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional. Um consentimento informado foi dado por todos os participantes.
Preparação 1. Amostra de Doença Falciforme Diagnóstico 5, 8
- Prepara-se uma solução 50 mM de gadobutrol em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS).
- Dissolve-se 10 mM de metabissulfito de sódio na solução de gadolínio.
NOTA: metabissulfito de sódio é tóxico por inalação e fortemente irrita a pele e tecido. É um ácido corrosivo quando misturado com água. Pode decompor-se para emitir fumos tóxicos de óxido de enxofre e sódio, quando aquecido a alta temperatura. - Obter amostra de sangue, quer através de punção digital ou punção venosa.
- Tirar sangue usando um dispositivo de punção com uma lanceta limpo e descartável. Apply pressão perto do local perfurado e limpe a gota do sangue formada de três a quatro vezes antes da recolha de sangue, utilizando uma pipeta; ter o cuidado de "leite" o dedo apertando o tecido, pois isso irá resultar na contaminação da amostra com tecidos fluidos não.
- Alternativamente, tirar sangue utilizando procedimentos de punção venosa padrão 14.
NOTA: Se as amostras vai ser armazenada por mais do que algumas horas, recolher o sangue num vacutainer com um anticoagulante tal como EDTA.
- Adicionar menos do que 1 mL de sangue de 100 ul da solução de metabissulfito de sódio-gadolínio.
2. Preparação de Amostras para WBC Citometria 7
- Obter amostra de sangue, quer através de punção digital ou punção venosa, como na seção 1.
- Opcional: Lyse GVs com um tampão de lise dos glóbulos vermelhos. Pipetar 5 ul de sangue em 500 mL de tampão de lise de RBC e incubar à temperatura ambiente durante 3-5 minutos.
NOTA:isto pode ser feito para confirmar a gama de levitação de uma população isolada de glóbulos brancos. No entanto, não é necessário para executar este passo, como os resultados aqui apresentados demonstram que os glóbulos vermelhos levitar numa posição claramente mais baixa do que glóbulos brancos. - Diluir o sangue total 1: 1.000 em Gd 25 mM em HBSS
NOTA: se a lise das células foi realizada, diluir a amostra lisadas 9: 1 amostra lisadas: Gd 250 mM para se obter uma amostra que continha Gd 25 mM.
3. Análise de Amostras usando a plataforma Magnetic Levitation 4, 5, 6, 7, 8
- Inicie o dispositivo de levitação magnética:
- Para o dispositivo auto-suficiente, conecte o dispositivo, deixe-o ligar, e coloque sobre uma superfície plana e nivelada.
- Para a versão do smartphone compatível, inicie o aplicativo do smartphone e deslize para a esquerda para entrar imagemmodo de captura, e coloque em uma superfície plana e nivelada.
- Para levitação magnética estática:
- Carregar a amostra preparada em um tubo microcapilar de vidro quadrada mergulhando a extremidade na solução e deixar a amostra encher o capilar através da acção capilar.
- Vedar a extremidade com um tubo de vedante ao pressionar lentamente uma extremidade do capilar para dentro do material.
- Inserir o capilar entre os ímãs do dispositivo de levitação magnética de modo que apenas 1 cm do tubo permanece visível (consulte a Figura 3 para uma ilustração da preparação da amostra).
NOTA: Este passo é o mesmo tanto para o aparelho smartphone compatível e auto-suficiente. - Aguarde 10 min sem perturbar o dispositivo ou o capilar.
- Para levitação magnética assistida por fluxo:
- Carregar a amostra no tubo de amostra.
- Ligue o tubo de entrada entre o recipiente da amostra e microcapillary e conecte a tubulação de saída entre o microcapilar e recipiente de resíduos.
- Defina os parâmetros de intensidade e de fluxo de LED.
- Certifique-se de que as células são visíveis no campo de visão, em seguida, pressione o botão de captura para capturar uma imagem (botão 3 no dispositivo auto-suficiente e o botão da câmera na parte inferior da tela do aplicativo de smartphone).
NOTA: Se um USB é usado para armazenar as imagens, crie uma pasta chamada "imagens" e inserir o USB antes de ligar o dispositivo. Se nenhuma unidade estiver presente, o dispositivo irá armazenar as imagens em sua memória interna e transferido mais tarde.
NOTA: Várias imagens podem ser capturadas e analisadas para reduzir o risco de anomalias movendo o capilar dentro ou para fora cerca de ½ cm entre captura de imagem.
Observação: se o número de células no campo de visão é demasiado elevado ou demasiado baixo (conforme detectado e comunicado no interface de utilizador), deslocar o capilar dentro ou para fora do dispositivo ou preparar outra SAmple. - Retirar a amostra e descartar a amostra de acordo com as normas institucionais ou locais. Capilares devem ser eliminados como uma afiada.
Figura 3: Preparação de Amostras e interface de usuário. (A) O procedimento de preparação da amostra envolve lancetar dedo do sujeito, formando uma gota de sangue, transferindo a gota de sangue para a solução de teste de amostra, a agitação da amostra e carregar para um tubo capilar através da acção capilar, e a inserção da amostra no levitação magnética dispositivo. (B) Estas etapas de preparação de amostras também são exibidos na tela do dispositivo para orientar a preparação da amostra. (C) O dispositivo inclui quatro botões: um botão para ampliar a imagem da amostra, a fim de ajustar adequadamente o foco usando o botão de ajuste; um botão para obter uma única mEDIÇÃO (um atraso de 5 s é implementado para dar tempo para que o utilizador insira a amostra); uma medição de lapso de tempo (6 imagens são tomadas em intervalos de 5 s); e um botão para desligar o dispositivo após o uso. Reproduzido, com permissão, de Yenilmez, et al. 8 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Análise de Imagem 4, 5, 6, 7, 8
- Executar o software de análise de imagem incluído no dispositivo para a amostra adequada (distribuição de célula ou tipo de separação de células).
NOTA: Para o dispositivo auto-contido, a análise é realizada automaticamente e exibidos na interface gráfica do utilizador. Para o aparelho smartphone compatível, para realizar a análise, vá para a galeria umand selecione o arquivo de vídeo desejado a ser analisado. - Observar e registrar a saída da análise exibido na tela.
NOTA: Para a análise de distribuição de células (tal como o diagnóstico da doença das células falciformes), a saída será a largura de confinamento da população de células.
NOTA: Para separação tipo de células (tais como identificação de WBC), a saída será uma imagem com a população de GB identificado. De modo a calcular o número de células por microlitro, multiplicar o número médio de leucócitos por imagem por um factor de 2.000. Por exemplo, se foram observadas 5 WBCs, isso indicaria 10.000 glóbulos brancos / mL. O intervalo normal é geralmente considerado como sendo de 3.500 - 11.000 glóbulos brancos / mL. - Repetir a análise movendo o tubo de amostra dentro ou para fora do dispositivo de cerca de ½ cm e capturar outra imagem para ser analisada como descrito acima.
NOTA: Recomenda-se a repetição da análise 5 - 6 vezes por amostra para evitar erros.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para a análise de distribuição de densidade de células, que é a técnica utilizada para o diagnóstico da doença das células falciformes, o objectivo é o de identificar a largura da distribuição da população de células. As células do sangue de pacientes sem doença falciforme serão confinados dentro de uma largura previsível. Células de pacientes com a doença das células falciformes será distribuído ao longo de uma região mais larga, com uma inclinação para baixo na distribuição celular (ver Figura 4.) para qualquer aplicação particular, um limiar pode ser ajustado entre a largura de distribuição de amostras de controlo versus aquela de saudável amostras como um corte entre "saudável" e "positivo para a doença" 5, 8.
Figura 4: Exemplo de levitação magnética para analisar density Distribuição como um indicador para Doença Falciforme em amostras de sangue. Do lado esquerdo, as células vermelhas do sangue são bem confinado dentro de uma região estreita. No lado direito, um subconjunto de células vermelhas do sangue atingir uma maior densidade e, por conseguinte, uma altura inferior a levitação, enviesando a distribuição para baixo e para o aumento da largura de confinamento. Barra de escala = 200 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para analisar a distribuição da densidade de uma amostra, um algoritmo computacional é implementada dentro do dispositivo. Em primeiro lugar, os gradientes de intensidade de pixel ao longo dos eixos verticais e horizontais são calculados. As bordas íman e as bordas capilares detectados como os picos nos perfis de gradiente vertical pixel. A distância entre as arestas interiores capilares, em pixels, é conhecido por ser de 0,7 mm e, por conseguinte, é utilizado como um Scaling fator para converter distâncias de pixels para milímetros. O gradiente de intensidade de pixel ao longo do eixo horizontal é maior onde as células estão localizados. Este perfil do gradiente é analisada e ajuste a uma curva de Gauss. O valor 4 vezes o desvio padrão da curva é relatado como a largura confinamento.
Os resultados na Figura 5 mostram as larguras de confinamento para ambas as amostras doença falciforme controle e. Aqui, as amostras com uma maior largura de confinamento (mais de 50 um) seria considerado positivo doença das células falciformes e os que estão abaixo desse limiar seriam considerados negativos para a doença. Deve notar-se que outros métodos de análise da distribuição de células falciformes foram investigados e relatado por Yenilmez, et ai. 8
Figura5: Quantificação da Largura Confinamento de Doença Falciforme Diagnóstico. Os resultados experimentais para a largura de confinamento de controlo (n = 48 imagens mais de 4 indivíduos) e a doença das células falciformes (n = 93 imagens mais de 10 indivíduos) células vermelhas do sangue. Os resultados são estatisticamente significativas de acordo com um teste de Mann-Whitney-Wilcoxon de dois lados (aproximação normal, n = 1 3, n = 2 a 10, Z = -2,6764, p = 0,0074). Os bigodes representam a largura máxima de confinamento mínimo e das amostras testadas e asteriscos representam valores extremos. Reproduzido, com permissão, de Yenilmez, et al. 8 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para a separação das partículas, que podem ser usadas para identificar glóbulos brancos em amostras de sangue, o objectivo é o de identificar dois popul distintações. Se as populações têm densidades diferentes, vão ser observados nas regiões distintas no campo de visão. Assim, as populações homogéneas de duas ou mais partículas com densidades distintas podem ser levitado e, após separação, as populações múltiplas pode ser observada na imagem e detectados utilizando o algoritmo de análise de imagem 4 (ver Figura 6).
Para analisar a separação dos dois tipos de células diferentes, um algoritmo é implementada, que distingue as duas populações separadas no equilíbrio. De um modo semelhante ao descrito para a análise da doença das células falciformes, duas distribuições de Gauss estão aptos para a amostra, em vez de uma única curva. Cada pico nos gradientes de intensidade de pixel representa uma população de células diferente. As curvas de Gauss ajuste para dar estes dados tanto a altura média de levitação (em relação à posição do magneto inferior), como a média da curva de Gauss eo confinamento largura que o desvio padrão da curva de 7.
Figura 6: Exemplo de levitação magnética de uma população mista de micropartículas com densidades distintas. (A) curvas de calibração que correlacionem densidade de microesfera com altura levitação em cinco concentrações diferentes de Gd variando de 12,5 a 200 mm. A inclinação é maior nas concentrações mais baixas de D'us, oferecendo assim uma maior resolução (ie sensibilidade às diferenças de densidade pequenas). A inclinação é menor para maiores concentrações de Gd, demonstrando o aumento na gama de detecção, mas com resolução mais baixa. (B) a separação dependente do tempo de uma amostra homogéneos microesferas com duas densidades distintas ao longo de dois minutos. No equilíbrio (à direita), duas bandas distintas são detectados pelo Anal imagemalgoritmo ysis. Reproduzido, com permissão, de Yenilmez, et al. 7 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A fim de identificar os tipos de células individuais com densidades distintas para qualquer dada aplicação, é aconselhável primeiro levitar um tipo de célula de cada vez para quantificar a altura levitação esperado. A Figura 7a mostra a altura de levitação de glóbulos brancos a partir de uma amostra de sangue em que os glóbulos vermelhos foram lisados. Isto define a região de confinamento de glóbulos brancos para a análise posterior. Os resultados indicam que os glóbulos vermelhos levitar inferior a glóbulos brancos e, assim, glóbulos brancos podem ser distinguidas a partir de amostras de sangue com base na posição de levitação. O volume dentro de um dado campo de visão é de 0,5 ul. Em amostras que foram diluídas 1: 1000, o número de glóbulos brancos / mL pode ser calculada por contagemo número de glóbulos brancos no campo de visão e multiplicando por um factor de 2000 7.
Figura 7: Citometria de WBC no sangue total. (A) levitação de glóbulos brancos do sangue seguintes RBC lise. Isto define o intervalo no qual levitar glóbulos brancos no campo magnético em Gd de 25 mm. (B) Exemplo de contagem de WBC (glóbulos brancos marcados por setas azuis). O embutimento quadro superior mostra glóbulos brancos eo quadro inferior eo embutimento quadro inferior mostra a população RBC. Reproduzido, com permissão, de Yenilmez, et al. 7 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Passos críticos dentro do Protocolo
factores críticos neste processo incluem o alinhamento adequado dos magnetos. Se os ímãs tornar-se desalojado ou separados mais do que o normal no interior do dispositivo, isso pode afetar os resultados. Para controlar esta falha ou outros no processo, uma partícula controlado por densidade, tais como microesferas de poliestireno, pode ser utilizado periodicamente para controlar as variações ao longo do tempo. Além disso, o tempo de levitação é importante para permitir que as células atingissem o equilíbrio. Para as células vermelhas do sangue, 10 minutos é suficiente para permitir que todas as células para alcançar o equilíbrio. No entanto, é importante notar que as partículas mais pequenas ou as células podem necessitar de mais tempo para atingir o equilíbrio. Isto pode ser avaliado tomando imagens de lapso de tempo em um 5 s intervalo e traçando a largura confinamento ao longo do tempo; o equilíbrio pode ser determinado como o momento em que a mudança na largura confinamento é negligenciável.
Outros passos críticos dentro do protocolo incluem o préparação da solução de gadolínio na concentração precisa quanto isso influencia grandemente amostra altura levitação. Isto pode ser feito antes do tempo e utilizado a partir de uma solução estoque, mas deve ser devidamente selados, para evitar a evaporação da solução e um aumento na concentração não intencional. Além disso, é preciso ter cuidado para manter o estado de saúde das células utilizadas. Por sangue humano elaborado através de picada no dedo, ele deve ser usado dentro de uma hora da coleta de sangue e não deixa-se secar ao armazenar em um recipiente selado. Para sangue humano por venipunctura desenhada, as amostras devem ser armazenadas a 4 ° C durante não mais de uma semana com anticoagulante (ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), um anticoagulante comum, foi usada aqui). Para as linhas de células aderentes, as células mortas devem ser lavados a partir da cultura antes do tratamento com tripsina e as células devem ser incubadas até à sua utilização. A saúde das células no momento de levitação é crítica porque a saúde das células é conhecido por afectar a densidade e, portanto, heigh levitaçãot.
Modificações e resolução de problemas
Nós demonstramos a separação e isolamento de células de duas densidades diferentes em locais previsíveis no campo magnético. A fim de alargar esta técnica a outras aplicações, diferentes formulações de a forma paramagnética pode ser utilizado para se obter uma gama desejada de detecção para aplicações alternativas 3. A concentração de gadolínio regula a resolução de detecção, bem como o intervalo (consulte a Figura 6 A). Por causa maiores concentrações de gadolínio aumentar a intensidade da força magnética aplicada às células, quanto maior for a concentração de gadolinio em solução de suspensão, menor será a diferença em altura levitação será para qualquer diferença na densidade de células. Enquanto isso limita a resolução, definida como a capacidade para distinguir entre as pequenas diferenças na densidade das células, aumenta a gama de densidades que podem ser analisamd. Do mesmo modo, diminuindo a concentração de gadolinio vai aumentar a resolução, mas diminuir o intervalo de detecção. Além disso, a densidade do meio pode ser alterado para mudar os limites de detecção para cima ou para baixo. A segunda força que controla a altura levitação é a força de flutuação, a qual depende da densidade relativa da célula em comparação com a do meio de suspensão. Aqui, uma solução de suspensão à base de água é usado, significa que as células com uma densidade que é a mesma que a do levitar forma na linha central entre os dois ímans com células menos densos ou mais densas levitar acima ou abaixo da linha central, respectivamente (com uma gama controlada por força magnética, como se descreveu anteriormente). Porque força de empuxo é dependente de densidade relativa, o aumento da densidade do meio deslocará a gama de detecção de uma maior gama de densidades celulares. Da mesma forma, usando um meio de densidade inferior irá deslocar a gama de detecção para uma gama menor de densidades celulares. < / P>
Temos também investigou o desempenho do dispositivo de focagem magnética assistida por fluxo através da quantificação da quantidade de partículas através da largura normalizada capilar (isto é, a probabilidade de uma partícula a fluir a uma distância ao longo da largura capilar). as taxas de fluxo mais baixas têm mais confinamento de partículas mas resultam em um caudal de volume menor, o que pode ser uma desvantagem para a detecção de objectos rara em amostras de alto volume. No entanto, isto pode ser abordado por passagens múltiplas no campo magnético ou através de imans mais longos. Separação entre vários tipos de células pode também ser aproveitado em estudos futuros para isolar as partículas de diferentes densidades, aproveitando um separador de microfluidos no final do campo magnético.
Ao separar vários tipos de células, pode ser útil para levitar cada população individualmente, a fim de estabelecer a altura média e a gama de cada tipo de célula antes de levitação da população homogénea.
e_content "> limitações da técnicaO processo aqui apresentado é limitado à separação de partículas de densidades distintas. A fim de conseguir uma identificação fiável dos vários tipos de células, é importante que eles têm gamas de densidade discreta que não se sobrepõem. Além disso, as partículas que podem ser detectadas são limitados em tamanho. Eles devem ser capazes de se mover livremente dentro do tubo microcapilar - 200 mm é o limite superior recomendado no diâmetro da partícula. Além disso, as partículas devem ser suficientemente grande para ser visualizado claramente - 5 um limite inferior é o recomendado no diâmetro.
Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos
Esta abordagem para a análise celular é simples, permitindo a análise user-friendly no local. Muitos procedimentos diagnósticos médicos devem ser realizados em laboratórios clínicos e exigem equipamentos e procedimentos realizados por um laboratório specialis treinados testes especializadat. No entanto, este protocolo requer um dispositivo simples que é mais acessível para as clínicas de saúde. A preparação da amostra é simples e a análise é automática, minimizando o risco de erro do utilizador.
Este dispositivo irá permitir que, no local de teste rápido para uma variedade de condições médicas. O dispositivo é fácil de usar, sem rótulo, e portátil, tornando-o ideal para o diagnóstico de doenças point-of-care. Em comparação com o atual padrão de testes de laboratório clínico remoto, esta abordagem irá permitir aos médicos para fazer rapidamente decisões informadas sobre o atendimento ao paciente e, potencialmente, evitar complicações devido à demora no atendimento. A plataforma foi projetada com componentes facilmente acessíveis e de baixo custo, permitindo uma utilização generalizada deste método em ambientes clínicos e os países em desenvolvimento e melhorar a acessibilidade em todo o mundo aos cuidados de saúde.
Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica
É importante notar que otestes descritos aqui ainda não são validadas em uma população de pacientes em larga escala. Até à data, o diagnóstico da doença das células falciformes foi confirmada em um pequeno paciente coorte 2, 5 e WBC citometria tem sido demonstrada como uma prova de conceito. ensaios clínicos com estas aplicações e os desenvolvidos no futuro deve ser realizada a fim de validar este método antes da utilização clínica, mas os resultados aqui apresentados mostram promessa de uma eventual utilização desta tecnologia e técnica para diagnósticos clínicos de ponto-de-cuidado.
Usando essa abordagem para análise de citometria baseada em densidade pode vir a ser alargado a outras aplicações de diagnóstico de doenças. Esta abordagem de levitação magnética de células individuais para o diagnóstico de doenças como descrito aqui requer a utilização de suspensões de células únicas de células de um paciente e a células que podem ser visualizados utilizando o sistema actual com as suas limitações na utilização devido a resoluçãode uma câmera de smartphone ou óptica de baixo custo. Além disso, esta técnica é aplicável às doenças que satisfazem uma das seguintes condições: (i) as células de interesse deve atingir uma densidade alterada quando eles portadores da doença em comparação com controlos saudáveis, (ii) uma alteração da densidade das células deve ser indutível por adição de um reagente (ou qualquer tratamento alternativo disponível), ou (iii) o sistema de diagnóstico deve envolver a identificação de diferentes tipos de células de uma única amostra que tanto inerente ou através de algum tipo de tratamento têm densidades exclusivos. As aplicações futuras para outras doenças usando o mesmo dispositivo de plataforma pode ter um tremendo impacto sobre a saúde global. Estas podem incluir a detecção de componentes biológicos, que se distinguem por densidade. Certos tipos de células, as células que estão a sofrer morte celular, e as células doentes foram todos mostrados para ter assinaturas de densidade originais e, assim, os padrões magnéticos diferentes, e podem, portanto, ser quantificado e separados utilizando esta plataforma. As células em números muito baixos também pode be detectado, aproveitando o fluxo de fluido no dispositivo de levitação magnética assistida por fluxo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gadavist (Bayer) | Jefferson Medical and Imaging | 2068062 | Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca. |
| Square glass microcapillary tubes | Vitrocom | 8270 | 50 mm length is sufficient |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | S9000 | Chemical formula: Na2S2O5 |
| Leica Microsystems Critoseal tube sealant | Fisher Scientific | 02-676-20 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9269 SIGMA | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Or other reagent as recommended for the cell type used |
| MICROLET 2 Adjustable Lancing Device | Walgreens | 246567 | Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols |
| Microlet Lancets | Walgreens | 667474 | Must be dispoable and not reused |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Or any preferred method for cell counting |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A1049201 |
References
- Tasoglu, S., Khoory, J., Tekin, H., Thomas, C., Karnoub, A., Ghiran, I., Demirci, U. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Tasoglu, S., Yu, C. H., Liadudanskaya, V., Guven, S., Migliaresi, C., Demirci, U. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Tasoglu, S., Yu, C. H., Gungordu, H. I., Guven, S., Vural, T., Demirci, U. Guided and magnetic self-assembly of magnetoceptive gels. Nature Communications. 5, 4702 (2014).
- Amin, R., Knowlton, S., Yenilmez, B., Hart, A., Joshi, A., Tasoglu, S. Smart-phone Attachable, Flow-Assisted Magnetic Focusing Device. RSC Advances. 6, 93922-93931 (2016).
- Knowlton, S. M., Sencan, I., Aytar, Y., Khoory, J., Heeney, M. M., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Sickle Cell Detection Using a Smartphone. Sci Rep. 5, 15022 (2015).
- Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), e0134400 (2015).
- Yenilmez, B., Knowlton, S., Tasoglu, S. Self-Contained Handheld Magnetic Platform for Point of Care Cytometry in Biological Samples . Advanced Materials Technologies. 1, 1600144 (2016).
- Yenilmez, B., Knowlton, S., Yu, C. H., Heeney, M., Tasoglu, S. Label-Free Sickle Cell Disease Diagnosis Using a Low-Cost, Handheld Platform. Adv Mat Tech. 1 (5), 1600100 (2016).
- Bender, M. A., Douthitt Seibel, G., et al. GeneReviews. Pagon, R. A. , University of Washington. Seattle, Seattle, WA. (1993).
- Kaul, D. K., Fabry, M. E., Windisch, P., Baez, S., Nagel, R. L. Erythrocytes in sickle cell anemia are heterogeneous in their rheological and hemodynamic characteristics. J Clin Invest. 72 (1), 22-31 (1983).
- Joiner, C. H. Gardos pathway to sickle cell therapies? Blood. 111 (8), 3918-3919 (2008).
- Finch, J. T., Perutz, M. F., Bertles, J. F., Döbler, J. Structure of Sickled Erythrocytes and of Sickle-Cell Hemoglobin Fibers. Proc Natl Acad Sci. 70 (3), 718-722 (1973).
- Lew, V. L., Etzion, Z., Bookchin, R. M. Dehydration response of sickle cells to sickling-induced Ca(++) permeabilization. Blood. 99 (7), 2578-2585 (2002).
- Ernst, D. J. NCCLS Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture: Approved Standard-Sixth Addition. 27 (26), (2007).
