磁悬浮加上便携式成像与分析诊断疾病
Summary
We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.
Abstract
Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient’s cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.
Introduction
这里，我们提出了一个技术平台，它采用加上自动成像和分析磁悬浮来分析患者的细胞的密度分布作为疾病指示器的技术。对于基于密度的术分析这种通用方法最终可应用于一系列疾病的诊断。但是，为了能与床边血糖检测兼容，而在发展中国家使用，该技术必须满足低成本，便携，和可用性要求。该设备和消耗品必须以低成本容易地获得。样品制备必须简单，分析应与用户输入或解释的最低要求是自动的，并且结果应该可以快速恢复。此外，该装置必须是紧凑和便携是在临床设置，以及发展中国家是有用的。因此，我们已开发了一种装置和方法，在点的护理兼容TECHNOL使用磁悬浮术通过耦合自动成像和图像分析来对病人的细胞群的密度分布返回结果。
点护理技术提供了显着的优势超过目前临床实验室测试程序。目前可用的技术是太昂贵的由临床医生所拥有或过于复杂，由医务人员来进行。许多这些步骤需要必须由受过训练的技术人员才能进行劳动密集型的协议。由于这些原因，患者样品如血液或尿液中的医生的办公室，然后转移到一个远程的，集中的测试实验室进行的临床试验，这可能需要几天的时间医师收到测试的结果通常收集。这可能会导致在治疗在某些情况下的过程的延误或并发症，使该试验很昂贵和低效率的（导致保险付款人财政负担），并进一步使许多诊断在低资源设置和发展中国家无法访问。
这里，我们提出加上两者具有嵌入摄像处理（ 图1）和智能电话兼容设备（ 图2）的设备自动成像和分析一个磁悬浮技术。这些磁性基于悬浮装置表示具有潜在一个广泛适用的平台技术被应用到一个范围的不同的医疗诊断应用。磁力的浮力1，2，3：基于两种力量之间的平衡磁悬浮方法的功能。当颗粒悬浮在顺磁介质，并插入到由两个磁体彼此面对，磁力作用在朝向两MAGN之间的中心线的方向上的粒子像磁极产生的磁场 ETS。浮力是由比悬浮介质的粒子的相对密度引起的是向上的颗粒比中等密集和向下中的颗粒比周围介质致密的情况下少的情况下。基于这两种力量，颗粒将达到它平衡这两股力量领域的磁悬浮平衡位置;该位置是直接关系到颗粒的密度，以更密集的颗粒小于致密颗粒漂浮在外地较低。成像模块，无论是一个内置的智能手机摄像装置4，5，6或配有放大镜7,8独立的光学元件，被用于可视化粒子的位置。图像处理，或者通过智能手机应用4,5=“外部参照”> 6或嵌入处理部7，8，然后处理所捕获的图像，以量化的空间分布，因此，人口密度分布。为了分析大样品（如那些具有每毫升兴趣只有几个颗粒，流动可以直接集成到这种颗粒悬浮在设备和当它们通过所述成像区域（ 图2）进行分析。
图1：自含磁悬浮平台。 （ 一 ）紧凑磁悬浮装置包括磁聚焦组件，成像组件（发光二极管（LED），光学透镜，和一个照相机检测器），和一个处理单元与显示屏幕。 （b）该CRO磁场强度其中，被插入所述样本磁铁之间的区域的β-部分。场强最大的在磁体的表面上，并在它们之间的中心线接近零。 （ 三 ）的粒子，如细胞，磁场经验几个部队内：一个磁力（F M）朝向磁性之间的中心线，与大小不同而不同基于所述粒子的位置;一重力（F G'），它依赖于相对于该悬浮介质的粒子的密度，和一拖力（F D）抵抗粒子运动。再现时，经许可，从Yenilmez， 等。 8 ，请点击此处查看该图的放大版本。
图URE 2：智能手机兼容的流辅助磁悬浮平台。 （ 一 – 三 ）前面（a）中 ，一侧（b）和背面（ 三 ）次磁悬浮装置（d）该装置的组成部分包括：1）磁悬浮模块，包括永久磁铁，放大透镜，和LED和光扩散，2）智能手机的情况下，3）电子产品，包括微控制器，泵驱动器和蓝牙接收器，4）微泵座，5）调节孔口，6）废液管夹，7）电池座，8 ）样品架，9）两用底座和盖子。 （ 五 ）流动示意图，示出了通过磁场的样品的泵送。 （ 六 ）磁悬浮模块，显示如何不同密度的颗粒将对齐，因为它们是通过现场泵的横截面;密度较小的颗粒，如颗粒1，将平衡在较高的悬浮高度t汉致密颗粒，如颗粒2转载，经许可，从阿明， 等。 1 ，请点击这里查看该图的放大版本。
使用任何样品的在该系统中的最低要求的密度分布分析包括以获得悬浮细胞或颗粒大于约5微米，小于约250微米的尺寸（用于成像和图像处理）及其与相容性的能力在一个顺磁性溶液中的溶液混合，如这里使用的钆布醇。用于疾病诊断，兼容的应用包括那些，其中（i）所关注的细胞固有地具有改变的密度相比健康对照，当他们携带的疾病，（ii）一种密度变化所用的细胞通过加入试剂或部分被诱导替代治疗一个短cubation时间，或（iii）不同类型的细胞在单个样品中的被识别和固有（或通过某些治疗）具有独特特征的密度。
镰状细胞病是一种遗传性疾病引起的血红蛋白，HbS的，在一个人的红血细胞（红细胞）要生产的突变形式，其可以导致间歇性血管闭塞事件和慢性溶血性贫血9。它是使用任一血红蛋白等电聚焦，高效液相色谱（HPLC）分离，或血红蛋白电泳是高度准确的，但必须在临床测试实验室，因为它们是与点 – – 关心设置不兼容进行诊断。溶解性和纸基测试镰状细胞病已经被提出，但一般需要用户的主观解释和确证试验。在这里，我们使用了基于密度的方式来确定镰刀红细胞，从而达到比RB更高的密度CS由人没有镰状细胞病。该机制涉及血红蛋白，HBS的突变形式，这将导致红细胞脱水的镰状细胞病的RBCs脱氧条件10，11，12，13下的聚合。
这种基于密度的方法还可以应用到密度的基础上分开的不同类型的细胞：白血细胞（白细胞）和红细胞7。白细胞通常负责在体内抵抗感染。白细胞术可用于量化这些细胞在血液中的数量，并作为一个有用的诊断工具。白细胞计数高于正常（一般认为每微升更大的超过11,000细胞）可能表明感染，免疫系统疾病，或白血病。白细胞计数低于在正常范围（约3500每μL细胞）可能由自身免疫性疾病或康迪特引起离子的损害骨髓。不像替代技术，这里提出的方法不以鉴定白细胞依赖于红细胞或污渍的裂解。这种基于细胞的试验利用了两种细胞类型的独特固有密度进行分离，作为WBC种群密度已经报道为比如先前使用密度梯度离心2,3计算出的RBC群体的低。
相比在远程位置变质测试，这个测试是快速，简单的样品制备（ 图3），在该装置的分离单元10内- 15分钟，自动成像和分析需要不到1分钟。以这种方式，该装置可迅速地返回结果以更好地告知医疗决定，允许处理被立即施用，以减轻身体和心理痛苦，并减少并发症associ的风险ated与医疗保健的延迟。可以在现场或在临床环境，由于简单的样品制备和自动成像和分析返回以最小的用户输入或解释的结果来执行该技术。因为使用的使用试样分析永久磁铁和使用任一智慧型手机或用于成像和图像处理简单的电子部件的一个简单的方法，相对于一些复杂的测试程序的装置，以及每次测试成本是最小的。
Protocol
Representative Results
Discussion
该议定书中的关键步骤
在此过程中的关键因素包括磁体的正确对准。如果磁体成为脱落或在装置内分离超过正常值，这可能会影响结果。为了控制这种故障或其他人在这个过程中，一个密度控制的颗粒，如聚苯乙烯微球，可周期性用于控制随时间的变化。另外，悬浮时间是很重要的，以使细胞以达到平衡。对于红细胞，10分钟是足以允许所有的细胞以达到平衡。然而，要注意的是更小的颗粒?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Matthew Heeney of Boston Children’s Hospital/Dana-Farber Cancer Institute and Dr. Farzana Pashankar of Yale-New Haven Hospital for providing sickle cell patient samples. The authors would like to thank Chu H. Yu and Ashwini Joshi for their assistance in testing these samples and compiling the data.
S.T. acknowledges the American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25080056) and the University of Connecticut Research Excellence Program award for financial support of this research. S.K. acknowledges that this material is based upon work supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1247393).
Materials
| Gadavist (Bayer) | Jefferson Medical and Imaging | 2068062 | Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 mL vials with 15/ca. |
| Square glass microcapillary tubes | Vitrocom | 8270 | 50 mm length is sufficient |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | S9000 | Chemical formula: Na2S2O5 |
| Leica Microsystems Critoseal tube sealant | Fisher Scientific | 02-676-20 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9269 SIGMA | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Or other reagent as recommended for the cell type used |
| MICROLET 2 Adjustable Lancing Device | Walgreens | 246567 | Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols |
| Microlet Lancets | Walgreens | 667474 | Must be dispoable and not reused |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Or any preferred method for cell counting |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A1049201 |
References
- Tasoglu, S., Khoory, J., Tekin, H., Thomas, C., Karnoub, A., Ghiran, I., Demirci, U. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Tasoglu, S., Yu, C. H., Liadudanskaya, V., Guven, S., Migliaresi, C., Demirci, U. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Tasoglu, S., Yu, C. H., Gungordu, H. I., Guven, S., Vural, T., Demirci, U. Guided and magnetic self-assembly of magnetoceptive gels. Nature Communications. 5, 4702 (2014).
- Amin, R., Knowlton, S., Yenilmez, B., Hart, A., Joshi, A., Tasoglu, S. Smart-phone Attachable, Flow-Assisted Magnetic Focusing Device. RSC Advances. 6, 93922-93931 (2016).
- Knowlton, S. M., Sencan, I., Aytar, Y., Khoory, J., Heeney, M. M., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Sickle Cell Detection Using a Smartphone. Sci Rep. 5, 15022 (2015).
- Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), e0134400 (2015).
- Yenilmez, B., Knowlton, S., Tasoglu, S. Self-Contained Handheld Magnetic Platform for Point of Care Cytometry in Biological Samples . Advanced Materials Technologies. 1, 1600144 (2016).
- Yenilmez, B., Knowlton, S., Yu, C. H., Heeney, M., Tasoglu, S. Label-Free Sickle Cell Disease Diagnosis Using a Low-Cost, Handheld Platform. Adv Mat Tech. 1 (5), 1600100 (2016).
- Bender, M. A., Douthitt Seibel, G., Pagon, R. A., et al. . GeneReviews. , (1993).
- Kaul, D. K., Fabry, M. E., Windisch, P., Baez, S., Nagel, R. L. Erythrocytes in sickle cell anemia are heterogeneous in their rheological and hemodynamic characteristics. J Clin Invest. 72 (1), 22-31 (1983).
- Joiner, C. H. Gardos pathway to sickle cell therapies?. Blood. 111 (8), 3918-3919 (2008).
- Finch, J. T., Perutz, M. F., Bertles, J. F., Döbler, J. Structure of Sickled Erythrocytes and of Sickle-Cell Hemoglobin Fibers. Proc Natl Acad Sci. 70 (3), 718-722 (1973).
- Lew, V. L., Etzion, Z., Bookchin, R. M. Dehydration response of sickle cells to sickling-induced Ca(++) permeabilization. Blood. 99 (7), 2578-2585 (2002).
- Ernst, D. J. . NCCLS Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture: Approved Standard-Sixth Addition. 27 (26), (2007).
