Bioengineering

المغنطيسى إلى جانب التصوير المحمولة وتحليل لتشخيص الأمراض

Published: February 19, 2017 doi: 10.3791/55012

Stephanie M. Knowlton¹, Bekir Yenilmez², Reza Amin², Savas Tasoglu^1,2

¹Biomedical Engineering Department, University of Connecticut, ²Mechanical Engineering Department, University of Connecticut

Introduction

هنا، نقدم منصة التكنولوجيا وتقنية الذي يستخدم القطار المغناطيسي إلى جانب التصوير الآلي وتحليل لتحليل توزيع كثافة خلايا المريض كمؤشر للمرض. هذا النهج تنوعا لتحليل cytometric على أساس الكثافة يمكن في نهاية المطاف أن تطبق على مجموعة من تشخيص المرض. ومع ذلك، من أجل أن تكون متوافقة مع نقطة الرعاية السريرية واستخدامها في البلدان النامية، يجب على تقنية تلبية متطلبات منخفضة التكلفة، ونقل، وسهولة الاستخدام. الجهاز والمواد الاستهلاكية يجب الحصول عليها بسهولة وبتكلفة منخفضة. إعداد نموذج يجب أن تكون بسيطة، يجب أن يكون آليا التحليل مع متطلبات الحد الأدنى من إدخال المستخدم أو تفسير، وينبغي أن تعاد النتائج بسرعة. وعلاوة على ذلك، يجب أن يكون الجهاز المدمجة والمحمولة لتكون مفيدة في المرافق الصحية، فضلا عن البلدان النامية. وهكذا، قمنا بتطوير جهاز وطريقة لاستخدام القطار المغناطيسي في نقطة من الرعاية المتوافقة مع TECHNOLogy قبل اقتران الآلي التصوير وصورة تحليل للعودة النتائج فيما يتعلق بتوزيع كثافة السكان من خلايا المريض.

تقنيات نقطة من الرعاية توفر ميزة بارزة على إجراءات الفحوصات المخبرية السريرية الحالية. التكنولوجيا المتاحة حاليا مكلفة للغاية أن تكون مملوكة من قبل الطبيب أو المعقدة جدا التي يتعين الاضطلاع بها من قبل الطاقم الطبي. العديد من هذه الإجراءات تتطلب بروتوكولات كثيفة العمالة التي يجب أن يقوم بها فني مدرب. لهذه الأسباب، عينات من المرضى مثل الدم أو البول يتم جمع عموما في عيادة الطبيب ثم نقل إلى البعيد، الفحوصات المخبرية مركزي لاختبار سريري، والذي قد يستغرق عدة أيام لالطبيب لتلقي نتائج الاختبار. يمكن أن يسبب هذا التأخير أو مضاعفات أثناء العلاج في بعض الحالات، يجعل هذا الاختبار مكلفة جدا وغير فعال (يسبب عبئا ماليا على دافعي التأمين)، وكذلك يجعل الكثيرالتشخيص لا يمكن الوصول إليها في إعدادات المنخفضة الموارد والبلدان النامية.

هنا، نقدم تقنية المغنطيسى إلى جانب التصوير الآلي وتحليل في كل جهاز مع التصوير جزءا لا يتجزأ وتجهيز (الشكل 1) وجهاز الهاتف الذكي متوافق (الشكل 2). وتمثل هذه الأجهزة المستندة إلى المغنطيسى تقنية منصة قابلة للتطبيق على نطاق واسع والتي لديها القدرة على تطبيقها على مجموعة واسعة من التطبيقات المختلفة التشخيص الطبي. وظائف نهج المغنطيسى على أساس التوازن بين قوتين: قوة المغناطيسية وقوة الطفو ^{^1،} ^{^2،} ^3. عندما يتم تعليق الجسيمات في وسط ممغطس وإدراجها في حقل المغناطيسي التي تم إنشاؤها من قبل اثنين من المغناطيس مع أقطاب تشبه في مواجهة بعضهما البعض، وأعمال القوة المغناطيسية على جسيم في الاتجاه نحو محور بين magn اثنين خدمات الاختبارات التربوية. وتسببت قوة الطفو التي كتبها الكثافة النسبية للجسيمات مقارنة المتوسطة تعليق وهو أعلى في حالة الجسيمات أقل كثافة من المتوسط والهبوط في حالة الجسيمات أكثر كثافة من الوسط المحيط. وبناء على هاتين القوتين، والجسيمات التوصل إلى وضع التوازن الارتفاع في الحقل الذي يوازن بين هاتين القوتين. يرتبط هذا الموقف مباشرة إلى كثافة الجسيمات، مع جزيئات أكثر كثافة الرفع أقل في مجال من الجسيمات أقل كثافة. وحدة التصوير، وإما المدمج في الهاتف الذكي كاميرا ^{^4،} ^{^5،} ⁶ أو المكونات البصرية مستقلة مجهزة عدسة مكبرة ^{^7،} ^8، تستخدم لتصور مواقف الجسيمات. معالجة الصور، إما من خلال تطبيق الهاتف الذكي ^{^4،} ^{^5،}= "XREF"> 6 أو وحدة المعالجة جزءا لا يتجزأ من ^{^7،} ^8، ثم تقوم بمعالجة الصور التي تم التقاطها لتحديد التوزيع المكاني، وبالتالي توزيع الكثافة السكانية. من أجل تحليل عينات أكبر (مثل الذين يعانون سوى عدد قليل من جزيئات من الفائدة لكل ملليلتر، تدفق يمكن أن تكون متكاملة مباشرة إلى الجهاز ومرفوع مثل الجزيئات وتحليلها لأنها تمر من خلال المنطقة التصوير (الشكل 2).

الشكل 1: المغنطيسى منصة بذاتها. (أ) الاتفاق جهاز المغنطيسى بما في ذلك وحدة المغناطيسية التركيز، مكونات التصوير (أ ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي (LED)، عدسة بصرية، وجهاز الكشف عن الكاميرا)، وحدة المعالجة مع شاشة العرض. (ب) قوة المجال المغناطيسي في كروSS-قسم من المنطقة الواقعة بين المغناطيس حيث يتم إدخال العينة. قوة الحقل هو أعظم على سطح مغناطيس ونهج الصفر في المنتصف بينهما. (ج) الجسيمات، مثل الخلايا، ضمن تجربة الحقل المغناطيسي عدة قوى: القوة المغناطيسية (F _م) نحو محور بين المغناطيسية، مع حجم مختلفة على أساس الموقف من الجسيمات. قوة الجاذبية (F _ز ') والتي تعتمد على كثافة الجسيمات النسبية إلى أن من وسيلة تعليق، وقوة السحب (F _د) مقاومة حركة الجسيمات. مستنسخة، بإذن، من Yenilmez، وآخرون. ⁸ الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
تينلدى عودتهم 2: الهاتف الذكي متوافق مع مساعدة تدفق مغناطيسي منصة الإرتفاع. (أ - ج) الجبهة (أ)، الجانب (ب)، والعودة (ج) آراء جهاز مغناطيسي الارتفاع (د) وتشمل مكونات الجهاز: 1) المغناطيسي حدة الارتفاع، بما في ذلك مغناطيس دائم، عدسة مكبرة، و الصمام وضوء الناشر، 2) حالة الهاتف الذكي، 3) الالكترونيات، بما في ذلك متحكم، سائق مضخة، والمتلقي بلوتوث، 4) حامل مضخة صغيرة، 5) فوهة قابل للتعديل، 6) حامل أنبوب النفايات، 7) حامل البطارية، 8 ) عينة حامل، 9) موقف ذات الغرض المزدوج والغطاء. (ه) تدفق التخطيطي، والتي تبين ضخ العينة من خلال المجال المغناطيسي. (و) قطاعا عريضا من حدة الارتفاع المغناطيسي، والتي تبين كيف جزيئات من كثافات مختلفة سوف محاذاة حيث يتم ضخ أنهم من خلال هذا المجال؛ أقل جسيمات كثيفة، مثل الجسيمات 1، سوف تتوازن في أعلى الارتفاع ارتفاع رهان كثافة الجسيمات، مثل الجسيمات 2. مستنسخة، بإذن، من أمين، وآخرون. ¹ الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وتشمل متطلبات الحد الأدنى لاستخدام أي عينة لتحليل توزيع الكثافة في هذا النظام القدرة على الحصول على تعليق من خلايا أو جزيئات أكبر من ما يقرب من 5 ميكرون وأقل من ما يقرب من 250 ميكرون في الحجم (للتصوير ومعالجة الصور) وتوافقه مع خلط في حل من حل ممغطس مثل gadobutrol المستخدمة هنا. لتشخيص المرض، وتشمل التطبيقات المتوافقة مع تلك التي (ط) خلايا الفائدة لديها بطبيعتها كثافة غيرت عندما تحمل المرض مقارنة مع الاصحاء، (ب) يمكن أن يتسبب في تغير كثافة في الخلية بإضافة كاشف أو بعض العلاج البديل لفترة قصيرة فيالوقت cubation، أو (ج) يجري تحديد أنواع مختلفة من الخلايا في عينة واحدة وبطبيعتها (أو عن طريق بعض العلاج) لديها كثافة مميزة فريدة من نوعها.

مرض فقر الدم المنجلي هو اضطراب وراثي يسبب شكل تحور من الهيموغلوبين، مسح ميزانية الأسرة، التي يتم إنتاجها في خلايا الدم الحمراء للشخص (كرات الدم الحمراء)، التي يمكن أن تؤدي في متقطعة الأحداث فازو-انسداد وفقر الدم الانحلالي المزمن ^9. يتم تشخيصه باستخدام الهيموغلوبين ISOELECTRIC التركيز، عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) تجزئة، أو الهيموجلوبين الكهربائي التي هي دقيقة جدا ولكن يجب أن يؤديها في الفحوصات المخبرية السريرية لأنها تتنافى مع ضبط نقطة من الرعاية. وقد اقترحت الذوبان والاختبارات الورقية لمرض فقر الدم المنجلي، ولكن عموما تتطلب التفسير مستخدم شخصي والاختبار التأكيدي. هنا، ونحن نستخدم نهج قائم على كثافة لتحديد عدد كرات الدم الحمراء المنجلية، التي تحقق أعلى كثافة من RBخدمات العملاء من الناس دون مرض فقر الدم المنجلي. وتتضمن آلية البلمرة من النموذج المتحول من الهيموغلوبين، مسح ميزانية الأسرة، والذي يسبب RBC الجفاف في كرات الدم الحمراء مرض فقر الدم المنجلي في ظل ظروف غير المؤكسج ^{^10،} ^{^11،} ^{^12،} ^13.

ويمكن أيضا أن هذا النهج القائم على كثافة تطبيقها لفصل الخلايا من أنواع مختلفة على أساس الكثافة: خلايا الدم البيضاء (الكريات البيضاء) وكرات الدم الحمراء ^7. الكريات البيضاء عادة ما تكون المسؤولة عن مكافحة الالتهابات في الجسم. WBC الخلوي يمكن أن تستخدم لتحديد عدد هذه الخلايا في الدم ويعمل كأداة تشخيصية مفيدة. WBC التهم أعلى من المعتاد (يعتبر عموما أكثر من 11000 خلية لكل ميكرولتر) قد تشير إلى عدوى، واضطرابات الجهاز المناعي، أو سرطان الدم. WBC تعول تحت المعدل الطبيعي قد يكون سبب (حوالي 3500 خلية لكل ميكرولتر) عن اضطرابات المناعة الذاتية أو كونديتالأيونات التي نخاع العظام الضرر. على عكس التكنولوجيات البديلة، عملية المعروضة هنا لا تعتمد على تحلل كرات الدم الحمراء أو البقع من أجل تحديد الكريات البيضاء. هذا الاختبار خلية القاعدة يستفيد من الكثافة الكامنة فريدة من أنواع الخلايا اثنين لأداء الفصل، كما تم الإبلاغ عن الكثافة السكانية WBC إلى أن تكون أقل من ذلك من السكان RBC المحسوبة مسبقا باستخدام التدرج الكثافة الطرد المركزي ² ^و ^3.

مقارنة اختبار مغير في المناطق النائية، وهذا اختبار سريع، مع إعداد نموذج بسيط (الشكل 3)، والفصل بين الخلايا في الجهاز في غضون 10-15 دقيقة، وآلية التصوير والتحليل الذي يتطلب أقل من 1 دقيقة. وبهذه الطريقة، يمكن للجهاز عرض النتائج بسرعة إبلاغ أفضل القرارات الطبية، والسماح العلاج لأن تدار على الفور لتخفيف الألم الجسدي والنفسي، والحد من خطر حدوث مضاعفات associATED مع تأخير في الرعاية الطبية. هذا الأسلوب لا يمكن أن يؤديها في الموقع إما في المرافق الصحية بسبب إعداد بسيط عينة والتصوير الآلي وتحليل والتي ترجع نتيجة لذلك مع الحد الأدنى من إدخال المستخدم أو تفسير. ونظرا لاستخدام نهج بسيط باستخدام مغناطيس دائم لتحليل العينات واستخدام أي من الهاتف الذكي أو المكونات الكهربائية بسيطة للتصوير ومعالجة الصور، والجهاز فضلا عن التكاليف لكل اختبار والحد الأدنى بالمقارنة مع بعض إجراءات اختبار متطورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاقي: تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات دم الإنسان وفقا للوائح المؤسسية. تم استعراض كافة البروتوكولات والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية. أعطيت الموافقة المسبقة من قبل جميع المشاركين.

التحضير 1. عينة لمرض فقر الدم المنجلي التشخيص ^{^5،} ⁸

يعد حل 50 ملم من gadobutrol في هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS).
حل 10 ملم ميتابيسلفيت الصوديوم في حل الجادولينيوم.
ملاحظة: ميتابيسلفيت الصوديوم هي سامة عن طريق الإستنشاق وبقوة يهيج الجلد والأنسجة. وهو حمض تآكل عند مزجه مع الماء. قد تتحلل إلى تنبعث منها أبخرة سامة أكسيد الكبريت والصوديوم عند تسخينها إلى درجة حرارة عالية.
الحصول على عينة الدم إما عن طريق الأصبع أو بزل الوريد.
1. سحب الدم باستخدام جهاز الطعن مع انسيت نظيفة، يمكن التخلص منها. ا ف بضغط رقائق بالقرب من موقع مثقوب ويمسح قطرات الدم شكلت ثلاث إلى أربع مرات قبل جمع الدم باستخدام ماصة. الحرص على عدم "الحليب" الاصبع عن طريق الضغط على الأنسجة، لأن هذا سيؤدي إلى تلويث العينة مع السائل الأنسجة.
2. بدلا من ذلك، سحب الدم باستخدام إجراءات بزل الوريد القياسية ^(14).
  ملاحظة: إذا كان سيتم تخزين العينات لمدة أكثر من بضع ساعات، وجمع الدم في vacutainer مع تخثر مثل EDTA.
إضافة أقل من 1 ميليلتر من الدم إلى 100 ميكرولتر من الحل ميتابيسلفيت الجادولينيوم الصوديوم.

2. إعداد نموذج لمكافحة حرائق آبار النفط الخلوي ⁷

الحصول على عينة الدم إما عن طريق الأصبع أو بزل الوريد، كما هو الحال في القسم 1.
اختياري: ليز كرات الدم الحمراء مع وجود مخزن مؤقت تحلل كريات الدم الحمراء. ماصة 5 ميكرولتر من الدم إلى 500 ميكرولتر من العازلة تحلل كريات الدم الحمراء ويحضن في درجة حرارة الغرفة ل3-5 دقيقة.
ملحوظة:هذا يمكن القيام به لتأكيد مدى الارتفاع من السكان المعزولين من الكريات البيضاء. ومع ذلك، فإنه ليس من الضروري تنفيذ هذه الخطوة، كما تم عرض النتائج هنا تثبت أن كرات الدم الحمراء حلق في الهواء في موقف أقل بوضوح من الكريات البيضاء.
تمييع الدم الكامل 1: 1000 في 25 ملي كلمة المدير العام في HBSS
ملاحظة: إذا تم إجراء تحلل الخلية، وتمييع العينة هي lysed 9: 1 هي lysed العينة: 250 ملي كلمة المدير العام للحصول على عينة تحتوي على 25 ملي ش ج.

3. تحليل العينات باستخدام منصة المغناطيسي الإرتفاع ^{^4،} ^{^5،} ^{^6،} ^{^7،} ⁸

بدء تشغيل الجهاز المغنطيسى:
1. للجهاز قائم بذاته، والمكونات في الجهاز، تتيح لها ما يصل الى السلطة، ووضع على سطح مستو، ومستوى.
2. للحصول على إصدار الهاتف الذكي متوافق، بدء تطبيق الهواتف الذكية ومرر لليسار للدخول صورةوضع الالتقاط، ومكان على سطح مستو، ومستوى.
لالمغنطيسى ثابت:
1. تحميل عينة أعدت في أنبوب microcapillary مربع من الزجاج عن طريق غمس نهاية في الحل والسماح للعينة لملء الشعرية عبر العمل الشعري.
2. ختم نهاية مع تسرب أنبوب عن طريق دفع ببطء على انتهاء الشعرية في المواد.
3. تضاف الشعرية بين المغناطيس الجهاز المغنطيسى حتى 1 سم فقط من الأنبوب تبقى مرئية (الرجاء انظر الشكل 3 للمزيد من التوضيح إعداد العينة).
  ملاحظة: هذه الخطوة لا يزال هو نفسه لكل من جهاز الهاتف الذكي متوافق مع ومكتفية ذاتيا.
4. انتظر لمدة 10 دقيقة دون إزعاج الجهاز أو الشعرية.
لالمغنطيسى بمساعدة تدفق:
1. تحميل العينة إلى أنبوب العينة.
2. ربط أنابيب مدخل بين الحاوية عينة وميلcrocapillary وتوصيل أنابيب منفذ بين microcapillary وحاوية النفايات.
3. تعيين المعلمات كثافة وتدفق الصمام.
تأكد من أن الخلايا هي واضحة في مجال الرؤية، ثم اضغط على زر التقاط لالتقاط صورة (زر 3 على الجهاز مكتفية ذاتيا وعلى زر الكاميرا في الجزء السفلي من الشاشة في تطبيق الهاتف الذكي).
ملاحظة: إذا تم استخدام USB لتخزين الصور، إنشاء مجلد يسمى "الصور" وإدراج USB قبل تشغيل الجهاز. إذا لم يكن هناك محرك الأقراص الحالي، سيقوم الجهاز بتخزين الصور في الذاكرة الداخلية، ونقل في وقت لاحق.
ملاحظة: قد يتم القبض على العديد من الصور وتحليلها للحد من مخاطر التشوهات عن طريق تحريك الشعيرات الدموية داخل أو خارج عن نصف سم بين اسر الصورة.
ملاحظة: إذا كان عدد الخلايا داخل مجال الرؤية مرتفعة جدا أو منخفضة جدا (كما الكشف عن وأفادت عن واجهة المستخدم)، وتحول الشعرية داخل أو خارج الجهاز أو إعداد سا آخرmple.
إزالة عينة وتجاهل العينة وفقا للوائح المؤسسية أو المحلية. يجب التخلص من الشعيرات الدموية كما حاد.

الشكل (3)
الشكل 3: عينة إعداد واجهة المستخدم. (أ) الإجراء ينطوي على إعداد نموذج الوخز الإصبع هذا الموضوع، وتشكيل قطرات من الدم، نقل قطرة دم في حل اختبار عينة، تهييج العينة وتحميل في أنبوب شعري عبر العمل الشعري، وإدخال العينة إلى المغنطيسى جهاز. (ب) يتم عرض هذه الخطوات إعداد عينة أيضا على شاشة الجهاز لتوجيه إعداد العينات. (ج) يتضمن الجهاز أربعة أزرار: زر للتكبير في صورة عينة من أجل ضبط التركيز بشكل صحيح باستخدام مقبض التعديل. زر للحصول على م واحدeasurement (يتم تطبيق 5 ثوان تأخير لإتاحة الوقت للمستخدم لادخال العينة)؛ قياس الوقت الفاصل بين (يتم أخذ 6 صور على فترات 5 ق)؛ وزر لسلطة خارج الجهاز بعد الاستخدام. مستنسخة، بإذن، من Yenilmez، وآخرون. ⁸ الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. صورة تحليل ^{^4،} ^{^5،} ^{^6،} ^{^7،} ⁸

تشغيل برنامج تحليل الصور شملت على الجهاز لعينة مناسبة (توزيع الخلية أو نوع من الخلايا الفصل).
ملاحظة: للحصول على الجهاز مكتفية ذاتيا، يتم تنفيذ تحليل تلقائيا وعرضها على واجهة المستخدم الرسومية. لجهاز الهاتف الذكي متوافق، لأداء التحليل، انتقل إلى معرض لND تحديد ملف الفيديو المراد تحليلها.
مراقبة وتسجيل الناتج من تحليل عرض على الشاشة.
ملاحظة: للحصول على تحليل توزيع الخلية (مثل تشخيص مرض فقر الدم المنجلي)، سوف يكون الإخراج عرض الحبس من السكان الخلية.
ملاحظة: للحصول على نوع من الخلايا فصل (مثل الهوية WBC)، سوف يكون الإخراج صورة مع سكان كريات الدم البيضاء التي تم تحديدها. وذلك لحساب عدد الخلايا لكل ميكروليتر، مضاعفة متوسط عدد الكريات البيضاء في صورة بعامل 2000. على سبيل المثال، إذا لوحظت 5 الكريات البيضاء، وهذا من شأنه أن يشير 10000 بكس / ميكرولتر. ويعتبر المعدل الطبيعي عموما أن يكون 3500 - 11000 بكس / ميكرولتر.
تكرار التحليل عن طريق تحريك أنبوب عينة داخل أو خارج الجهاز حوالي نصف سم والتقاط صورة أخرى ليتم تحليلها على النحو المبين أعلاه.
ملاحظة: من المستحسن لتكرار التحليل 5-6 مرات في عينة لتجنب الأخطاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتحليل توزيع كثافة الخلايا، وهي تقنية تستخدم لتشخيص مرض فقر الدم المنجلي، والهدف من ذلك هو تحديد عرض توزيع السكان الخلية. سوف تكون محصورة خلايا الدم من المرضى دون مرض الخلية المنجلية ضمن العرض يمكن التنبؤ به. وسيتم توزيع الخلايا من المرضى الذين يعانون من مرض فقر الدم المنجلي في جميع أنحاء المنطقة على نطاق أوسع، مع انحراف النزولي في توزيع الخلايا (انظر الشكل 4.) للحصول على أي تطبيق معين، قد يتم تعيين عتبة بين عرض توزيع عينات المقارنة مقابل ذلك من صحية عينات بمثابة قطع بين "صحية" و "ايجابية لهذا المرض" ⁵ ^و ^8.

الشكل (4)
الشكل 4: مثال على المغنطيسى لتحليل الدانماركيةذ توزيع بمثابة مؤشر لمرض فقر الدم المنجلي في عينات الدم. على اليسار، وخلايا الدم الحمراء تنحصر بشكل جيد داخل منطقة ضيقة. على اليمين، مجموعة فرعية من خلايا الدم الحمراء بلوغ قدر أكبر من كثافة وبالتالي ارتفاع منخفض الارتفاع، جعل التوزيع الهبوط وزيادة العرض من الحبس. شريط مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لتحليل توزيع كثافة العينة، يتم تطبيق خوارزمية حسابية داخل الجهاز. أولا، يتم احتساب التدرجات بكسل الكثافة على طول المحاور الأفقية والعمودية. تم الكشف عن حواف المغناطيس وحواف الشعرية كما في القمم في ملامح بكسل التدرج العمودي. المسافة بين حواف الشعرية الداخلية، بالبكسل، ومن المعروف أن 0.7 ملم، وبالتالي ما يستخدم scaliنانوغرام عامل لتحويل المسافات من بكسل إلى ملليمتر. التدرج بكسل الكثافة على طول المحور الأفقي هو أعظم حيث توجد الخلايا. ويتم تحليل هذا الملف التدرج ويصلح لمنحنى جاوس. وذكر أن قيمة 4 مرات الانحراف المعياري من هذا المنحنى كما عرض الحبس.

النتائج في الشكل 5 تظهر الاعراض الحبس لكل من مراقبة وعينات مرض الخلية المنجلية. هنا، والعينات مع قدر أكبر من عرض الحبس (أكثر من 50 ميكرون) سيعتبر مرض الخلية المنجلية إيجابية وهم دون هذه العتبة سيعتبر أن تكون سلبية لهذا المرض. وتجدر الإشارة إلى أن وسائل أخرى للتحليل توزيع الدم المنجلي تم التحقيق فيها وذكرت من قبل Yenilmez، وآخرون. ⁸

الرقم 5
الشكل5: الكمي لعرض الحبس لفقر الدم المنجلي تشخيص الأمراض. النتائج التجريبية لعرض الحبس لإدارة (ن = 48 صور أكثر من 4 مواد) ومرض فقر الدم المنجلي (ن = 93 صور أكثر من 10 شخص) خلايا الدم الحمراء. نتائج ذات دلالة إحصائية وفقا لاختبار مان ويتني-يلكوكسون بوجهيها (تقريب العادي، ن ₁ = 3، ن ₂ = 10، Z = -2.6764، ع = 0.0074). شعيرات تمثل الحد الأدنى والحد الأقصى بعرض الحبس من عينات اختبار، والنجمة تمثل القيم المتطرفة. مستنسخة، بإذن، من Yenilmez، وآخرون. ⁸ الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لفصل الجسيمات، التي يمكن أن تستخدم لتحديد الكريات البيضاء في عينات الدم، والهدف من ذلك هو التعرف على اثنين بوبول متميزبالجمع. إذا كان السكان لها كثافات مختلفة، وسوف يكون لوحظت في مناطق مختلفة في مجال الرؤية. وبالتالي، السكان متجانس من اثنين أو أكثر من الجزيئات ذات الكثافة متميزة يمكن مرفوع، وعند الانفصال، والسكان متعددة ويمكن ملاحظة في الصورة والكشف باستخدام خوارزمية تحليل الصور ⁴ (انظر الشكل 6).

لتحليل فصل اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا، يتم تطبيق خوارزمية الذي يميز بين السكان فصل في التوازن. بطريقة مماثلة لتلك التي وصفها لتحليل مرض فقر الدم المنجلي، وهما توزيعات جاوس صالحة للعينة، بدلا من منحنى واحد. كل الذروة في التدرجات بكسل كثافة تمثل السكان مختلفة من الخلايا. منحنيات جاوس يصلح لهذه البيانات تعطي كل من ارتفاع متوسط الارتفاع (بالنسبة لموقف المغناطيس السفلي) كمتوسط للمنحنى جاوس وعرض الحبس بأنه الانحراف المعياري للمنحنى ^7.

الشكل (6)
الشكل 6: مثال المغنطيسى من سكان مختلط المجهرية الدقيقة مع كثافات متميزة. (أ) منحنيات المعايرة ربط كثافة microsphere مع ارتفاع الارتفاع في خمسة تجمعات ش ج مختلفة تتراوح 12،5-200 ملم. المنحدر هو أعظم في أقل تركيز من كلمة المدير العام، وبالتالي تقديم دقة أكبر (أي حساسية للاختلافات كثافة صغيرة). المنحدر هو أدنى لتركيزات أعلى من كلمة المدير العام، مما يدل على مدى زيادة الكشف ولكن مع دقة أقل. (ب) فصل تعتمد على الوقت من المجهرية عينة متجانسة مع اثنين من كثافة واضحة على مدى دقيقتين. في حالة توازن (اليمين)، تم الكشف عن شريطين متميزة من الشرج صورةيسيس الخوارزمية. مستنسخة، بإذن، من Yenilmez، وآخرون. ⁷ يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

من أجل تحديد أنواع الخلايا الفردية ذات الكثافة متميزة لأي تطبيق معين، فإنه من المستحسن أن حلق في الهواء لأول مرة نوع من الخلايا في وقت واحد لقياس ارتفاع الارتفاع المتوقع. ويبين الشكل 7A ذروة الارتفاع من الكريات البيضاء من عينة الدم التي تم فيها هي lysed كرات الدم الحمراء. هذا وتعرف المنطقة الحبس الكريات البيضاء لمزيد من التحليل. وتشير النتائج إلى أن عدد كرات الدم الحمراء حلق في الهواء أقل من الكريات البيضاء، وبالتالي، الكريات البيضاء يمكن تمييزها من عينات الدم على أساس الموقف الارتفاع. حجم في أي مجال معين من الرأي هو 0.5 ميكرولتر. في عينات التي تم المخفف 1: 1000، عدد الكريات البيضاء / ميكرولتر يمكن أن تحسب عن طريق عدعدد الكريات البيضاء في مجال الرؤية وتتضاعف بمعامل 2000 ^7.

الرقم 7: WBC الخلوي في الدم كله. (أ) الإرتفاع من الكريات البيضاء من الدم بعد RBC تحلل. هذا يحدد النطاق الذي الكريات البيضاء حلق في الهواء في الحقل المغناطيسي للأرض في 25 ملي ش ج. (ب) مثال على عد كريات الدم البيضاء (الكريات البيضاء التي تميزت الأسهم الزرقاء). يظهر الإطار العلوي ترصيع الكريات البيضاء والإطار السفلي والإطار ترصيع السفلي يبين السكان RBC. مستنسخة، بإذن، من Yenilmez، وآخرون. ⁷ يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
وتشمل العوامل الحاسمة في هذه العملية المحاذاة الصحيحة للمغناطيس. إذا أصبحت المغناطيس فكها أو فصل أكثر من المعتاد داخل الجهاز، وهذا يمكن أن تؤثر على النتائج. للسيطرة على هذا الخطأ أو غيرها في هذه العملية، والجسيمات التي تسيطر عليها كثافة، مثل المجهرية البوليسترين، ويمكن استخدامها بشكل دوري للسيطرة على التغيرات على مر الزمن. وعلاوة على ذلك، والوقت الارتفاع مهم للسماح للخلايا للوصول إلى التوازن. لخلايا الدم الحمراء، و 10 دقيقة كافية للسماح لجميع الخلايا للوصول إلى التوازن. ومع ذلك، فمن المهم الإشارة إلى أن جسيمات أصغر أو الخلايا قد تتطلب وقتا أطول للوصول إلى التوازن. ويمكن تقييم ذلك عن طريق أخذ الصور مرور الوقت في 5 ثوان فاصل والتآمر عرض الحبس على مر الزمن؛ التوازن يمكن تحديد باعتبارها النقطة التي تغير في العرض الحبس لا يكاد يذكر.

وتشمل الخطوات الحاسمة الأخرى في البروتوكول قبلparation من الحل الجادولينيوم في تركيز دقيق لأن هذا يؤثر إلى حد كبير ارتفاع الارتفاع عينة. ويمكن القيام بذلك في وقت مبكر والمستعملة من حل الأسهم، ولكن يجب أن تكون مختومة بشكل صحيح لتجنب التبخر من الحل، وزيادة غير مقصودة في التركيز. وعلاوة على ذلك، يجب توخي الحذر للحفاظ على الحالة الصحية للخلايا المستخدمة. للدم البشري تعادل عن طريق الأصبع، ينبغي أن تستخدم في غضون ساعة واحدة من سحب الدم وعدم السماح لتجف قبل تخزينها في حاوية مغلقة. للدم البشري عن طريق بزل الوريد تعادل يجب أن يتم تخزين العينات عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد مع تخثر (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، وتخثر المشتركة، واستخدمت هنا). لخطوط الخلايا الملتصقة، يجب غسلها الخلايا الميتة تماما من ثقافة قبل trypsinization ويجب تحضين الخلايا حتى الاستخدام. صحة الخلايا في وقت الارتفاع أمر بالغ الأهمية لصحة الخلية المعروفة بتأثيرها على كثافة وبالتالي هيغ الارتفاعر.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
لقد أثبتنا في الفصل والعزل من خلايا اثنين من كثافات مختلفة في مواقع متوقعة في المجال المغناطيسي. من أجل توسيع نطاق هذه التقنية لتطبيقات أخرى، يمكن استخدام تركيبات مختلفة من المتوسطة ممغطس للحصول على مجموعة المطلوب من الكشف عن التطبيقات البديلة ^3. تركيز الجادولينيوم يحكم قرار الكشف فضلا عن مجموعة (يرجى الرجوع إلى الشكل 6A). لأن تركيزات أكبر من الجادولينيوم تزيد من قوة القوة المغناطيسية تطبيقها على الخلايا، وكلما زاد تركيز الجادولينيوم في حل تعليق، أصغر والفرق في الارتفاع الارتفاع يكون لأي اختلاف في كثافة الخلية. في حين أن هذا يحد من القرار، الذي يعرف بأنه القدرة على التمييز بين الاختلافات الصغيرة في كثافة الخلايا، لأنه يزيد من مجموعة من الكثافة التي يمكن تحليلد. وبالمثل، والحد من تركيز الجادولينيوم وزيادة دقة ولكن تقليل نطاق الكشف. وعلاوة على ذلك، فإن كثافة متوسطة ويمكن تغيير لتغيير حدود الكشف صعودا أو هبوطا. القوة الثانية التي تسيطر على ارتفاع الارتفاع هي قوة الطفو، والتي تعتمد على الكثافة النسبية للخلية مقارنة بما كان عليه من المتوسط تعليق. هنا، يتم استخدام حل تعليق المياه القائمة، وهذا يعني أن الخلايا ذات الكثافة الذي هو نفسه كما ان من حلق في الهواء المتوسطة في المنتصف بين المغناطيس مع اثنين من خلايا أقل كثافة أو كثافة الرفع فوق أو تحت خط المنتصف، على التوالي (مع مجموعة التي تسيطر عليها القوة المغناطيسية كما هو موضح سابقا). لأن قوة الطفو تعتمد على الكثافة النسبية، وزيادة كثافة متوسطة سيتحول نطاق الكشف لمجموعة أعلى من كثافة الخلية. وبالمثل، وذلك باستخدام أقل متوسطة الكثافة وتحويل مجموعة من الكشف عن نحو نطاق أقل من كثافة الخلية. < / P>

لقد حققت أيضا أداء جهاز التركيز المغناطيسي بمساعدة التدفق عن طريق قياس عدد الجسيمات تطبيع عبر عرض شعري (أي احتمال من الجسيمات في التدفق على مسافة عبر عرض الشعرية). انخفاض معدلات تدفق الحصول على مزيد من الحبس الجسيمات ولكن تؤدي إلى انخفاض إنتاجية وحدة التخزين، والتي يمكن أن يكون العيب في الكشف عن وجوه نادر في عينات كبيرة الحجم. ومع ذلك، وهذا يمكن أن يعالجها يمر متعددة في المجال المغناطيسي أو عن طريق مغناطيس أطول. ويمكن أيضا أن الاستدانة الفصل بين أنواع الخلايا متعددة في الدراسات المستقبلية لعزل جزيئات من كثافات مختلفة من خلال الاستفادة من فاصل ميكروفلويديك في نهاية الحقل المغناطيسي للأرض.

عندما يفصل أنواع خلايا متعددة، قد يكون من المفيد أن حلق في الهواء كل السكان بشكل فردي من أجل إقامة متوسط الطول ونطاق كل نوع من الخلايا قبل الرفع السكان متجانسة.

e_content "> قيود تقنية
عملية المعروضة هنا يقتصر على فصل جزيئات كثافة متميزة. من أجل تحقيق الهوية موثوقة من أنواع الخلايا متعددة، فمن المهم أن لديهم نطاقات كثافة المنفصلة التي لا تتداخل. وعلاوة على ذلك، فإن الجزيئات التي يمكن الكشف عنها محدودة في الحجم. يجب أن تكون قادرة على التحرك بحرية داخل أنبوب microcapillary - 200 ميكرون هو الحد الأعلى الموصى به على قطر الجسيم. وعلاوة على ذلك، يجب أن تكون جزيئات كبيرة بما يكفي للتصوير بوضوح - 5 ميكرون هو الحد الأدنى الموصى به على قطر.

أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة
هذا النهج لتحليل الخلوي بسيط، مما يتيح تحليل سهلة الاستخدام في الموقع. يجب تنفيذ العديد من الإجراءات التشخيصية الطبية في مختبرات الفحص السريري وتتطلب معدات والإجراءات التي يقوم بها المختبر خاصا تدريب اختبار متخصصةر. ومع ذلك، هذا البروتوكول يتطلب جهاز بسيط وهو أكثر يسرا لعيادات الرعاية الصحية. إعداد عينة بسيطة ومؤتمتة للتحليل، والتقليل من خطر الإصابة الخطأ المستخدم.

وهذا الجهاز يمكن السريع، في موقع اختبار لمجموعة متنوعة من الظروف الطبية. الجهاز سهل الاستخدام وخالية من التسمية، والمحمولة، مما يجعلها مثالية لتشخيص المرض نقطة من الرعاية. بالمقارنة مع المعيار الحالي من الفحوصات المخبرية السريرية عن بعد، أن هذا النهج سيمكن الأطباء لجعل بسرعة قرارات مستنيرة بشأن رعاية المرضى وربما منع المضاعفات الناجمة عن التأخير في الرعاية. وقد تم تصميم منصة مع المكونات يمكن الوصول إليها بسهولة وغير مكلفة، مما يسمح للاستخدام على نطاق واسع لهذه الطريقة في المرافق الصحية والبلدان النامية وتحسين الوصول في جميع أنحاء العالم على الرعاية الصحية.

التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
من المهم أن نلاحظ أناختبارات الموصوفة هنا لم يتم التحقق من صحة بعد على المريض السكان على نطاق واسع. حتى الآن، تم تأكيد تشخيص مرض فقر الدم المنجلي في مريض المجموعة الصغيرة ² ^و ⁵ و الخلوي وقد ثبت WBC كدليل على المفهوم. يجب إجراء التجارب السريرية مع هذه التطبيقات والتي تم تطويرها في المستقبل من أجل التحقق من صحة هذه الطريقة قبل الاستخدام السريري، ولكن تظهر النتائج المعروضة هنا وعد للاستخدام في نهاية المطاف من هذه التكنولوجيا وتقنية لنقطة من الرعاية التشخيص السريري.

باستخدام هذا النهج لتحليل cytometric على أساس الكثافة قد يكون في نهاية المطاف تمتد إلى التطبيقات على تشخيص أمراض إضافية. هذا النهج من المغنطيسى من الخلايا واحدة لتشخيص المرض كما هو موضح هنا يتطلب استخدام وحيدة الخلية تعليق من خلايا المريض والخلايا التي يمكن تصويرها باستخدام النظام الحالي مع قيود على قرار بسبب استخداممن كاميرا الهاتف الذكي أو البصريات منخفضة التكلفة. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية قابلة للتطبيق للأمراض التي تلبي أحد الشروط التالية: (أ) خلايا الفائدة يجب تحقيق كثافة غيرت عندما يحمل المرض مقارنة مع الاصحاء، (ب) يجب أن يكون هناك تغيير كثافة الخلية محرض بإضافة كاشف (أو أي علاج بديل المتاحة)، أو (ج) التشخيص يجب أن تشمل تحديد خلايا مختلفة الأنواع في عينة واحدة والتي إما بطبيعتها أو عن طريق بعض العلاج لديهم كثافة فريدة من نوعها. التطبيقات المستقبلية للأمراض الأخرى التي تستخدم نفس الجهاز منصة يمكن أن يكون لها تأثير كبير على الصحة العالمية. وهذه قد تشمل الكشف عن المكونات البيولوجية، التي تتميز بكثافة. كلها قد أظهرت بعض أنواع الخلايا، والخلايا التي تمر موت الخلايا، والخلايا المريضة أن يكون التوقيعات كثافة فريدة من نوعها، وبالتالي أنماط المغناطيسية متميزة، وبالتالي يمكن كميا وفصلها باستخدام هذه المنصة. الخلايا بأعداد قليلة جدا ويمكن أيضا بالبريد الكشف من خلال الاستفادة من تدفق السوائل في الجهاز المغنطيسى بمساعدة التدفق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na₂S₂O₅
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Tasoglu, S., Khoory, J., Tekin, H., Thomas, C., Karnoub, A., Ghiran, I., Demirci, U. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
Tasoglu, S., Yu, C. H., Liadudanskaya, V., Guven, S., Migliaresi, C., Demirci, U. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
Tasoglu, S., Yu, C. H., Gungordu, H. I., Guven, S., Vural, T., Demirci, U. Guided and magnetic self-assembly of magnetoceptive gels. Nature Communications. 5, 4702 (2014).
Amin, R., Knowlton, S., Yenilmez, B., Hart, A., Joshi, A., Tasoglu, S. Smart-phone Attachable, Flow-Assisted Magnetic Focusing Device. RSC Advances. 6, 93922-93931 (2016).
Knowlton, S. M., Sencan, I., Aytar, Y., Khoory, J., Heeney, M. M., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Sickle Cell Detection Using a Smartphone. Sci Rep. 5, 15022 (2015).
Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), e0134400 (2015).
Yenilmez, B., Knowlton, S., Tasoglu, S. Self-Contained Handheld Magnetic Platform for Point of Care Cytometry in Biological Samples . Advanced Materials Technologies. 1, 1600144 (2016).
Yenilmez, B., Knowlton, S., Yu, C. H., Heeney, M., Tasoglu, S. Label-Free Sickle Cell Disease Diagnosis Using a Low-Cost, Handheld Platform. Adv Mat Tech. 1 (5), 1600100 (2016).
Bender, M. A., Douthitt Seibel, G., et al. GeneReviews. Pagon, R. A. , University of Washington. Seattle, Seattle, WA. (1993).
Kaul, D. K., Fabry, M. E., Windisch, P., Baez, S., Nagel, R. L. Erythrocytes in sickle cell anemia are heterogeneous in their rheological and hemodynamic characteristics. J Clin Invest. 72 (1), 22-31 (1983).
Joiner, C. H. Gardos pathway to sickle cell therapies? Blood. 111 (8), 3918-3919 (2008).
Finch, J. T., Perutz, M. F., Bertles, J. F., Döbler, J. Structure of Sickled Erythrocytes and of Sickle-Cell Hemoglobin Fibers. Proc Natl Acad Sci. 70 (3), 718-722 (1973).
Lew, V. L., Etzion, Z., Bookchin, R. M. Dehydration response of sickle cells to sickling-induced Ca(++) permeabilization. Blood. 99 (7), 2578-2585 (2002).
Ernst, D. J. NCCLS Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture: Approved Standard-Sixth Addition. 27 (26), (2007).