Abstract
Kromatin immunoprecipitation (chip) är ett oumbärligt verktyg inom epigenetik och genreglering som isolerar specifika protein-DNA-interaktioner. ChIP kopplad till hög genomströmning sekvensering (chip-seq) används ofta för att bestämma den genomiska lokaliseringen av proteiner som interagerar med kromatin. Dock är Chip-punkter hindras av relativt låg kartläggning upplösning av flera hundra baspar och hög bakgrundssignal. Chipet-exo metoden är en förfinad version av Chip-punkter som väsentligt förbättrar både upplösning och buller. Den viktigaste skillnaden av chip-exo metodik är införlivandet av lambda exonukleas nedbrytning i beredningen bibliotek arbetsflöde för att effektivt fotavtryck vänster och höger 5 'DNA-gränser protein DNA tvärbindningsplatsen. Chipet-exo bibliotek utsätts sedan för hög genomströmning sekvensering. Den resulterande data kan utnyttjas för att ge unika och extremt hög upplösning insikter i den funktionella organisationen of genomet. Här beskriver vi chip-exo metod som vi har optimerat och rationaliseras för däggdjurssystem och nästa generations sekvensering genom syntes plattform.
Introduction
Kromatin immunoprecipitation (chip) är en kraftfull metod för att studera mekanismer för genreglering genom att selektivt anrika för DNA-fragment som interagerar med ett givet protein i levande celler. Detektionsmetoder chip-berikat DNA-fragment har utvecklats som tekniken förbättras, från upptäckt av en enda locus (standard Chip-qPCR) hybridisering på oligonukleotid microarrays (chip-chip) och hög genomströmning sekvensering (chip-punkter) 1. Även Chip-punkter har sett utbredd tillämpning, kromatin heterogenitet och ospecifika DNA-interaktioner har försvårat datakvalitet leder till falska positiva och oprecisa kartläggning. För att kringgå dessa begränsningar, Dr. Frank Pugh utvecklade chip-exo metod 2. Det framträdande särdrag av ChIP-exo är att den innehåller en 5 'till 3' exonukleas, vilket effektivt footprint för transkriptionsfaktorbindningsplatser. Som ett resultat uppnår Chip-exo metodik högre upplösning, större dynamiskt omfång av detection, och lägre bakgrundsbrus.
Även Chip-exo är mer tekniskt utmanande att bemästra än Chip-punkter, är det i stor utsträckning antagits som studier syftar till att få unika ultrahög upplösning insikter med hjälp av olika biologiska system 3-8. I själva verket har Chip-exo framgångsrikt tillämpats på bakterier, jäst, mus, råtta och humana cellsystem. Som bevis i princip var Chip-exo ursprungligen användes för att identifiera den exakta bindningsmotiv för en handfull jäst transkriptionsfaktorer 2. Tekniken användes även i jäst för att studera organisationen av transkriptions före initiering komplex och att dechiffrera subnucleosomal struktur av olika histoner 9,10. På senare tid, belånade vi Chip-exo att lösa intilliggande TFIIB och Pol II bindande händelser på mänskliga promotorer, och visade att utbredd avvikande transkription beror tydlig initiering komplex 11.
Arbetsflödet som presenteras här är optimerad och streamlined för däggdjur Chip-exo (Figur 1). Först, lever primära eller vävnadsodlingsceller som behandlats med formaldehyd för att bevara in vivo-protein-DNA-interaktioner genom en kovalent tvärbindning. Cellerna lyseras och kromatin klippt till ~ 100 - 500 baspar storlek fragment. ChIP sedan selektivt berikar för DNA-fragment tvärbundna till proteinet av intresse. Vid denna punkt, är ChIP-seq bibliotek framställs typiskt, som i sig begränsar upplösningen detekteringen till den genomsnittliga fragmentstorleken av några hundra baspar. Men vinner Chip-exo denna begränsning genom att trimma vänster och höger 5 'DNA-gränser protein DNA tvärbindning plats med lambda exonukleas. Sekvense bibliotek konstrueras sedan från exonukleas nedbrutna DNA: t enligt nedan. De resulterande kapslade 5 "gränser representerar en in vivo-footprint av proteinet-DNA interaktion (figur 1, steg 14), och detekteras av hög genomströmning sekvensering. altHough chip-exo metodik är mer engagerade än Chip-punkter, övergångar mellan de flesta steg kräver enkel pärla tvätt, vilket minimerar provförlust och experimentell variabilitet. Viktigt, eftersom chip-exo är en förfinad version av Chip-punkter, något prov som är framgångsrik med Chip-punkter bör också vara framgångsrika med Chip-exo.
In vivo-footprinting av protein-DNA-interaktioner med Chip-exo resulterar i en i grunden skiljer datastruktur från Chip-punkter. Även vanliga Chip-punkter som ringer kan appliceras på Chip-exo data, för att få de mest exakta topp samtal rekommenderar vi bioinformatiska verktyg särskilt utformade med den unika strukturen av Chip-exo data i minnet. Dessa inkluderar Genetrack, GEM, muskotblomma, Peakzilla och ExoProfiler 12-15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Dubbel destillerat H2O eller molekylärbiologisk kvalitet motsvarande rekommenderas för alla buffertar och reaktioner mixar.
Dag 0: Material Förberedelser och Cell Harvest
1. Buffert Framställning
- Förbereda Lysis Buffertar 1 - 3 (Tabell 1 - 3) och tillsätt 100 pl komplett proteasinhibitor lager (KPI) till 50 ml av varje buffert just före användning. Förbered KPI lager genom att lösa en tablett i en ml av molekylärbiologisk kvalitet H2O
- Förbereda ChIP Buffertar (tabellerna 4 - 7). Tillsätt 100 l KPI lager till 50 ml Blockering och RIPA buffertar. Lägg inte till KPI Tris och chip Elueringsbuffertar.
2. Glödgning av adapter oligonukleotider
Obs: Specifika oligonukleotidsekvenser kan hittas i avsnittet Ytterligare information.
- Förbered Adapter Anlöpblandningar (Tabell 8 - 9). Vortex att blanda och kortsnurra rören för att samla innehållet. Alikvotera 100 pl av varje blandning i 0,5 ml rör.
- Hybridisera oligonukleotiderna genom att köra programmet (tabell 10) i termo.
Store glödgade oligonukleotider vid -80 ° C.
3. In vivo Kromatin Tvärbindning med Formaldehyd
OBS: För en typisk ChIP experiment, bör utgångsmaterialet innehålla cirka 50 miljoner celler.
- Tillsätta färsk 37% metanol-fri formaldehyd stamlösning till fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tvättade cellkultur till en slutlig koncentration av 1% (volym / volym), blanda väl och låt stå vid rumstemperatur under 10 min.
OBS: Till exempel lägger vi vanligen 1,4 ml av 37% metanol-fri formaldehyd till celler i 50 ml rumstemperatur PBS. Undvik också att formaldehyd tvärbindning i media sedan proteiner i media kommer att släcka en del av formaldehyd. - Släcka tvärbindningsreaktionen genom att tillsätta 2,5 M glycine för en slutlig koncentration av 125 mM. Blanda omsorgsfullt.
- Överföra cellerna till 50 ml rör på is. Snurra cellerna under 5 min vid 1000 xg vid 4 ° C. Dekantera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml iskall 1 x PBS till cellpelleten och återsuspendera genom pipettering. Överföra till 1,5 ml rör.
- Snurra cellerna under 3 min vid 2000 xg vid 4 ° C. Aspirera supernatanten.
- Omedelbart flash frysa cellpellets i 1,5 ml rör med flytande kväve. Förvara vid -80 ° C. Tvärbundna celler är stabila under obegränsad tid vid -80 ° C.
Dag 1: Cell Lysis, sonikering, och chip
4. Cell Lysis
OBS: Under alla cellslys sektioner MÅSTE provexemplaren förvaras på is eller vid 4 ° C för att minimera tvärbindnings vändning.
- tina en kort stund tvärbunden cellpelleten. Noggrant återsuspendera varje pellet i 0,5 ml lyseringsbuffert 1 och kombinera med 4,5 ml lyseringsbuffert 1 i ett 15 ml polystyrenrör.
- Berg rören under 10 minuter vid 4 ° Cefter på en gungande plattform. Spin för 4 min vid 2000 xg vid 4 ° C. Dekantera supernatanten.
- Noggrant återsuspendera varje pellet i 0,5 ml lyseringsbuffert 2 och tillsätt 4,5 ml lyseringsbuffert 2 gång återsuspenderas.
- Rock under 5 minuter vid 4 ° C på en gungande plattform. Spin under 5 minuter vid 2000 xg vid 4 ° C. Dekantera supernatanten och knacka försiktigt överskott på hushållspapper.
- Noggrant återsuspendera varje pellet i 0,5 ml lyseringsbuffert 3 och tillsätt 1 ml lyseringsbuffert 3 en gång återsuspenderas. Håll nukleära lysat på is och omedelbart gå vidare till ultraljudsbehandling.
5. Sonikering atom Lysat
OBS: Under alla sonication sektioner MÅSTE proverna hållas på is för att minimera tvärbindnings vändning. Den specifika modellen av sonikator användas i samband med protokollet nedan kan hittas i tabellen of Materials. Detaljer om särskilda ultraljudanvändning och riktlinjer för andra instrument kan hittas i avsnittet Ytterligare information.
- pless resonans adaptrar i 15 ml polystyrenrör innehållande nukleära extrakt (metall bar bör inte vidröra rörväggen).
- Sonikera nukleära lysat i en iskall vattenbad i 2 x 15 min sessioner med 30 sekunder ON / 30 sek OFF vid medelhög effekt. Endast sonikera två 15 ml rör i taget. Dessa inställningar fungerar på ett brett spektrum av cellinjer och typer primära cell, men ytterligare optimering kan behövas om kromatin klippning är ofullständig.
- För att kontrollera sonication resultat, överföring 2 x 10 ul prover från lysat i 1,5 ml rör.
- Att vända tvärbindningar, kombinera de första 10 | il alikvot med 10 | j, l TE-RNas A och 0,2 | j, l av proteinas K. Inkubera vid 37 ° C under 30 min. Tillsätt 4 l 6x xylen DNA färgämne.
- För att bevara tvärbindningar, kombinera den andra 10 pl alikvot med 2 pl 6x xylen DNA färgämne.
- Köra båda proverna på en 1,5% agarosgel vid 140 V under ca 30 - 45 min till dess att bromfenol färgämne i stegen is ¾ av vägen ner gelen.
- Om ultraljudsbehandling var framgångsrika (de flesta DNA-fragment klippta till 100-500 bp), överföring sonikerades lysat till 2 ml rör innehållande 150 | il 10% Triton X-100. Vortex för att blanda.
- Till pellets olöslig kromatin och skräp, snurra sonikerad kärn lysat under 10 minuter vid 20.000 xg vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till ett nytt 2 ml rör. Fortsätt omedelbart till chip eller förvara prover vid -80 ° C på obestämd tid. Sonikerade extrakt får inte frysas och tinas mer än en gång.
6. Koppling Antikropp mot Pärlor
OBS: Aldrig virvel eller frysning / tina magnetiska pärlor eftersom de kommer att splittras och öka bakgrundssignal.
- Efter noggrann blandning lager, alikvot Y il pärluppslamningen i 1,5 ml rör, där Y = 1,1 x 2,5 pl x (antal flisprover). Bindande kapacitet för 2,5 l pärluppslamningen är upp till 13 mikrogram IgG. Tvätta poolade pärlor 3x med 1 ml BlockeringBuffert.
- För mer konsekvent aliquotting pärlor efter tvättar, återsuspendera pärlor i 10x ursprungliga slamvolymen (25 ^ / chip) med blockeringsbuffert. Alikvotera 25 ul per chip prov i 1,5 ml rör.
- Lägga 5-10 | ig av antikropp till motsvarande alikvot av återsuspendera pärlorna. Bringa den slutliga volymen upp till 250 | j, l med blockeringsbuffert. Inkubera prover under 4 h (alternativt, över natten i 16 timmar) på en roterande plattform vid 4 ° C.
- Aspirera supernatanten. För att avlägsna obunden eller överskott av antikropp, tvätta pärlor gång med 1 ml blockerande buffert.
- Efter aspire sista tvättningen, omedelbart lägga 50 miljoner cellekvivalenter av sonikerade extrakt (~ 1,6 ml) till antikropp: pärla konjugat. Om sonikerade extrakt är inte redo, återsuspendera pärlor i 100 l blockerande buffert tills de är redo. Det är viktigt att aldrig låta kulorna torka.
7. Kromatin Immunoprecipitation (chip)
- För varje chip prov, kombinera 1,5 ml sonikatd extrakt med antikropp: pärla konjugat i 1,5 ml eller 2 ml rör.
- Inkubera rören på en mini-rör rotator över natten (ca 16 h) vid hastighetsinställning av 9 vid 4 ° C. Kontrollera efter ett par minuter för att säkerställa proverna inte läcker och blandar ordentligt.
Dag 2: ChIP Tvättar och On-harts enzymatiska reaktioner
8. ChIP Tvättar
OBS: För att minimera korskontaminering, kort snurra rören mellan varje tvätt. För första aspiration, byta tips mellan varje prov. Under efterföljande tvättar, kan samma spets användas så länge som den inte röra pärlorna. Se Ytterligare information avsnitt för anvisningar om korrekt flistvätt.
- Mycket kortfattat snurra rören med hjälp av en mikro (~ 3 sek vid 500 xg) för att samla vätska i lock och placera på den magnetiska rack för en minut. Medan fortfarande på den magnetiska rack, aspirera extrakt.
- Lägga 0,75 ml RIPA-buffert till varje rör. Ta bort rören från magnetiska rackoch vänd flera gånger för att blanda. Byt rören på magnetisk rack och aspirera supernatanten. Upprepa 7x.
- Lägga 0,75 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) till varje rör. Ta bort rören från magnetiska rack och vänd flera gånger för att blanda. Byt rören på magnetisk rack och aspirera supernatanten. Upprepa 2x.
- Efter aspire sista tvättningen, fortsätt till polering.
Obs: Efter varje inkubation reaktion i avsnitten 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3 och 15.3, spinnrören kort och plats mot magnetisk rack för en minut och aspirera supernatanten. Tvätta 2x med 0,75 ml RIPA-buffert och 2x med 0,75 ml Tris-HCl (pH 7,5).
9. Polering Reaktion
- Fyll Poler Master Mix beräkningar (tabell 11). Gör Poler mix i 1,5 ml rör på is. Pipett för att blanda.
- Omedelbart efter sista ChIP tvätt aspireras, tillsätt 50 | il av Polering blandning till varje prov harts medan den fortfarande på den magnetiska rack. Inkubera proverna för 30 min vid 3 xgvid 30 ° C i en Thermo.
- Efter aspire sista tvättningen som beskrivs i not efter avsnitt 8.4, gå vidare till A-svans.
10. A-svans Reaktion
- Fyll i A-handel Master Mix beräkningar (tabell 12). Gör A-svans blandning i en 1,5 ml rör på is. Pipett för att blanda.
- Omedelbart efter polering avsnittet, tillsätt 50 | il av A-tailing blandning till varje prov harts medan den fortfarande på den magnetiska rack. Inkubera prover under 30 min vid 3 xg vid 37 C i en Thermomixer.
- Efter aspire sista tvättningen som beskrivs i not efter avsnitt 8.4, gå vidare till P7 Adapter Ligation.
11. P7 Adapter ligeringsreaktion
- Fyll Ligering Master Mix beräkningar (tabell 13). Göra Ligering blanda i 1,5 ml rör på is. Pipett för att blanda.
- Omedelbart efter A-svans avsnitt, tillsätt 48 l P7 Ligering huvudblandning och 2 pl av en annan adapter index to varje hartsprov samtidigt på den magnetiska rack. Inkubera prover under 2 timmar vid 3 xg vid 25 C i en Thermomixer.
Anmärkning: Användning av olika index för varje prov kommer att tillåta fler prover som skall sekvenseras i en enda flödescell. - Efter aspire sista tvättningen som beskrivs i not efter avsnitt 8.4, gå vidare till Φ-29 Nick Repair.
12. Phi-29 Nick Repair Reaktion
- Fyll Φ-29 Master Mix beräkningar (tabell 14). Gör Φ-29 blandning i 1,5 ml rör på is. Pipett för att blanda.
- Omedelbart efter P7 Ligering avsnitt, tillsätt 50 pl Φ-29 blandning till varje hartsprov samtidigt på den magnetiska rack. Inkubera prov i 20 minuter vid 3 xg vid 30 ° C i en Thermo.
- Efter aspire sista tvättningen som beskrivs i not efter avsnitt 8.4, gå vidare till kinasreaktionen.
13. kinasreaktion
- Fyll Kinas Master Mix beräkningar (
- Omedelbart efter Φ-29 sektion, tillsätt 50 pl kinas mix till varje hartsprov samtidigt på den magnetiska rack. Inkubera prover under 20 min vid 3 xg vid 37 C i en Thermomixer.
- Efter aspire sista tvättningen som beskrivs i not efter avsnitt 8.4, gå vidare till Lambda exonukleas reaktion.
14. Lambda exonukleas Reaktion
- Fylla i Lambda exonukleas Master Mix beräkningar (tabell 16). Gör Lambda exonukleas blanda i 1,5 ml rör på is. Pipett för att blanda.
- Omedelbart efter Kinase avsnitt, tillsätt 50 pl Lambda exonukleas mix till varje hartsprov samtidigt på den magnetiska rack. Inkubera prover under 30 min vid 3 xg vid 37 C i en Thermomixer.
- Efter aspire sista tvättningen som beskrivs i not efter avsnitt 8.4, gå vidare till RecJ f reaktion.
15. RecJ fnukleas Reaktion
- Fyll RecJ f Master Mix beräkningar (tabell 17). Gör RecJ f mix i 1,5 ml rör på is. Pipett för att blanda.
- Omedelbart efter Lambda exonukleas avsnitt, tillsätt 50 pl RecJ f mix till varje hartsprov samtidigt på den magnetiska rack. Inkubera prover under 30 min vid 3 xg vid 37 C i en Thermomixer.
- Efter aspire sista tvättningen som beskrivs i not efter avsnitt 8.4, gå vidare till chip Elution.
16. Eluering och Cross Återföring
- Förbered Master Mix: antal prover x 1,1 x (200 pl ChIP elueringsbuffert + 1 pl 20 mg / ml proteinas K) i 1,5 ml rör. Tillsätt 200 l ChIP Elution Buffer + proteinas K Master Mix till varje prov harts.
- Inkubera proverna över natten (ca 16 h) vid 3 xg vid 65 ° C i en Thermo med en uppvärmd lock för att förhindra kondens.
Dag 3: DNA-extraktjon och Adapter Ligering
17. Eluering och Cross Återföring (fortsatt)
- Efter inkubation över natten vid 65 C, under kort snurra prover för att samla kondensat. Placera prov på magnetisk rack för en min.
- Överföring 200 pl supernatant till ett nytt 1,5 ml rör innehållande 200 | j, l TE-buffert (pH 7,5).
18. Fenol Kloroform isoamylalkohol (PCIAA) Extraktion
- Tillsätt 400 | il fenol kloroform isoamylalkohol till varje prov. Virvel för att blanda under 20 sek.
- Centrifugera i 10 minuter vid 20.000 xg vid rumstemperatur (RT). Försiktigt överföra 325 ul av den övre vattenskiktet till ett nytt rör.
Obs: Var noga med att inte överföra något av den organiska (nedre skiktet) i det nya röret. - Lägga 1/10 volym av 3 M NaOAc (pH 5,5) och 1 | il 20 mg / ml glykogen till varje prov. För flera prover, förbereda en huvudblandning.
- Tillsätt 3 volymer iskall 100% etanol till varje prov. Virvelatt blanda. Inkubera i 15 minuter vid -80 C.
- Centrifugera i 15 minuter vid 20.000 xg vid 4 C. Dekantera försiktigt supernatanten och se till att inte störa pelleten.
- Försiktigt Tillsätt 500 l nybakade iskall 70% etanol, och se till att inte störa pelleten. Centrifugera i 5 minuter vid 20.000 xg vid 4 C. Dekantera försiktigt supernatanten.
- Torr pellet i ungefär 20 min (eller tills den är torr) i en hastighet vakuum vid 45 C.
OBS: Detta är en paus punkt i protokollet. Torra DNA-pellets kan lagras vid -20 C. - Resuspendera pellets i 10 pl DDH 2 O. Pipet upprepade gånger över det område där DNA pellet, trots den torkade pelleten kan inte ses.
- Överföra 10 | il av varje prov till ett färskt 0,3 ml PCR-rör eller 8-rack, beroende på antalet prov.
19. P7 primerförlängningsreaktion
- Fylla i P7 Primer Extension Master Mix beräkningar (tabell 18). Gör Extension blanda i 1,5 ml rör på is. Pipett för att blanda.
- Tillsätt 10 pl Extension mix (minus Φ-29 polymeras) till varje 10 pl prov. Pipett för att blanda.
- Kör prover i termo med hjälp av programmet (tabell 19) till glödga primer till mall till 30 ˚C "hold" steg.
- Tillsätt 1 pl Φ-29 polymeras under 30 ˚C "hold" steg i programmet. Pipett för att blanda. Återuppta återstoden av programmet (tabell 19).
20. A-svans Reaktion
- Fyll i A-handel Master Mix beräkningar (tabell 20). Gör A-svans blandning i en 1,5 ml rör på is. Pipett för att blanda.
- Tillsätt 10 | il av A-tailing blandning till varje prov. Pipett för att blanda.
- I Thermocycler, inkubera prover för 30 min vid 37 C och därefter värmeinaktivering under 20 min vid 75 C.
21. P5 Adapter ligeringsreaktion
- fill ut P5 Adapter Ligeringsprodukter Master Mix beräkningar (tabell 21). Göra Ligering blanda i 1,5 ml rör på is. Pipett för att blanda.
- Tillsätt 20 | il av P5 ligeringsblandningen till varje prov. Pipett för att blanda.
- I Thermocycler, inkubera prover under 2 timmar vid 25 C.
22. Bead Clean-up
Obs: se Material avsnitt för tillverkare information om pärla städa upp.
- Överför varje 50 pl prov till en ny 1,5 ml rör.
- Resuspendera städa upp pärlor på en mini-rör rotator vid hastighetsinställning av 15 under 15 min vid RT. Låt inte pärlor lösa innan pipettering.
- Tillsätt 60 pl städa upp pärlor att prova (1,2: 1 städa upp pärlor att provkvot är avgörande för att avlägsna DNA som är kortare än 200 baspar). Pipett blandas under 20 sek.
- Resuspendera städa upp pärlor på en mini-rör rotator vid hastighetsinställning av 15 i 3 min vid RT. snurra kort rör.
- Placera rören på den magnetiska rack för en min.Pipettera bort och kasta supernatanten.
OBS: Använd INTE vakuumaspiration i detta avsnitt eftersom det kommer att suga upp sanerings pärlor. - Tillsätt 400 pl av nybakade RT 70% etanol till varje prov medan de är på magnetiska rack. Blanda inte. Aspirera supernatanten. Upprepa 2x.
- Torka sanering pärlor under 10 minuter vid RT. Färgen på pärlorna blir mörkt till ljusbruna och mycket små sprickor syns i harts pelleten när kulorna är torra.
- Att eluera DNA, tillsätt 40 | il 10 mM Tris (pH 7,5). Noggrant pipettera att blanda i 20 sekunder.
- Placera proverna på den magnetiska rack för en min. Långsamt pipettera och överföra 36 il eluat direkt till 0,3 ml PCR-rör.
- Gå direkt till PCR-reaktion eller lagra eluaten vid -20 ° C.
Dag 4: PCR och gelanalys
23. PCR
- Fyll PCR Master Mix beräkningar (tabell 22). Gör PCR-blandning. Pipett mycket försiktigt för att blanda för att undvikabubblor.
- Lägg 14 il PCR-blandning till varje 36 pl DNA-prov. Pipett för att blanda. Håll proverna på is tills redo att sätta i Thermocycler.
- För den positiva PCR-kontroll, inkluderar en tidigare framställd bibliotek. För den negativa PCR-kontroll, inkluderar vatten. Kör prover i termo använder PCR-program (tabell 23).
24. Gel Förberedelse, DNA Excision, och visualisering
- Rengör och skölj en lämplig storlek gel låda med avjoniserat vatten. Bered en 1,5% agarosgel (innehållande 0,5 mg / ml etidiumbromid) med tjocka, bred brunnar kam som kan hålla 60 fil.
OBS: Etidiumbromid (EtBr) är cancerframkallande och måste hanteras varsamt. - Spinn ner PCR-provrören kort att samla kondens.
- Lägg 1/5 volym av 6x xylen DNA färgämnet kombinerat prov. Använd inte bromofenolblått i DNA-färgämne eftersom den vandrar på samma plats som prov-DNA.
- Ladda hela provet into varje brunn, företrädesvis med tomma brunnar i mellan proven.
Obs: Bibliotek med samma index får ej köras i samma gel. - Belastning 7 | il 100 bp stege på vardera sidan av prover. Kör gelen vid 140 V under ca 30-45 min tills bromofenol färgämne i stege är ¾ väg ner gelen.
- Bild och visualisera gel på en transilluminator vid en låg UV inställning. Skära ut delar av agaros innehållande DNA-fragment 200-500 bp. Var mycket noga med att undvika att skära ut adapter dimer band som löper på 125 bp.
- Placera varje utskurna gelskiva i en 15 ml tub. Rekord nettovikt av varje gel skiva. Skriv denna vikt direkt på röret.
- Bild, spara och kommentera exciderad gel för att bekräfta rätt storleksintervall väljs.
25. Gel Purification
- Rena DNA från utskurna gelskiva i enlighet med tillverkarens instruktioner, med följande modifieringar.
- Upplösa gelskivan genom att gungavid RT på gungande plattform. Det kommer att ta ca 20 minuter för att lösa upp.
- För att erhålla högrenat DNA, tvätta kolonner med 0,5 ml buffert QG efter upplöst gel har passerat genom kolonnen.
- Efter Buffer PE tvätta, låt kolumner sitta vid RT i 2-5 min. Snurra under 1 min vid 13000 x g vid RT.
- Att ge utrymme för PCR reaktion Master Mix Driv prover med 40 | il EB buffert i ett nytt 1,5 ml rör.
26. DNA Kvantifiering
- Framställning av prover i enlighet med tillverkarens instruktioner (Tabell 24). Mät prover i angiven instrument med optiska rör.
- När Chip-exo bibliotek kvantifieras lämna för sekvensering på en plattform som använder sekvensering genom syntes kemi 16 som är kompatibel med DNA-adaptrar i detta protokoll.
OBS: Typiskt är 2 | il av provet tillräckligt för kvantifiering, men mer kan vara nödvändigt om provkoncentrationen är lägre. DNA ger typisktly intervall mellan 50 och 200 ng. - Efter kvantifiering, lagra prover vid -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Följande figurer illustrerar representativa resultat från Chip-exo Protokollet presenteras här. I motsats till traditionella Chip-punkter metoder med några enzymatiska steg, kräver Chip-exo elva sekventiellt beroende enzymatiska reaktioner (Figur 1). Sålunda måste man vara noga med vid varje steg för att säkerställa att varje reaktionskomponent tillsätts till dess respektive reaktionshuvudblandning. Vi rekommenderar att generera en formel kalkylblad baserat på reaktions tabellerna för att automatiskt utföra reaktion Master Mix beräkningar, skriver de resulterande tabellerna, och sedan bocka av varje punkt efter det läggs till Master Mix.
Vi använder ett antal åtgärder för kvalitetskontroll hela protokollet för att säkerställa hög kvalitet sekvense resultat (Figur 2). Varje chip reaktion innehåller tre grundläggande komponenter: 1) sonikerad kromatin extrakt från celler av interest, 2) en antikropp riktad mot proteinet av intresse, och 3) ProteinG (eller proteína) harts för att immobilisera de utfällda immunkomplex. Erhålla högkvalitativa sonikerad kromatin extrakt (Figur 2A) kan vara ganska krävande, eftersom sonikering villkor måste optimeras för varje celltyp och sonikering instrument. Det är värt att lägga tid att optimera detta steg, eftersom de högsta biblioteken kvalitet börjar med en ultraljuds resultat som ger DNA-fragment mellan 100-500 bp (figur 2A, "+" lane). Eftersom formaldehydtvärbindningar är labila och formaldehyd själv har en begränsad hållbarhetstid, använder vi en elektroforetisk rörlighet shift assay (Figur 2A "-" lane) att kontrollera att de sonikerade extrakt innehåller intakta protein-DNA tvärbindningar, tydligt som super-förskjutning av DNA-fragmenten. För att bedöma bakgrundssignal vi rutinmässigt utför en "mock" chip som utelämnar antikroppar från chipet reaktionen. En hög kvalitet chip-exo bibliotek preparatet kommer att ha mycket lite, om någon, bakgrundssignal i "mock" ChIP ( "-") i förhållande till den specifika ChIP-antikropp, i detta fall riktad mot Pol II. Som framgår av Figur 2B, traditionella Chip-punkter bibliotek har betydligt mer bakgrundssignal än Chip-exo. Slutligen före sekvensering, Chip-exo bibliotek kvalitet bedöms på Bioanalyzer (figur 2C - D). Analys mäter noggrant biblioteksstorleksfördelning och upptäcker förorenande adapter dimerer (betecknade med pil) som körs på 125 bp. Om adapter dimerer är närvarande, kommer de minskar sekvense bandbredd. Därför rekommenderar vi en extra pärla sanering som effektivt tar bort DNA-fragment mindre än 200 bp.
Chip-exo är en kraftfull funktionell genomisk teknik eftersom det är det enda sättet kan spatialt lösa divergerande, initiera, paus, och förlängning RNA-polymeras II ona genomet hela skalan (Figur 3) 11. Eftersom dessa intilliggande bindningshändelser är tiotals baspar isär, är Chip-punkter kan inte skilja dessa bindande händelser med upplösningsförmåga av flera hundra baspar.
Figur 1: Chip-exo Schematisk. Efter Chip är P7 adapter ligeras till sonication gränser. Lambda exonukleas trimmar därefter DNA 5 'till 3' i förhållande till tvärbindningspunkt, varifootprint för protein-DNA-interaktion. Efter eluering och tvärbindnings återföring, syntetiserar primerextension duplex-DNA. Slutligen ligering av P5 adapter markerar vänster och höger exonukleas gränser och det resulterande biblioteket utsattes för hög genomströmning sekvensering. Kartläggning av 5'-ändarna av de sekvensmarkörer till referens genomet avgränsar exonukleaset barriären och därmed den exakta platsen för protein DNAtvärbindning. Figur modifierad från Rhee och Pugh 17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Chip-exo kvalitetskontroller. Paneler AC visar representativa resultat från obesläktade experiment. (A) Kvaliteten på den sonikerade kromatin extrakt (från den humana HCC1806 bröstcancercellinje) bedöms genom agarosgelelektrofores på extrakt med (+) och utan (-) tvärbindningarna omvända. Intakta tvärbindningar kommer att orsaka protein-DNA-komplex att migrera långsammare. Således kör extrakt utan tvärbindningar omvänd (-) gör det möjligt att kvaliteten på formaldehydtvärbindningar som skall bedömas, som är avgörande för en lyckad chip. (B) Jämförelse av en mock IP (-) innebär ennd Pol II (+) Chip-exo och Chip-punkter biblioteks preparat efter 21 cykler av PCR-amplifiering. Efter PCR, DNA-fragment 200-500 bp skärs (betecknas med röda streckade rutan) och renas med hjälp av en gelextraheringskit. (CD) I panel C, representerar toppspår en idealisk spår från en poolad bibliotek (P1), och bottenspåret visar en poolad bibliotek (P2) som innehåller adapter dimerer. Panel D visar DNA-densitet tomt motsvarar P1-2 biblioteks spår från panelen C (pil betecknar adapter dimer band). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Chip-exo Löser Spatially Distinct Bidirectional transkriptionsinitiering Anläggningar. (A) Utjämnad distribution av sträng SeparatEd Chip-exo tag 5 'ändar för Pol II, TFIIB och TBP på mänskliga RPS12 genen i prolifererande K562-celler. (B) var i genomsnitt Chip-exo mönster runt närmaste RefSeq TSS. Topp-par taggar anpassades till TSS-genen-by-genen, arkiveras i icke-överlappande 10 bp intervaller i förhållande till TSS, och sedan den genomsnittliga topp-par densitetsvärde i alla TFIIB ockuperade (n = 6,511) gener avsattes som en procent av den totala. De "spikar" av TBP och TFIIB är urskiljbara (vertikalt förskjutna i infälld). (C) Modellbaserad på panel B data visar tydliga transkriptionsinitiering komplex lösas genom Chip-exo (svart spår). Pol II ockuperade två separata upplösnings platser som sammanföll med områden av avvikande transkriptionsinitiering ( "Avvikande") och "paus" platser. Denna tydliga rumsliga separation av Pol II komplex indikerar att olika transkript uppstår från olika initiering komplex. De allra flesta Pol II tvärbunden abo UT 50 bp nedströms om TSS på "Paus" site, där det förväntas en paus efter påbörjad transkription. Pol II mest utarmat 20-60 bp uppströms om TSS där före inled komplex ( "PIC") former, vilket tyder på att det i genomsnitt troligen tillbringar mindre tid än vid pausade platser. Detta tyder på att i de flesta (men inte nödvändigtvis alla) fall, när Pol II rekryteras snabbt rensar den promotorn och antar en paus tillstånd ungefär 30-50 bp nedströms om TSS, i överensstämmelse med observationen att Pol II paus frisättning är ett hastighetsbegränsande steg i transkription. Dessa intilliggande initiering komplex är olöslig genom Chip-punkter (illustrerad av grå fyllning spår) eftersom dess upplösning är begränsad till några hundra baspar. Figur modifierad från Pugh och Venters 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 1 M HEPES-KOH (pH 7,5) | 50 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 28 | 140 mM |
| 0,5 M EDTA | 2 | 1 mM |
| 100% glycerol | 100 | 10% |
| 10% NP40 | 50 | 0,50% |
| 10% Triton X100 | 25 | 0,25% |
| DDH 2 O | Fyll till 1 L |
Tabell 1. Recept för Lysis Buffer 1. Filtrera med 0,22 um filter. Förvaras i 50 ml rör vid 4 ° C. Tillsätt 100 | il CPI lager till 50 ml av buffert just före användning.
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 1 M Tris-HCl (pH 8) | 10 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 40 | 200 mM |
| 0,5 M EDTA | 2 | 1 mM |
| 0,5 M EGTA | 1 | 0,5 mM |
| DDH2 O | Fyll till 1 L |
Tabell 2. Recept för Lysis Buffer 2. Filtrera med 0,22 um filter. Förvaras i 50 ml rör vid 4 ° C. Tillsätt 100 | il CPI lager till 50 ml av buffert just före användning.
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 1 M Tris-HCl (pH 8) | 10 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 20 | 100 mM |
| 0,5 M EDTA | 2 | 1 mM |
| 0,5 M EGTA | 1 | 0,5 mM |
| 10% deoxicholat | 10 | 0,10% |
| 5 g | 0,5% (vikt / volym) | |
| DDH 2 O | Fyll till 1 L |
Tabell 3. Recept för Lysis Buffer 3. Filtrera med 0,22 um filter. Förvaras i 50 ml rör vid 4 ° C. Tillsätt 100 | il CPI lager till 50 ml av buffert just före användning.
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 10x PBS | 50 | 1x |
| Bovint serumalbumin | 2,5 g | 0,50% |
| DDH 2 O | Fyll till 500 |
Tabell 4. Recept för blockering Buffert. Filtrera genom 0,22 um filter. Förvaras i 50 ml rör vid 4 ° C. Tillsätt 100 | il CPI lager till 50 ml av buffert just före användning.
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 1 M HEPES (pH 7,5) | 25 | 50 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8) | 1 | 1 mM |
| 10% natriumdeoxikolat | 35 | 0,70% |
| 10% NP40 | 50 | 1% |
| 1 M LiCl | 250 | 500 mM |
| DDH 2 O | Fyll till 500 |
Tabell 5. Recept för RIPA-buffert. Filtrera genom 0,22 um filter. Förvaras i 50 ml rör vid 4 ° C. Tillsätt 100 | il CPI lager till 50 ml av buffert just före användning.
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 1 M Tris-Cl (pH 7,5) | 2,5 | 50 mM |
| 0,5 M EDTA | 1 | 10 mM |
| 20% SDS | 2,5 | 1% |
| DDH 2 O | Fyll till 50 |
Tabell 6. Recept för ChIP elueringsbuffert. Filtrera genom 0,22 um filter. Förvara vid RT.
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 1 M Tris-Cl (pH 7,5) | 0,5 | 10 mM |
| DDH 2 O | Fyll till 50 |
Tabell 7. Recept för TE-buffert. Filtrera genom 0,22 um filter. Förvara vid 4 ° C.
| Volym (il) | [Slutlig] | |
| 100 pM ExA2-iX | 75 | 15 ^ M |
| 100 | iM ExA2-33 | 75 | 15 ^ M |
| 1 M Tris (pH 7,5) | 50 | 100 mM |
| 5 M NaCl | 5 | 50 mM |
| DDH 2 O | 295 | - |
| Total volym | 500 |
Tabell 8. P7 Adapter Annealing mix.
| Volym (il) | [Slutlig] | ||
| 100 | iM ExA1-58 | 75 | 15 ^ M | |
| 100 | iM ExA1-13 | 75 | 15 ^ M | |
| 1 M Tris (pH 7,5) | 50 | 100 mM | |
| 5 M NaCl | 5 | 50 mM | |
| DDH 2 O | 295 | - | |
| Total volym | 500 |
| Temp (C) | Tid |
| 95 | 5 min |
| 72 | 5 min |
| 65-60 ramp nedgång | 5 min |
| 55-50 ramp nedgång | 3 min |
| 45-40 ramp nedgång | 3 min |
| 30 | 3 min |
| 20 | 3 min |
| 10 | 3 min |
| 4 | För alltid |
Tabell 10. Adapter Glödgning Program.
| 1x (il) | [Slutlig] | |
| DDH 2 O | 39,8 | |
| 10x Reaction Buffer 2 | 5 | 1x |
| 100 pM ATP | 0,5 | 1 mM |
| 3 mM dNTP | 1,7 | 100 | iM |
| 3 U / | il T4-polymeras | 1 | 3 U |
| 5 U / ul Klenow | 1 | 5 U |
| 10 U / | il T4-polynukleotidkinas | 1 | 10 U |
| Total reaktionsvolym | 50 |
Tabell 11. Poler Master Mix.
| 1x (l) | [Slutlig] | |
| DDH 2 O | 42,3 | |
| 10x Reaction Buffer 2 | 5 | 1x |
| 3 mM dATP | 1,7 | 100 | iM |
| 5 U / pl Klenow 3'-5 'exo minus | 1 | 5 U |
| Total reaktionsvolym | 50 |
Tabell 12.-handel Master Mix.
| 1x (l) | [Slutlig] | |
| DDH 2 O | 41 | |
| 100 mM ATP | 0,5 | 1 mM |
| 10x Reaction Buffer 2 | 5 | 1x |
| 400 U / | il T4-DNA-Ligase | 1,5 | 600 U |
| Reaktionsblandning volym | 48 | |
| 15 mM index Adapter | 2 | 30 pikomol |
| Total reaktionsvolym | 50 |
Tabell 13. P7 Adapter Ligation Master Mix.
| 1x (l) | [Slutlig] | |
| DDH 2 O | 41 | |
| 10x Φ-29 buffert | 5 | 1x |
| 3 mM dNTP | 2,5 | 150 | iM |
| 10 U / ul Φ-29 polymeras | 1,5 | 15 U |
| Total reaktionsvolym | 50 |
Tabell 14. Φ-29 Nick Repair Master Mix.
| 1x (l) | [Slutlig] | |
| DDH 2 O | 43,5 | |
| 100 mM ATP | 0,5 | 1 mM |
| 10x Reaction Buffer 2 | 5 | 1x |
| 10 U / | il T4-polynukleotidkinas | 1 | 10 U |
| Total reaktionsvolym | 50 |
Tabell 15. Kinasreaktions Master Mix.
| 1x (&# 956; l) | [Slutlig] | |
| DDH 2 O | 43 | |
| 10x Lambda Buffert | 5 | 1x |
| 5 U / ul Lambda exonukleas | 2 | 10 U |
| Total reaktionsvolym | 50 |
Tabell 16. Lambda exonukleas Reaktion Master Mix.
| 1x (l) | [Slutlig] | |
| DDH 2 O | 44 | |
| 10x Reaction Buffer 2 | 5 | 1x |
| 30 U / ul RecJ f exonukleas | 1 | 30 U |
| Total reaktions volym | 50 |
Tabell 17. RecJ f Nuclease reaktions Master Mix.
| 1x (l) | [Slutlig] | |
| DDH 2 O | 6,45 | |
| 10x Φ-29 buffert | 2 | 1x |
| 3 mM dNTP | 1,3 | 200 | iM |
| 20 pM P7 Primer | 0,25 | 0,25 ^ M |
| Reaktionsblandning volym | 10 | |
| EtOH precipiterade provet | 10 | |
| Total reaktionsvolym | 20 |
Tabell 18. P7Primerförlängningsreaktion Master Mix.
| Temp (C) | Tid |
| 95 | 5 min |
| 65 | 5 min |
| 30 | 2 min |
| 30 | Håll tills Φ-29 tillsätts |
| 30 | 20 min |
| 65 | 10 min |
| 4 | För alltid |
Tabell 19. P7 Primer Extension program.
| 1x (l) | [Slutlig] | |
| DDH 2 O | 5 | |
| 3 | 1x | |
| 3 mM dATP | 1 | 0,1 mM |
| 5 U / pl Klenow 3 'till 5' exo minus | 1 | 5 U |
| Reaktionsblandning volym | 10 | |
| Primer förlängd prov | 20 | |
| Total reaktionsvolym | 30 |
Tabell 20. A-svans Master Mix.
| 1x (l) | [Slutlig] | |
| DDH 2 O | 11,5 | |
| 10x T4-ligasbuffert | 5 | 1x |
| 15 iM ExA1-58 /13 adapter | 2 | 30 pikomol |
| 400 U / | il T4-DNA-ligas | 1,5 | 600 U |
| Reaktionsblandning volym | 20 | |
| A-tailed prov | 30 | |
| Total reaktionsvolym | 50 |
Tabell 21. P5 Adapter Ligation Master Mix.
| 1x (l) | [Slutlig] | |
| 5x PCR-buffert | 10 | 1x (2 mM MgCl2) |
| 10 mM av varje dNTP | 1 | 200 ^ M vardera |
| 20 pM P1.3 Primer | 1,25 | 0,5 | iM |
| 20 pM P2.1 Primer | 1,25 | 0,5 | iM |
| 2 U / ul Hot start-polymeras | 0,5 | 1 U |
| Reaktionsblandning volym | 14 | |
| Bead eluerade provet | 36 | |
| Total reaktionsvolym | 50 |
Tabell 22. PCR.
| Temp (C) | Tid | cykler |
| 98 | 30 sek | 1 |
| 98 | 10 sek | 15-21 (beroende på chip effektivitet) |
| 52 | 30 sek | |
| 72 | 20 sek | 72 | 2 min | 1 |
| 4 | För alltid | Håll |
Tabell 23. PCR-program.
| Per DNA Standard (l) | Per prov (| il) | |
| 1: 200 utspädd buffert / färgblandning | 190 | 198 |
| DNA-standarder | 10 | |
| Chip-exo bibliotek | 2 | |
| Total volym | 200 | 200 |
Tabell 24. Kvantifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar en funktionell genomisk protokoll för att fastställa den exakta bindnings plats för kromatin interagerande proteiner i en opartisk, genomet hela sätt på nära baspar upplösning. Det mest kritiska steget för att uppnå nära baspar kartläggningsupplösning är den exonukleasbehandling av chip-anrikade DNA medan den immunfällningen kvar på det magnetiska hartset. Skenbart kan proteinkomplex potentiellt blockera in vivo fotavtryck av en viss subenhet (t.ex. kromatinremodellering komplex eller nukleosomen kärnpartikeln). Emellertid, som tidigare 10 rapporterats, eftersom formaldehyd är ett ineffektivt tvärbindare, blir det allt mer osannolikt att multipla subenheter av ett komplex skulle tvärbinda till DNA och varandra i samma cell vid samma lokus. Således, in vivo fotavtryck av individuella subenheter av ett proteinkomplex, såsom individuella histon subenheter av en nukleosomen är möjligt med Chip-exo.
t "> Den mest anmärkningsvärda fördelarna med Chip-exo är dess nära baspar upplösning och låg bakgrund. Den extremt hög upplösning medger detaljerade strukturella och rumsliga insikter som ska göras på en genomet hela skala som för närvarande inte är möjligt med någon annan metod . Å andra sidan, är den primära begränsningen av chip-exo att det är en tekniskt utmanande molekylärbiologi metod för att bemästra. Dessutom allmänna begränsningar av chip steg gäller även för chip-exo (t.ex. kommersiell antikropp tillgänglighet och specificitet , epitop tillgänglighet, och relativt stort antal celler som krävs). Vanliga fallgropar inkluderar dålig kvalitet sonikerade extrakt, med användning av en icke-chIP grade antikropp, och inte att hålla proverna på is så mycket som möjligt. Således måste sonication villkor vara noggrant optimerade och varje antikropp valideras som tidigare beskrivits 18 för att undvika de skadliga effekterna dessa parametrar kan ha på den experimentella resultat.Så långt somsekvense djup för en transkriptionsfaktor mål, strävar vi vanligtvis för omkring 20 miljoner unikt linje läser. Eftersom Pol II och histon ändringar bredare distribueras, strävar vi efter 30-50.000.000 läser. Det är viktigt att notera att eftersom Chip-exo har betydligt mindre bakgrund än Chip-punkter, färre läser krävs för att uppnå liknande sekvense djup.
Chipet-exo tekniken nu stor spridning trots dess tekniska utmaningar, robusta varianter av det ursprungliga protokollet fortsättningsvis att publiceras 17,19,20. I synnerhet, är en variation som kan vara användbar för svår CHIP proteiner som kallas Chip-nexus, som använder en enda ligation steg för att öka den effektivt av biblioteket preparatet 20. Sammanfattningsvis är Chip-exo en allt anställd och kraftfull metod för ultrahög upplösning kartläggning av kromatin interagerande proteiner på en global skala. Eftersom förteckningen över kommersiellt tillgängliga Chip-grade antibodies fortsätter att växa, kommer framtida tillämpningar av ChIP-exo metodik riktas mot kartläggning outforskad genreglerande nätverk för att förstå den molekylära kretsen i cellen i extremt hög upplösning. Dessutom kommer chip-exo sannolikt att ytterligare förfinas och anpassas till fotavtryck in vivo protein-RNA-interaktioner på nära baspar upplösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde, methanol free, 10 x 10 ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5 ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 26 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
- Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
- Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
- Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
- Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
- Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
- Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
- Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
- Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
- Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).
Tags
Biokemi Chip-exo Chip-punkter chip transkription genreglering kromatin epigenetik transkriptionsfaktorer molekylärbiologi View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
