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Biology

चिप EXO विधि: निकट आधार जोड़ी प्रेसिजन साथ प्रोटीन डीएनए सहभागिता की पहचान

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/55016
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Abstract

Chromatin immunoprecipitation (चिप) एपिजेनेटिक्स जीन और विनियमन कि विशिष्ट प्रोटीन डीएनए बातचीत को अलग कर के क्षेत्र में एक अनिवार्य उपकरण है। उच्च throughput अनुक्रमण (चिप seq) के लिए मिलकर चिप सामान्यतः प्रोटीन है कि क्रोमेटिन के साथ बातचीत के जीनोमिक स्थान निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, चिप seq कई सौ आधार जोड़े की अपेक्षाकृत कम मानचित्रण संकल्प और उच्च पृष्ठभूमि संकेत आड़े आती है। चिप EXO तरीका है कि काफी हद तक दोनों संकल्प और शोर पर सुधार चिप seq के एक परिष्कृत संस्करण है। चिप EXO कार्यप्रणाली के प्रमुख गौरव पुस्तकालय तैयारी कार्यप्रवाह को प्रभावी ढंग से बाईं पदचिह्न में लैम्ब्डा exonuclease पाचन के समावेश और सही 5 प्रोटीन डीएनए Crosslink साइट के 'डीएनए सीमाओं है। चिप EXO पुस्तकालयों तो उच्च throughput अनुक्रमण के अधीन हैं। परिणामी डेटा कार्यात्मक संगठन ओ में अद्वितीय और अल्ट्रा उच्च संकल्प अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए उपयोग किया जा सकताजीनोम च। यहाँ, हम चिप EXO तरीका है कि हम अनुकूलित और स्तनधारी प्रणालियों और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण-से-संश्लेषण मंच के लिए सुव्यवस्थित किया वर्णन है।

Introduction

Chromatin immunoprecipitation (चिप) चुनिंदा डीएनए टुकड़े कि जीवित कोशिकाओं में एक भी प्रोटीन के साथ बातचीत के लिए समृद्ध जीन विनियमन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। चिप समृद्ध डीएनए टुकड़े के तरीकों का पता लगाने के रूप में विकसित किया है प्रौद्योगिकी उच्च throughput अनुक्रमण (चिप seq) 1 के लिए oligonucleotide प्रोटीन (चिप चिप) पर संकरण के लिए एक एकल ठिकाना (मानक चिप qPCR) का पता लगाने से बेहतर बनाता है। हालांकि चिप seq बड़े पैमाने पर आवेदन, क्रोमेटिन विविधता और अविशिष्ट डीएनए बातचीत देखा गया है डेटा की गुणवत्ता झूठी सकारात्मक और imprecise मानचित्रण के लिए अग्रणी बाधा है। इन सीमाओं को नाकाम करने के लिए, डॉ फ्रैंक प्यूघ चिप EXO विधि 2 विकसित की है। चिप EXO की मुख्य विशेषता यह है कि यह exonuclease '3' के लिए एक 5 को शामिल किया गया है, प्रभावी ढंग प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी स्थानों footprinting है। नतीजतन, चिप EXO कार्यप्रणाली उच्च संकल्प, detectio का अधिक से अधिक गतिशील रेंज को प्राप्त होता हैएन, और कम पृष्ठभूमि शोर।

हालांकि चिप EXO अधिक तकनीकी रूप से चिप seq से गुरु को चुनौती दे रहा है, यह व्यापक रूप के रूप में अध्ययन विविध जैविक प्रणालियों का उपयोग कर 3-8 अद्वितीय अल्ट्रा उच्च संकल्प अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए लक्ष्य को अपनाया जा रहा है। दरअसल, चिप EXO सफलतापूर्वक बैक्टीरिया, खमीर, माउस, चूहा, और मानव सेल प्रणाली को लागू किया गया है। सिद्धांत के सबूत के रूप में, चिप EXO मूल रूप से खमीर प्रतिलेखन के एक मुट्ठी कारक 2 के लिए सटीक बाध्यकारी मूल भाव की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। तकनीक को भी प्रतिलेखन पूर्व दीक्षा परिसर के संगठन अध्ययन करने के लिए, और विभिन्न histones 9,10 के subnucleosomal संरचना समझने के लिए खमीर में इस्तेमाल किया गया था। हाल ही में, हम आसन्न TFIIB और पोल द्वितीय बाध्यकारी मानव प्रमोटरों पर घटनाओं को हल करने चिप EXO leveraged, और पता चला है कि बड़े पैमाने पर अलग-अलग प्रतिलेखन उठता से अलग दीक्षा परिसरों 11।

यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह अनुकूलित और हैस्तनधारी चिप EXO (चित्रा 1) के लिए treamlined। सबसे पहले, रहने वाले प्राथमिक या टिशू कल्चर कोशिकाओं को एक सहसंयोजक crosslink के माध्यम से विवो प्रोटीन डीएनए बातचीत में संरक्षित करने के लिए formaldehyde के साथ व्यवहार कर रहे हैं। कोशिकाओं lysed रहे हैं और क्रोमेटिन ~ 100 के लिए sheared - 500 आधार जोड़ी आकार के टुकड़े। चिप तो चुनिंदा ब्याज की प्रोटीन के लिए crosslinked डीएनए टुकड़े के लिए समृद्ध करती। इस बिंदु पर, चिप seq पुस्तकालयों आम तौर पर तैयार किया जाता है, जो स्वाभाविक कुछ सौ आधार जोड़े की औसत टुकड़ा आकार का पता लगाने के प्रस्ताव को सीमित करता है। हालांकि, चिप EXO छोड़ दिया और लैम्ब्डा exonuclease के साथ प्रोटीन डीएनए Crosslink साइट के अधिकार 5 'डीएनए सीमाओं trimming द्वारा इस सीमा पर काबू। अनुक्रमण पुस्तकालयों तो exonuclease पचा डीएनए से निर्माण कर रहे हैं, जैसा कि नीचे विस्तृत जानकारी दी। जिसके परिणामस्वरूप नेस्ट 5 'सीमाओं प्रोटीन डीएनए बातचीत (चित्रा 1, चरण 14) की एक में विवो पदचिह्न का प्रतिनिधित्व करते हैं, और उच्च throughput अनुक्रमण से पता चला रहे हैं। AltHough चिप EXO कार्यप्रणाली चिप seq से शामिल है, सबसे कदम के बीच संक्रमण सरल मनका धोने, जो नमूना नुकसान और प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करता है की आवश्यकता है। महत्वपूर्ण बात है, के बाद से चिप EXO चिप seq, किसी भी नमूने चिप seq के साथ सफल हुआ है कि यह भी चिप EXO के साथ सफल होना चाहिए का एक परिष्कृत संस्करण है।

चिप seq से एक मौलिक अलग डेटा संरचना में चिप EXO परिणामों के साथ प्रोटीन डीएनए बातचीत के vivo footprinting। आम चिप seq कॉलर्स सबसे सटीक शिखर कॉल प्राप्त करने के लिए चिप EXO डेटा को लागू किया जा सकता है, हम जैव सूचना विज्ञान उपकरण विशेष रूप से ध्यान में चिप EXO डेटा की अनोखी संरचना के साथ डिजाइन सलाह देते हैं। ये Genetrack, मणि, गदा, Peakzilla, और ExoProfiler 12-15 शामिल हैं।

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Protocol

नोट: डबल आसुत एच 2 ओ या आणविक ग्रेड बराबर सभी buffers और प्रतिक्रियाओं घोला जा सकता है के लिए सिफारिश की है।

0 दिवस: सामग्री तैयार करना और सेल हार्वेस्ट

1. बफर तैयारी

  1. 3 (टेबल्स - 1 - 3) Lysis बफ़र 1 को तैयार है और प्रत्येक बफर बस का उपयोग करने से पहले की 50 मिलीलीटर के लिए 100 μl पूरा protease अवरोध शेयर (सीपीआई) जोड़ें। एक 1 में गोली मिलीलीटर आणविक ग्रेड एच 2 ओ भंग द्वारा भाकपा स्टॉक तैयार
  2. चिप बफ़र (- 7 टेबल्स 4) तैयार करें। अवरुद्ध और RIPA buffers की 50 मिलीलीटर के लिए 100 μl भाकपा शेयर जोड़े। Tris और चिप क्षालन बफ़र्स के लिए भाकपा न जोड़ें।

2. एडाप्टर oligonucleotides की annealing

नोट: विशिष्ट oligonucleotide दृश्यों अतिरिक्त जानकारी अनुभाग में पाया जा सकता है।

  1. एडाप्टर एनीलिंग घोला जा सकता है (- 9 टेबल्स 8) तैयार करें। मिश्रण करने के भंवर और संक्षेप मेंनलियों सामग्री इकट्ठा करने के लिए स्पिन। अशेष 0.5 मिलीलीटर ट्यूबों में प्रत्येक मिश्रण के 100 μl।
  2. Thermocycler में कार्यक्रम (तालिका 10) चलाकर ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स संकरण।
    स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस पर ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स annealed।

3. formaldehyde के साथ विवो Chromatin Crosslinking में

नोट: एक ठेठ चिप प्रयोग के लिए, प्रारंभिक सामग्री लगभग 50 मिलियन कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए।

  1. ताजा 37% मेथनॉल मुक्त formaldehyde शेयर समाधान खारा बफर फॉस्फेट के लिए जोड़ें (पीबीएस) 1% (वी / वी), मिश्रण अच्छी तरह से, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए सेल संस्कृति धोया।
    नोट: उदाहरण के लिए, हम आम तौर पर कमरे के तापमान पीबीएस के 50 मिलीलीटर में कोशिकाओं को 1.4 से 37 मिलीलीटर% मेथनॉल-मुक्त formaldehyde जोड़ें। इसके अलावा, मीडिया में crosslinking formaldehyde से बचने के बाद से मीडिया में प्रोटीन formaldehyde के कुछ बुझाना होगा।
  2. 2.5 एम glycin जोड़कर प्रतिक्रिया crosslinking बुझाना125 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ई। अच्छी तरह से मिश्रण।
  3. बर्फ पर 50 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 XG पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन। छानना सतह पर तैरनेवाला।
  4. pipetting द्वारा सेल गोली और resuspend करने के लिए 1 मिलीलीटर ठंडा 1x पीबीएस जोड़ें। 1.5 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरण।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 XG पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
  6. इसके तत्काल बाद तरल नाइट्रोजन के साथ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सेल छर्रों फ्रीज फ्लैश। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। Crosslinked कोशिकाओं -80 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए स्थिर रहे हैं।

दिन 1: सेल, sonication, और चिप

4. सेल

नोट: सभी सेल वर्गों के दौरान नमूने Crosslink उलट कम करने के लिए बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए।

  1. संक्षेप में Crosslinked सेल गोली पिघलना। अच्छी तरह से 0.5 मिलीलीटर lysis बफर 1 में प्रत्येक गोली resuspend और एक 15 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब में 4.5 मिलीलीटर lysis बफर 1 के साथ गठबंधन।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए रॉक नलियोंएक कमाल मंच पर लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 XG पर 4 मिनट के लिए स्पिन। छानना सतह पर तैरनेवाला।
  3. अच्छी तरह से 0.5 मिलीलीटर lysis बफर 2 में प्रत्येक गोली resuspend और 4.5 मिलीलीटर lysis बफर 2 एक बार resuspended जोड़ें।
  4. एक कमाल मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए रॉक। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 XG पर 5 मिनट के लिए स्पिन। सतह पर तैरनेवाला छानना और धीरे कागज तौलिया पर अतिरिक्त नल।
  5. अच्छी तरह से 0.5 मिलीलीटर lysis बफर 3 में प्रत्येक गोली resuspend और 1 मिलीलीटर lysis बफर 3 एक बार resuspended जोड़ें। बर्फ पर परमाणु lysates रखें और तुरंत sonication के लिए आगे बढ़ें।

5. परमाणु lysates के sonication

नोट: सभी वर्गों sonication के दौरान नमूने Crosslink उलट कम करने के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए। नीचे प्रोटोकॉल के सहयोग से इस्तेमाल किया sonicator के विशिष्ट मॉडल सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है। विशिष्ट sonicator उपयोग और अन्य उपकरणों के लिए दिशा-निर्देशों पर विवरण अतिरिक्त जानकारी अनुभाग में पाया जा सकता है।

  1. Pl15 मिलीलीटर polystyrene परमाणु अर्क युक्त ट्यूबों में इक्का गूंज एडेप्टर (धातु पट्टी ट्यूब की दीवार स्पर्श नहीं करना चाहिए)।
  2. पर / 30 सेकंड से 30 सेकंड मध्यम शक्ति के साथ 2 एक्स 15 मिनट के सत्र के लिए एक बर्फ के ठंडे पानी के स्नान में Sonicate परमाणु lysates। एक बार में केवल दो 15 मिलीलीटर ट्यूबों sonicate। ये सेटिंग्स सेल लाइनों और प्राथमिक सेल प्रकार की एक विस्तृत रेंज पर काम करते हैं, लेकिन अगर chromatin कर्तन अधूरा है आगे अनुकूलन की जरूरत हो सकती है।
  3. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में lysate से sonication के परिणाम, हस्तांतरण 2 एक्स 10 μl नमूनों की जांच करने के लिए।
    1. crosslinks उलटने के लिए, 10 μl ते RNase एक और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर proteinase लालकृष्ण सेते के 0.2 μl के साथ पहली बार 10 μl विभाज्य गठबंधन। 4 μl 6x xylene डीएनए डाई जोड़ें।
    2. crosslinks की रक्षा करने के लिए, 2 μl 6x xylene डीएनए डाई के साथ दूसरे नंबर पर 10 μl विभाज्य गठबंधन।
    3. लगभग 30 के लिए 140 वी पर एक 1.5% agarose जेल पर दोनों नमूने को चलाने - 45 मिनट सीढ़ी में bromophenol डाई जब तक मैंजेल नीचे रास्ते के एस ¾।
  4. अगर sonication सफल (सबसे डीएनए से 100 sheared टुकड़े - 500 बीपी) था, स्थानांतरण 10% ट्राइटन X-100 के 150 μl युक्त 2 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए sonicated lysates। भंवर मिश्रण करने के लिए।
  5. अघुलनशील क्रोमेटिन और मलबे गोली, स्पिन परमाणु lysate 10 मिनट के लिए 20,000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर sonicated।
  6. एक नया 2 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। अनिश्चित काल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर चिप या दुकान के नमूने के लिए तुरंत आगे बढ़ें। Sonicated अर्क जम नहीं किया जाना चाहिए और एक बार से अधिक thawed।

6. युग्मन एंटीबॉडी मोती

नोट: कभी भंवर या फ्रीज / चुंबकीय मोती पिघलना के बाद से वे टूट और पृष्ठभूमि संकेत वृद्धि होगी।

  1. अच्छी तरह से 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मनका घोल μl शेयर, विभाज्य Y मिश्रण के बाद जहां वाई = 1.1 x 2.5 μl एक्स (चिप नमूनों की संख्या)। 2.5 μl मनका घोल के लिए क्षमता बंधन 13 माइक्रोग्राम आईजीजी पर निर्भर है। धो जमा मोती 1 मिलीलीटर रोकने के साथ 3xबफर।
  2. washes के बाद मोतियों की अधिक सुसंगत aliquotting के लिए, बफर अवरुद्ध साथ 10x मूल घोल की मात्रा (25 μl / चिप) में resuspend मोती। अशेष 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में चिप नमूना प्रति 25 μl।
  3. एंटीबॉडी के 10 माइक्रोग्राम इसी resuspend मोतियों की विभाज्य - 5 जोड़े। अंतिम मात्रा बफर अवरुद्ध साथ 250 μl अप करने के लिए ले आओ। 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए नमूने सेते (वैकल्पिक रूप से, 16 घंटे के लिए रातोंरात) एक घूर्णन मंच पर।
  4. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला। अपार या अतिरिक्त एंटीबॉडी को निकालने के लिए बफर अवरुद्ध 1 मिलीलीटर के साथ एक बार मोती धो लें।
  5. मनका conjugates: पिछले धोने श्वास के बाद, तुरंत एंटीबॉडी के लिए sonicated अर्क (~ 1.6 एमएल) के 50 लाख सेल समकक्ष जोड़ें। sonicated अर्क तैयार नहीं हैं, तो बफर अवरुद्ध 100 μl में resuspend मोती, जब तक वे तैयार हैं। यह बताने के मोती सूखी कभी नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है।

7. chromatin immunoprecipitation (चिप)

  1. प्रत्येक चिप नमूना के लिए, sonicate के 1.5 मिलीलीटर गठबंधनएंटीबॉडी के साथ डी अर्क: 1.5 मिलीलीटर या 2 मिलीलीटर ट्यूब में मनका conjugates।
  2. नलियों 4 सेल्सियस पर 9 की गति सेटिंग में रात भर (लगभग 16 घंटा) एक मिनी-ट्यूब रोटेटर पर सेते हैं। कुछ मिनट बाद जांच सुनिश्चित करने के लिए नमूने लीक नहीं कर रहे हैं और ठीक से मिश्रण कर रहे हैं।

दिन 2: चिप Washes और पर-राल एंजाइमी प्रतिक्रियाओं

8. चिप Washes

नोट: पार संक्रमण को कम करने, संक्षेप में प्रत्येक धोने के बीच नलियों स्पिन करने के लिए। पहले आकांक्षा के लिए, प्रत्येक नमूने के बीच सुझावों के बदल जाते हैं। बाद में washes के दौरान, एक ही टिप के रूप में लंबे समय से यह मोती छुआ तक नहीं था के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। उचित चिप धोने पर दिशाओं के लिए अतिरिक्त जानकारी खंड देखें।

  1. बहुत संक्षेप में एक microcentrifuge का उपयोग कर नलियों स्पिन (~ 500 XG पर 3 सेकंड) टोपियां में तरल इकट्ठा करने और 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर जगह है। अभी भी चुंबकीय रैक, महाप्राण निकालने पर है।
  2. प्रत्येक ट्यूब 0.75 मिलीलीटर RIPA बफर जोड़ें। चुंबकीय रैक से ट्यूबों निकालेंऔर कई बार पलटना मिश्रण करने के लिए। चुंबकीय रैक और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला पर ट्यूबों बदलें। 7x दोहराएँ।
  3. 0.75 मिलीग्राम 10 मिमी Tris एचसीएल (7.5 पीएच) प्रत्येक ट्यूब में जोड़े। चुंबकीय रैक से ट्यूबों निकालें और मिश्रण करने के लिए कई बार पलटना। चुंबकीय रैक और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला पर ट्यूबों बदलें। 2x दोहराएँ।
  4. पिछले धोने श्वास के बाद, चमकाने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: 1 मिनट और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला के लिए वर्गों 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3 में प्रत्येक ऊष्मायन प्रतिक्रिया है, और 15.3, स्पिन नलियों संक्षेप में और जगह चुंबकीय रैक के खिलाफ करने के बाद। 0.75 मिलीलीटर RIPA बफर और 2x 0.75 मिलीलीटर Tris एचसीएल (पीएच 7.5) के साथ साथ धो 2x।

9. चमकाने रिएक्शन

  1. मास्टर मिश्रण गणना (तालिका 11) चमकाने भरें। बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मिश्रण चमकाने बनाओ। Pipet मिश्रण करने के लिए।
  2. इसके तत्काल बाद पिछले चिप धोने aspirated है, प्रत्येक नमूने राल के लिए मिश्रण चमकाने चुंबकीय रैक पर अभी भी समय के 50 μl जोड़ें। 3 XG पर 30 मिनट के लिए नमूने सेतेएक thermomixer में 30 सेल्सियस पर।
  3. पिछले धोने की धारा 8.4 के बाद नोट में वर्णित के रूप में श्वास के बाद, ए-पीछा करने के लिए आगे बढ़ें।

10. एक-पीछा रिएक्शन

  1. एक-पीछा मास्टर मिश्रण गणना (तालिका 12) को भरें। बर्फ पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक-पीछा मिश्रण बनाओ। Pipet मिश्रण करने के लिए।
  2. इसके तत्काल बाद खंड चमकाने के बाद, चुंबकीय रैक पर है जबकि अभी भी एक नमूना राल के लिए एक-पीछा मिश्रण के 50 μl जोड़ें। नमूने एक thermomixer में 37 सेल्सियस पर 3 XG पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. पिछले धोने की धारा 8.4 के बाद नोट में वर्णित के रूप में श्वास के बाद, P7 एडाप्टर Ligation करने के लिए आगे बढ़ें।

11. P7 एडाप्टर बंधाव प्रतिक्रिया

  1. Ligation मास्टर मिश्रण गणना (तालिका 13) को भरें। Ligation बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मिश्रण बनाओ। पिपेट मिश्रण करने के लिए।
  2. इसके तत्काल बाद एक-पीछा खंड, 48 μl P7 Ligation मास्टर मिश्रण और एक अलग एडाप्टर सूचकांक टी के 2 μl जोड़नेओ प्रत्येक नमूना राल, जबकि अभी भी चुंबकीय रैक पर। नमूने एक thermomixer में 25 सी में 3 XG पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
    नोट: प्रत्येक नमूना के लिए अलग अनुक्रमित का उपयोग अधिक नमूने एक प्रवाह सेल में अनुक्रम किया जा करने की अनुमति देगा।
  3. पिछले धोने की धारा 8.4 के बाद नोट में वर्णित के रूप में श्वास के बाद, Φ -29 निक मरम्मत करने के लिए आगे बढ़ें।

12. फी-29 निक मरम्मत रिएक्शन

  1. Φ -29 मास्टर मिश्रण गणना (तालिका 14) को भरें। बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में Φ -29 मिश्रण बनाओ। Pipet मिश्रण करने के लिए।
  2. इसके तत्काल बाद P7 Ligation अनुभाग के बाद, जबकि अभी भी चुंबकीय रैक पर प्रत्येक नमूना राल को Φ -29 मिश्रण के 50 μl जोड़ें। नमूने एक thermomixer में 30 सेल्सियस पर 3 XG पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. पिछले धोने की धारा 8.4 के बाद नोट में वर्णित के रूप में श्वास के बाद, Kinase प्रतिक्रिया करने के लिए आगे बढ़ें।

13. Kinase रिएक्शन

  1. Kinase मास्टर मिश्रण गणना को भरें (
  2. इसके तत्काल बाद Φ-29 अनुभाग, kinase के 50 μl प्रत्येक नमूना राल के लिए मिश्रण है, जबकि अभी भी चुंबकीय रैक पर जोड़ें। नमूने एक thermomixer में 37 सेल्सियस पर 3 XG पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. पिछले धोने की धारा 8.4 के बाद नोट में वर्णित के रूप में श्वास के बाद, लैम्ब्डा exonuclease प्रतिक्रिया करने के लिए आगे बढ़ें।

14. लैम्ब्डा exonuclease रिएक्शन

  1. लैम्ब्डा exonuclease मास्टर मिश्रण गणना (तालिका 16) को भरें। लैम्ब्डा exonuclease बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मिश्रण बनाओ। Pipet मिश्रण करने के लिए।
  2. इसके तत्काल बाद Kinase अनुभाग के बाद, लैम्ब्डा exonuclease के 50 μl प्रत्येक नमूना राल के लिए मिश्रण है, जबकि अभी भी चुंबकीय रैक पर जोड़ें। नमूने एक thermomixer में 37 सेल्सियस पर 3 XG पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. पिछले धोने की धारा 8.4 के बाद नोट में वर्णित के रूप में श्वास के बाद, RecJ च प्रतिक्रिया करने के लिए आगे बढ़ें।

15. RecJ चnuclease रिएक्शन

  1. RecJ च मास्टर मिश्रण गणना (तालिका 17) को भरें। बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में RecJ च मिश्रण बनाओ। Pipet मिश्रण करने के लिए।
  2. इसके तत्काल बाद लैम्ब्डा exonuclease अनुभाग के बाद, जबकि अभी भी चुंबकीय रैक पर प्रत्येक नमूना राल को RecJ च मिश्रण के 50 μl जोड़ें। नमूने एक thermomixer में 37 सेल्सियस पर 3 XG पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. पिछले धोने की धारा 8.4 के बाद नोट में वर्णित के रूप में श्वास के बाद, चिप क्षालन करने के लिए आगे बढ़ें।

16. क्षालन और Crosslink उलटा

  1. मास्टर मिश्रण तैयार: नमूनों की संख्या x 1.1 x 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में (200 μl चिप Elution बफर + 1 μl 20 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर)। प्रत्येक नमूना राल के लिए 200 μl चिप क्षालन बफर proteinase कश्मीर मास्टर मिश्रण जोड़ें।
  2. नमूने रातोंरात (लगभग 16 घंटा) 3 XG पर 65 सेल्सियस पर एक thermomixer में एक गर्म ढक्कन के साथ संक्षेपण को रोकने के लिए सेते हैं।

दिन 3: डीएनए निकालनेआयन और एडाप्टर Ligation

17. क्षालन और Crosslink उलटा (जारी)

  1. 65 सी में रात भर ऊष्मायन के बाद, संक्षेप में घनीभूत इकट्ठा करने के लिए नमूने स्पिन। 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर प्लेस के नमूने।
  2. सतह पर तैरनेवाला μl स्थानांतरण 200 200 μl ते बफर (7.5 पीएच) युक्त नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब।

18. Phenol क्लोरोफॉर्म isoamyl शराब (PCIAA) निष्कर्षण

  1. प्रत्येक नमूने के isoamyl शराब 400 μl फिनोल क्लोरोफॉर्म जोड़ें। भंवर 20 सेकंड के लिए मिश्रण करने के लिए।
  2. (आरटी) कमरे के तापमान पर 20,000 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। ध्यान से एक ताजा ट्यूब ऊपरी जलीय परत के 325 μl हस्तांतरण।
    नोट: नया ट्यूब में जैविक (निचली परत) के किसी भी हस्तांतरण करने के लिए नहीं ख्याल रखना।
  3. 3 एम NaOAc (पीएच 5.5) और 1 μl 20 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइकोजन के 1/10 मात्रा प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ें। कई नमूने लिए, एक मास्टर मिश्रण तैयार करते हैं।
  4. बर्फ के ठंडे 100% इथेनॉल के 3 संस्करणों प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ें। भंवरमिलना। -80 सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. 4 सेल्सियस पर 20,000 XG पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला छानना, गोली परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित कर रही है।
  6. धीरे, 500 μl हौसले से बर्फ के ठंडे 70% इथेनॉल बनाया जोड़ने गोली परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित कर रही है। 4 सेल्सियस पर 20,000 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला छानना।
  7. 45 सेल्सियस पर एक गति शून्य में लगभग 20 मिनट (या सूखी तक) के लिए सूखी गोली।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में एक ठहराव बिंदु है। सूखी डीएनए छर्रों -20 सी में संग्रहित किया जा सकता है।
  8. बार बार ऐसा क्षेत्र है जहां डीएनए pelleted, भले ही सूखे गोली नहीं देखा जा सकता पर 10 μl DDH 2 ओ Pipet में Resuspend छर्रों।
  9. एक ताजा 0.3 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब या 8 रैक करने के लिए प्रत्येक नमूना के 10 μl स्थानांतरण नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है।

19. P7 प्राइमर एक्सटेंशन रिएक्शन

  1. P7 प्राइमर एक्सटेंशन मास्टर मिश्रण गणना को भरें (तालिका 18)। एक्सटेंशन बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मिश्रण बनाओ। Pipet मिश्रण करने के लिए।
  2. प्रत्येक 10 μl नमूना करने के लिए एक्सटेंशन मिश्रण के 10 μl (शून्य Φ -29 पोलीमर्स) जोड़ें। Pipet मिश्रण करने के लिए।
  3. Thermocycler में चलाने के नमूने 30 सी जब तक टेम्पलेट के लिए पानी रखना प्राइमर के लिए कार्यक्रम (तालिका 19) का उपयोग कदम "पकड़"।
  4. 30 ग के दौरान 1 μl Φ -29 पोलीमर्स जोड़े कार्यक्रम में कदम "पकड़"। Pipet मिश्रण करने के लिए। कार्यक्रम (तालिका 19) के शेष फिर से शुरू।

20. एक-पीछा रिएक्शन

  1. एक-पीछा मास्टर मिश्रण गणना (तालिका 20) को भरें। बर्फ पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक-पीछा मिश्रण बनाओ। Pipet मिश्रण करने के लिए।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए एक-पीछा मिश्रण के 10 μl जोड़ें। Pipet मिश्रण करने के लिए।
  3. Thermocycler में 37 सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूने सेते हैं, और उसके बाद 75 सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए निष्क्रिय गर्मी।

21. पी -5 एडाप्टर बंधाव प्रतिक्रिया

  1. Filपी -5 एडाप्टर Ligation मास्टर मिश्रण गणना एल बाहर (तालिका 21)। Ligation बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मिश्रण बनाओ। Pipet मिश्रण करने के लिए।
  2. पी -5 Ligation के 20 μl प्रत्येक नमूने के मिश्रण जोड़ें। Pipet मिश्रण करने के लिए।
  3. Thermocycler में, 25 सी में 2 घंटे के लिए नमूने सेते हैं।

22. मनका क्लीन अप

नोट: कृपया निर्माता जानकारी के लिए सामग्री अनुभाग देखें मनका पर साफ।

  1. एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए प्रत्येक 50 μl नमूना हस्तांतरण।
  2. Resuspend आरटी पर 15 मिनट के लिए 15 की गति सेटिंग में एक मिनी-ट्यूब रोटेटर पर मोती साफ। मोती pipetting से पहले व्यवस्थित मत देना।
  3. 60 μl साफ मोती नमूने को जोड़ें (1.2: 1 के अनुपात में नमूने के लिए मोती को साफ डीएनए में कम से कम 200 आधार जोड़े है कि दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है)। Pipet 20 सेकंड के लिए मिश्रण करने के लिए।
  4. Resuspend आरटी पर 3 मिनट के लिए 15 की गति सेटिंग में एक मिनी-ट्यूब रोटेटर पर मोती साफ। संक्षेप में नलियों स्पिन।
  5. 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर ट्यूबों रखें।बंद pipet और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    नोट: इस खंड में वैक्यूम आकांक्षा का उपयोग नहीं है क्योंकि यह साफ हुआ मोती चूसना जाएगा।
  6. प्रत्येक नमूने के लिए ताजा बना RT 70% इथेनॉल के 400 μl जोड़ें जबकि वे चुंबकीय रैक पर हैं। मिलाओ मत। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला। 2x दोहराएँ।
  7. आरटी पर 10 मिनट के लिए साफ-अप मोती सूखी। मोती के रंग हल्के भूरे रंग के और बहुत ही छोटी सी दरार को अंधेरे बारी जब मोती सूख रहे हैं राल गोली में दिखाई देंगे।
  8. डीएनए elute करने के लिए, 40 μl 10mM Tris (7.5 पीएच) जोड़ें। अच्छी तरह से 20 सेकंड के लिए मिश्रण करने के लिए pipet।
  9. 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर नमूने रखें। धीरे-धीरे pipet और 0.3 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों के लिए 36 μl eluate सीधे हस्तांतरण।
  10. -20 सेल्सियस पर पीसीआर प्रतिक्रिया या दुकान eluates करने के लिए सीधे आगे बढ़ना।

4 दिन: पीसीआर और जेल विश्लेषण

23. पीसीआर

  1. पीसीआर मास्टर मिश्रण गणना (तालिका 22) को भरें। पीसीआर मिश्रण बनाओ। Pipet बहुत धीरे से बचने के लिए मिश्रण करने के लिएबुलबुले।
  2. पीसीआर के 14 μl प्रत्येक 36 μl डीएनए नमूने के लिए मिश्रण जोड़ें। Pipet मिश्रण करने के लिए। Thermocycler में डाल करने के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर नमूने रखें।
  3. सकारात्मक पीसीआर नियंत्रण के लिए, एक पहले से तैयार पुस्तकालय में शामिल हैं। नकारात्मक पीसीआर नियंत्रण के लिए, पानी शामिल हैं। Thermocycler में चलाने के नमूने पीसीआर कार्यक्रम (तालिका 23) का उपयोग कर।

24. जेल तैयार करना, डीएनए छांटना, और दृश्य

  1. अच्छी तरह से साफ और विआयनीकृत पानी के साथ एक उचित आकार जेल बॉक्स कुल्ला। एक 1.5% agarose जेल तैयार मोटी, चौड़े अच्छी तरह कंघी है कि 60 μl पकड़ कर सकते हैं के साथ (युक्त 0.5 मिलीग्राम / एमएल ethidium ब्रोमाइड)।
    नोट: ethidium ब्रोमाइड (EtBr) एक कैसरजन और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
  2. संक्षेपण इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में पीसीआर नमूना ट्यूबों स्पिन।
  3. 6x xylene डीएनए डाई की 1/5 मात्रा संयुक्त नमूना करने के लिए जोड़ें। क्योंकि यह नमूना डीएनए के रूप में एक ही स्थान पर migrates डीएनए डाई में bromophenol नीले रंग का प्रयोग न करें।
  4. लोड पूरे नमूना intओ हर अच्छी तरह से, नमूने के बीच में खाली कुओं के साथ बेहतर।
    नोट: एक ही अनुक्रमित के साथ पुस्तकालय नहीं एक ही जेल में चलाया जाना चाहिए।
  5. लोड 7 μl नमूने के दोनों तरफ 100 बीपी सीढ़ी। लगभग 30-45 मिनट के लिए 140 वी पर जेल चला जब तक सीढ़ी में bromophenol डाई जेल नीचे ¾ तरीका है।
  6. छवि और एक कम यूवी सेटिंग में एक transilluminator पर जेल कल्पना। 500 बीपी - युक्त डीएनए टुकड़े 200 agarose के वर्गों आबकारी। एडाप्टर डिमर बैंड है कि 125 बीपी पर चलाता बाहर काटने से बचने के लिए बहुत सावधान रहना होगा।
  7. प्रत्येक excised जेल टुकड़ा एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। प्रत्येक जेल टुकड़ा के रिकार्ड शुद्ध वजन। ट्यूब पर सीधे इस वजन लिखें।
  8. छवि, बचाने के लिए, और excised जेल व्याख्या पुष्टि करने के लिए सही आकार रेंज का चयन किया।

25 जेल शुद्धि

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार excised जेल टुकड़ा से डीएनए शुद्ध, निम्नलिखित संशोधनों के साथ।
  2. कमाल ने जेल टुकड़ा भंगमंच कमाल पर आरटी पर। इसे भंग करने के लिए लगभग 20 मिनट का समय लगेगा।
  3. अत्यधिक शुद्ध डीएनए प्राप्त करने के लिए, 0.5 मिलीग्राम बफर QG के बाद भंग कर जेल कॉलम के माध्यम से पारित कर दिया गया है के साथ कॉलम धो लें।
  4. 5 मिनट - बफर पीई धोने के बाद, कॉलम 2 के लिए आरटी पर बैठते हैं। आरटी पर 13,000 XG पर 1 मिनट के लिए स्पिन।
  5. एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पीसीआर प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण, 40 μl ईबी बफर के साथ Elute नमूने के लिए कमरे की अनुमति।

26. डीएनए मात्रा

  1. निर्माता के निर्देशों (तालिका 24) के अनुसार नमूने तैयार करें। ऑप्टिकल ट्यूबों के साथ निर्दिष्ट साधन में उपाय के नमूने हैं।
  2. एक बार जब चिप EXO पुस्तकालयों मात्रा निर्धारित कर रहे हैं, अनुक्रमण-से-संश्लेषण रसायन शास्त्र 16 कि इस प्रोटोकॉल में डीएनए एडाप्टर के साथ संगत है का उपयोग करता है एक मंच पर अनुक्रमण के लिए सबमिट करें।
    नोट: आमतौर पर, नमूना के 2 μl मात्रा का ठहराव के लिए पर्याप्त है, लेकिन और अधिक आवश्यक हो सकता है अगर नमूना एकाग्रता कम है। डीएनए ठेठ पैदावार50 और 200 एनजी के बीच Ly सीमा होती है।
  3. मात्रा का ठहराव के बाद, -20 सेल्सियस पर स्टोर नमूने हैं।

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Representative Results

निम्नलिखित आंकड़े चिप EXO यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल से प्रतिनिधि परिणाम दर्शाते हैं। कुछ enzymatic कदम के साथ परंपरागत चिप seq के तरीके के विपरीत, चिप EXO ग्यारह क्रमिक रूप से निर्भर एंजाइमी प्रतिक्रियाओं (चित्रा 1) की आवश्यकता है। इस प्रकार, देखभाल हर कदम पर लिया जाना चाहिए कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया घटक अपने संबंधित प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण में जोड़ा जाता है। हम एक फार्मूलाबद्ध प्रतिक्रिया टेबल्स पर आधारित स्प्रेडशीट पैदा करने की सिफारिश स्वचालित रूप से प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण गणना प्रदर्शन करने के लिए, मुद्रण, जिसके परिणामस्वरूप टेबल, और फिर प्रत्येक आइटम के लिए रवाना की जाँच के बाद यह मास्टर मिश्रण में जोड़ा जाता है।

हम प्रोटोकॉल भर में गुणवत्ता नियंत्रण उपायों के एक नंबर को रोजगार उच्च गुणवत्ता अनुक्रमण परिणाम (चित्रा 2) सुनिश्चित करने के लिए। प्रत्येक चिप प्रतिक्रिया तीन बुनियादी घटक शामिल हैं: 1) हितों की कोशिकाओं से sonicated क्रोमेटिन निकालनेअनुसूचित जनजाति, 2) एक एंटीबॉडी ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित है, और 3) ProteinG (या ProteinA) राल उपजी प्रतिरक्षा परिसरों स्थिर करने के लिए। उच्च गुणवत्ता sonicated क्रोमेटिन अर्क (2A चित्रा) प्राप्त करने के लिए काफी चुनौतीपूर्ण हो सकता है sonication की स्थिति प्रत्येक कोशिका प्रकार और sonication साधन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए के बाद से। 500 बीपी (चित्रा 2A, "+" लेन) - यह इस कदम का अनुकूलन करने के लिए समय खर्च करने लायक है, क्योंकि उच्चतम गुणवत्ता पुस्तकालयों एक sonication नतीजा यह है कि 100 के बीच डीएनए टुकड़े पैदावार के साथ शुरू होता है। सत्यापित करने के लिए कि sonicated अर्क स्पष्ट के सुपर बदलाव के रूप में बरकरार प्रोटीन डीएनए crosslinks, होते हैं - चूंकि formaldehyde crosslinks अस्थिर कर रहे हैं और formaldehyde अपने आप में एक सीमित शैल्फ जीवन है, हम एक electrophoretic गतिशीलता पारी परख (लेन "" चित्रा 2A,) का उपयोग करें डीएनए टुकड़े। पृष्ठभूमि संकेत का आकलन करने के लिए हम नियमित रूप से एक "नकली" चिप है कि चिप प्रतिक्रिया से एंटीबॉडी छोड़ देता प्रदर्शन करते हैं। एक उच्च गुणवत्ता चिप पूर्वविशिष्ट चिप एंटीबॉडी के सापेक्ष, इस मामले में पोल ​​द्वितीय के खिलाफ निर्देशित - ओ पुस्तकालय तैयारी बहुत कम है, यदि कोई हो, "नकली" चिप में पृष्ठभूमि संकेत ( "") होगा। जैसा कि चित्र 2 बी में देखा, परंपरागत चिप seq पुस्तकालयों चिप EXO की तुलना में काफी अधिक पृष्ठभूमि संकेत है। अन्त में, अनुक्रमण, चिप EXO पुस्तकालय गुणवत्ता से पहले bioanalyzer (- डी चित्रा -2) पर मूल्यांकन किया है। विश्लेषण सही पुस्तकालय आकार के वितरण के उपाय और दूषित एडाप्टर dimers (तीर से चिह्नित) है कि 125 बीपी पर चलाने का पता लगाता है। एडाप्टर dimers मौजूद हैं, वे अनुक्रमण बैंडविड्थ कम हो जाएगा। इसलिए, हम एक अतिरिक्त मनका सफाई कुशलता से निकाल देंगे कि डीएनए टुकड़े कम से कम 200 बीपी सलाह देते हैं।

चिप EXO, क्योंकि यह स्थानिक अलग-अलग हल की शुरुआत का एकमात्र तरीका सक्षम है एक शक्तिशाली कार्यात्मक जीनोमिक तकनीक है रुका हुआ है, और शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय ओ elongatingna जीनोम व्यापक पैमाने (चित्रा 3) 11। चूंकि इन आसन्न बाध्यकारी घटनाओं के अलावा आधार जोड़े के दसियों हैं, चिप seq कई सौ आधार जोड़े की शक्ति को हल करने के साथ इन घटनाओं बाध्यकारी भेद करने में असमर्थ है।

आकृति 1
चित्रा 1: चिप exo योजनाबद्ध। चिप के बाद, P7 एडाप्टर sonication सीमाओं को ligated है। लैम्ब्डा exonuclease तो Crosslink बात करने के लिए डीएनए 5 '3' के लिए trims, जिससे प्रोटीन डीएनए बातचीत footprinting। क्षालन और Crosslink पलटने के बाद, प्राइमर विस्तार द्वैध डीएनए synthesizes। अन्त में, पी -5 एडाप्टर के बंधाव छोड़ दिया और सही exonuclease सीमाओं के निशान और जिसके परिणामस्वरूप पुस्तकालय उच्च throughput अनुक्रमण के अधीन है। संदर्भ जीनोम अनुक्रम टैग की 5 'समाप्त होता है मैपिंग exonuclease बाधा है और इस तरह प्रोटीन डीएनए की सटीक साइट demarcatescrosslinking। चित्रा री और प्यूघ 17 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: चिप EXO गुणवत्ता नियंत्रण। पैनलों एसी असंबंधित प्रयोगों से प्रतिनिधि के परिणाम बताते हैं। (ए) sonicated क्रोमेटिन निकालने की गुणवत्ता (मानव HCC1806 स्तन कैंसर कोशिका लाइन से) के साथ (+) और बिना निष्कर्षों पर agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा मूल्यांकन किया है (-) crosslinks उलट। बरकरार crosslinks धीमी विस्थापित करने के लिए प्रोटीन डीएनए परिसरों का कारण होगा। इस प्रकार, उलट crosslinks के बिना चल निकालने (-) formaldehyde crosslinks मूल्यांकन किया जाना है, जो एक सफल चिप के लिए महत्वपूर्ण हैं की गुणवत्ता के लिए अनुमति देता है। (बी) के एक नकली आईपी की तुलना (-) एकएन डी पोल द्वितीय (+) चिप EXO और चिप seq पीसीआर प्रवर्धन के 21 चक्रों के बाद पुस्तकालय की तैयारी। पीसीआर के बाद, डीएनए टुकड़े 200-500 बीपी excised हैं (लाल हैश बॉक्स द्वारा चिह्नित) और एक जेल निकासी किट का उपयोग कर शुद्ध। (सीडी) पैनल सी में, शीर्ष ट्रेस एक जमा पुस्तकालय (P1) से एक आदर्श का पता लगाने का प्रतिनिधित्व करता है, और नीचे का पता लगाने के एक जमा पुस्तकालय (P2) कि एडाप्टर dimers शामिल पता चलता है। पैनल डी डीएनए घनत्व साजिश पैनल सी से P1-2 पुस्तकालय निशान (तीर अर्थ एडाप्टर डिमर बैंड) को इसी से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: चिप EXO Spatially अलग द्विदिश ट्रांसक्रिप्शन दीक्षा परिसर समाधान करता है। (ए) कतरा-separat की Smoothed वितरणएड चिप EXO टैग 5 'पोल द्वितीय के लिए समाप्त हो जाती है, TFIIB, और K562 कोशिकाओं proliferating में मानव जीन RPS12 पर TBP। (बी) औसतन निकटतम RefSeq टीएसएस आसपास चिप EXO पैटर्न। भर में सभी TFIIB के कब्जे वाले पीक-जोड़ी टैग, टीएसएस जीन-से-जीन से गठबंधन किया गया 10bp अंतराल टीएसएस के सापेक्ष है, और फिर औसत पीक-जोड़ी घनत्व मूल्य गैर अतिव्यापी में binned (एन = 6511) जीन के रूप में साजिश रची गई थी कुल का एक प्रतिशत है। TBP और TFIIB के "spikes" अप्रत्यक्ष (खड़ी इनसेट में ऑफसेट) कर रहे हैं। (सी) मॉडल पैनल बी डेटा के आधार पर, अलग प्रतिलेखन दीक्षा चिप EXO (काला ट्रेस) द्वारा हल परिसरों को दर्शाता हुआ। पोल द्वितीय दो अलग-अलग स्थानों ढूढने है कि अलग-अलग प्रतिलेखन दीक्षा ( "अलग-अलग") और "रोकें" साइटों की साइटों के साथ हुई कब्जा कर लिया। पोल द्वितीय परिसरों की यह स्पष्ट स्थानिक जुदाई इंगित करता है कि अलग-अलग टेप अलग दीक्षा परिसरों से उत्पन्न होती हैं। विशाल बहुमत पोल द्वितीय crosslinked abo केन्द्र शासित प्रदेशों के 50 बीपी टीएसएस के बहाव "रोकें" साइट है, जहां यह प्रतिलेखन की शुरुआत के बाद थामने के लिए आशा की जाती है पर। टीएसएस जहां पूर्व दीक्षा परिसर ( "तस्वीर") रूपों, यह दर्शाता है कि औसत पर यह संभावना कम समय वहां रोक स्थलों पर की तुलना में खर्च करता है की नदी के ऊपर 60 बीपी - पोल द्वितीय सबसे समाप्त हो गया था 20। यह पता चलता है कि में सबसे अधिक (लेकिन जरूरी नहीं कि सभी) मामलों, एक बार पोल द्वितीय की भर्ती की है, यह तेजी से प्रमोटर को साफ करता है और एक रुका हुआ है राज्य में लगभग 30 हो जाती है - टीएसएस के 50 बीपी नीचे की ओर, प्रेक्षण पोल द्वितीय ठहराव जारी है कि संगत के साथ प्रतिलेखन में एक दर सीमित कदम है। ये आसन्न दीक्षा परिसरों चिप seq (ग्रे भरने का पता लगाने के द्वारा सचित्र) द्वारा unresolvable हैं, क्योंकि अपने संकल्प कुछ सौ आधार जोड़े के लिए सीमित है। चित्रा प्यूघ और Venters 11 से संशोधित किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ontent "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> पूरक फ़ाइल 1:। अतिरिक्त जानकारी यहां इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
1 एम HEPES-कोह (पीएच 7.5) 50 50 मिमी
5 एम NaCl 28 140 मिमी
0.5 एम EDTA 2 1 मिमी
100% ग्लिसरॉल 100 10%
10% NP40 50 0.50%
10% ट्राइटन X100 25 0.25%
DDH 2 हे 1 एल को भरें

तालिका 1. लिए lysis बफर 1. 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर पकाने की विधि। 4 सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर ट्यूबों में स्टोर। बफर बस का उपयोग करने से पहले की 50 मिलीलीटर के लिए 100 μl भाकपा शेयर जोड़े।

अभिकर्मक वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
1 एम Tris एचसीएल (पीएच 8) 10 10 मिमी
5 एम NaCl 40 200 मिमी
0.5 एम EDTA 2 1 मिमी
0.5 एम EGTA 1 0.5 मिमी
DDH2 हे 1 एल को भरें

तालिका 2 बफर 2. फ़िल्टर 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करने के लिए पकाने की विधि। 4 सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर ट्यूबों में स्टोर। बफर बस का उपयोग करने से पहले की 50 मिलीलीटर के लिए 100 μl भाकपा शेयर जोड़े।

अभिकर्मक वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
1 एम Tris एचसीएल (पीएच 8) 10 10 मिमी
5 एम NaCl 20 100 मिमी
0.5 एम EDTA 2 1 मिमी
0.5 एम EGTA 1 0.5 मिमी
10% deoxycholate 10 0.10%
5 ग्राम 0.5% (w / v)
DDH 2 हे 1 एल को भरें

तालिका 3. बफर 3. 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर के लिए पकाने की विधि। 4 सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर ट्यूबों में स्टोर। बफर बस का उपयोग करने से पहले की 50 मिलीलीटर के लिए 100 μl भाकपा शेयर जोड़े।

अभिकर्मक वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
10x पीबीएस 50 1x
पशुओं से जुड़े टीके का अन्नसार 2.5 ग्राम 0.50%
DDH 2 हे 500 से भरें

तालिका 4 रोकने के लिए पकाने की विधि बफर। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर। 4 सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर ट्यूबों में स्टोर। बफर बस का उपयोग करने से पहले की 50 मिलीलीटर के लिए 100 μl भाकपा शेयर जोड़े।

अभिकर्मक वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
1 एम HEPES (पीएच 7.5) 25 50 मिमी
0.5 एम EDTA (पीएच 8) 1 1 मिमी
10% सोडियम deoxycholate 35 0.70%
10% NP40 50 1%
1 एम LiCl 250 500 मिमी
DDH 2 हे 500 से भरें
सामग्री "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 "के लिए: रखने के-साथ-next.within-पेज =" हमेशा ">

सारणी 5. RIPA बफर के लिए पकाने की विधि। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर। 4 सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर ट्यूबों में स्टोर। बफर बस का उपयोग करने से पहले की 50 मिलीलीटर के लिए 100 μl भाकपा शेयर जोड़े।

अभिकर्मक वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
1 एम Tris-सीएल (7.5 पीएच) 2.5 50 मिमी
0.5 एम EDTA 1 10 मिमी
20% एसडीएस 2.5 1%
DDH 2 हे 50 तक भरें

6 तालिका चिप क्षालन बफर के लिए पकाने की विधि। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर। आरटी पर स्टोर।

अभिकर्मक वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
1 एम Tris-सीएल (7.5 पीएच) 0.5 10 मिमी
DDH 2 हे 50 तक भरें

टेबल 7. ते बफर के लिए पकाने की विधि। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर। 4 सेल्सियस पर स्टोर।

मात्रा (μl) [अंतिम]
100 माइक्रोन के ExA2-IX 75 15 माइक्रोन के
100 माइक्रोन के ExA2-33 75 15 माइक्रोन के
1 एम Tris (पीएच 7.5) 50 100 मिमी
5 एम NaCl 5 50 मिमी
DDH 2 हे 295 -
कुल मात्रा 500

8 तालिका P7 एडाप्टर एनीलिंग मिश्रण।

टेबल 9. पी -5 एडाप्टर एनीलिंग मिश्रण।

मात्रा (μl) [अंतिम]
100 माइक्रोन के ExA1-58 75 15 माइक्रोन के
100 माइक्रोन के ExA1-13 75 15 माइक्रोन के
1 एम Tris (पीएच 7.5) 50 100 मिमी
5 एम NaCl 5 50 मिमी
DDH 2 हे 295 -
कुल मात्रा 500
अस्थायी (सी) पहर
95 5 मिनट
72 5 मिनट
65 60 रैंप गिरावट के लिए 5 मिनट
55 50 रैंप गिरावट के लिए 3 मिनट
45 40 रैंप गिरावट के लिए 3 मिनट
30 3 मिनट
20 3 मिनट
10 3 मिनट
4 सदैव

टेबल से 10 एडाप्टर एनीलिंग कार्यक्रम।

1x (μl) [अंतिम]
DDH 2 हे 39.8
10x प्रतिक्रिया बफर 2 5 1x
100 सुक्ष्ममापी एटीपी 0.5 1 मिमी
3 मिमी dNTPs 1.7 100 सुक्ष्ममापी
3 यू / μl टी -4 पोलीमर्स 1 3 U
5 यू / μl Klenow 1 5 U
10 यू / μl टी -4 polynucleotide kinase 1 10 यू
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 50

टेबल 11. चमकाने मास्टर मिश्रण।

1x (μl) [अंतिम]
DDH 2 हे 42.3
10x प्रतिक्रिया बफर 2 5 1x
3 मिमी dATP 1.7 100 सुक्ष्ममापी
5 यू / μl Klenow 3'-5 'EXO शून्य 1 5 U
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 50

टेबल 12. एक-पीछा मास्टर मिश्रण।

1x (μl) [अंतिम]
DDH 2 हे 41
100 मिमी एटीपी 0.5 1 मिमी
10x प्रतिक्रिया बफर 2 5 1x
400 यू / μl टी -4 डीएनए लिगएएसई 1.5 600 U
प्रतिक्रिया मिश्रण की मात्रा 48
15 मिमी सूचकांक एडाप्टर 2 30 picomoles
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 50

टेबल 13. P7 एडाप्टर Ligation मास्टर मिश्रण।

1x (μl) [अंतिम]
DDH 2 हे 41
10x Φ -29 बफर 5 1x
3 मिमी dNTPs 2.5 150 सुक्ष्ममापी
10 यू / μl Φ -29 पोलीमर्स 1.5 15 यू
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 50

टेबल 14. Φ -29 निक मरम्मत मास्टर मिश्रण।

1x (μl) [अंतिम]
DDH 2 हे 43.5
100 मिमी एटीपी 0.5 1 मिमी
10x प्रतिक्रिया बफर 2 5 1x
10 यू / μl टी -4 polynucleotide kinase 1 10 यू
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 50

टेबल 15. Kinase रिएक्शन मास्टर मिश्रण।

1x (&# 956; एल) [अंतिम]
DDH 2 हे 43
10x Lambda बफर 5 1x
5 यू / μl लैम्ब्डा exonuclease 2 10 यू
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 50

टेबल 16. लैम्ब्डा exonuclease रिएक्शन मास्टर मिश्रण।

1x (μl) [अंतिम]
DDH 2 हे 44
10x प्रतिक्रिया बफर 2 5 1x
30 यू / μl RecJ च exonuclease 1 30 U
कुल प्रतिक्रिया volume 50

टेबल 17. RecJ च Nuclease रिएक्शन मास्टर मिश्रण।

1x (μl) [अंतिम]
DDH 2 हे 6.45
10x Φ -29 बफर 2 1x
3 मिमी dNTP 1.3 200 सुक्ष्ममापी
20 माइक्रोन P7 प्राइमर 0.25 0.25 सुक्ष्ममापी
प्रतिक्रिया मिश्रण की मात्रा 10
EtOH उपजी नमूना 10
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 20

टेबल 18. P7प्राइमर एक्सटेंशन रिएक्शन मास्टर मिश्रण।

अस्थायी (सी) पहर
95 5 मिनट
65 5 मिनट
30 2 मिनट
30 रखें जब तक Φ -29 जोड़ा जाता है
30 बीस मिनट
65 दस मिनट
4 सदैव

टेबल 19. P7 प्राइमर एक्सटेंशन प्रोग्राम।

1x (μl) [अंतिम]
DDH 2 हे 5
3 1x
3 मिमी dATP 1 0.1 मिमी
5 यू / μl Klenow 3 'के लिए 5' EXO शून्य 1 5 U
प्रतिक्रिया मिश्रण की मात्रा 10
प्राइमर विस्तारित नमूना 20
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 30

टेबल 20. एक-पीछा मास्टर मिश्रण।

1x (μl) [अंतिम]
DDH 2 हे 11.5
10x टी -4 ligase बफर 5 1x
15 माइक्रोन के ExA1-58 /13 एडाप्टर 2 30 picomoles
400 यू / μl टी -4 डीएनए Ligase 1.5 600 U
प्रतिक्रिया मिश्रण की मात्रा 20
एक पूंछ नमूना 30
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 50

टेबल 21. पी -5 एडाप्टर Ligation मास्टर मिश्रण।

1x (μl) [अंतिम]
5x पीसीआर बफर 10 1x (2 मिमी 2 MgCl)
प्रत्येक dNTP 10 मिमी 1 200 माइक्रोन के प्रत्येक
20 माइक्रोन के P1.3 प्राइमर 1.25 0.5 माइक्रोन के
20 माइक्रोन के P2.1 प्राइमर 1.25 0.5 माइक्रोन के
2 यू / μl गर्म प्रारंभ पोलीमर्स 0.5 1 यू
प्रतिक्रिया मिश्रण की मात्रा 14
मनका eluted नमूना 36
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 50

टेबल 22. पीसीआर।

<टीआर>
अस्थायी (सी) पहर साइकिल
98 30 सेकंड 1
98 10 सेकंड 15-21 (चिप दक्षता के आधार पर)
52 30 सेकंड
72 20 सेकंड
72 2 मिनट 1
4 सदैव पकड़

टेबल 23. पीसीआर कार्यक्रम।

प्रति डीएनए मानक (μl) प्रति नमूना (μl)
1: 200 पतला बफर / डाई मिश्रण 190 198
डीएनए मानकों 10
चिप EXO पुस्तकालय 2
कुल मात्रा 200 200

टेबल 24. मात्रा।

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Discussion

हम एक कार्यात्मक जीनोमिक प्रोटोकॉल प्रस्तुत क्रोमेटिन के पास आधार जोड़ी के प्रस्ताव पर एक निष्पक्ष, जीनोम चौड़ा तरीके से प्रोटीन बातचीत के लिए सटीक बाध्यकारी स्थान निर्धारित करने के लिए। पास आधार जोड़ी मानचित्रण संकल्प को प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम चिप समृद्ध डीएनए के exonuclease उपचार जबकि immunoprecipitate चुंबकीय राल पर बनी हुई है। जाहिरा तौर पर, प्रोटीन परिसरों संभावित किसी भी सबयूनिट (जैसे, क्रोमेटिन remodeling परिसरों या nucleosome कोर कण) के vivo footprinting ब्लॉक सकता है। हालांकि, के रूप में, पहले 10 सूचना के बाद से formaldehyde एक अक्षम crosslinker है, यह तेजी की संभावना नहीं है कि एक जटिल के कई यूनिटों डीएनए के लिए crosslink होगा और एक ही ठिकाना पर एक ही सेल में एक दूसरे के हो जाता है। इस प्रकार, इस तरह के एक nucleosome की अलग-अलग हिस्टोन सब यूनिटों के रूप में एक प्रोटीन परिसर के अलग-अलग यूनिटों के विवो footprinting में, चिप EXO साथ संभव है।

टी "> चिप EXO की सबसे उल्लेखनीय लाभ अपने पास आधार जोड़ी संकल्प और कम पृष्ठभूमि हैं। अल्ट्रा उच्च संकल्प नहीं है कि वर्तमान में किसी अन्य विधि के साथ संभव हो रहे हैं विस्तृत संरचनात्मक और स्थानिक अंतर्दृष्टि एक जीनोम व्यापक पैमाने पर किए जाने के लिए परमिट । दूसरी ओर, चिप EXO के प्राथमिक सीमा है कि यह मास्टर करने के लिए एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण आणविक जीव विज्ञान पद्धति है। इसके अलावा, चिप कदम के सामान्य सीमाओं भी चिप-EXO (जैसे, वाणिज्यिक एंटीबॉडी उपलब्धता और विशिष्टता के लिए लागू , मिलान पहुंच, और कोशिकाओं की अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में अपेक्षित)। आम नुकसान एक गैर-चिप ग्रेड एंटीबॉडी का उपयोग कर, और बर्फ पर नमूने के रूप में बहुत संभव के रूप में रखते हुए नहीं, खराब गुणवत्ता sonicated अर्क शामिल हैं। इस प्रकार, sonication शर्तों को ध्यान से अनुकूलित किया जाना चाहिए और प्रत्येक पहले के रूप में मान्य एंटीबॉडी वर्णित 18 हानिकारक प्रभाव इन मापदंडों प्रयोगात्मक परिणाम पर हो सकता है से बचने के लिए।

जहाँ तकएक प्रतिलेखन कारक लक्ष्य के लिए अनुक्रमण गहराई, हम आम तौर पर लगभग 20 लाख अनोखे गठबंधन पढ़ता के लिए लक्ष्य। चूंकि पोल द्वितीय और हिस्टोन संशोधनों अधिक मोटे तौर पर वितरित कर रहे हैं, हम 30 से 50 पढ़ता करने के लिए दस लाख के लिए लक्ष्य। यह ध्यान रखें कि जब से चिप EXO चिप seq की तुलना में काफी कम पृष्ठभूमि है, कम पढ़ता समान अनुक्रमण गहराई को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं महत्वपूर्ण है।

चिप EXO प्रौद्योगिकी अब व्यापक रूप से अपनी तकनीकी चुनौतियों के बावजूद अपनाया जा रहा है के रूप में मूल प्रोटोकॉल पर मजबूत रूपों 17,19,20 प्रकाशित हो रहे हैं। विशेष रूप से, एक भिन्नता है कि चिप प्रोटीन के लिए मुश्किल के लिए उपयोगी साबित हो सकता है चिप नेक्सस, जो पुस्तकालय तैयारी 20 की कुशलता बढ़ाने के लिए एक एकल बंधाव कदम का उपयोग करता है कहा जाता है। सारांश में, चिप EXO एक वैश्विक स्तर पर क्रोमेटिन बातचीत प्रोटीन की अल्ट्रा उच्च संकल्प मानचित्रण के लिए एक तेजी से कार्यरत हैं और शक्तिशाली पद्धति है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चिप ग्रेड चींटी की सूची के रूप मेंibodies वृद्धि जारी है, चिप EXO पद्धति के भविष्य के आवेदनों मानचित्रण अज्ञात जीन विनियामक नेटवर्क पर निर्देशित किया जाएगा अल्ट्रा उच्च संकल्प में सेल की आणविक circuitry समझने के लिए। इसके अलावा, चिप EXO संभावना आगे परिष्कृत हो सकता है और निकट आधार जोड़ी संकल्प पर इन विवो प्रोटीन आरएनए बातचीत पदचिह्न को रूपांतरित किया जाएगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% formaldehyde, methanol free, 10 x 10 ml ampules ThermoFisher Scientific 28908 Section 3
Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) Roche Life Science 11873580001 Sections 4, 8
Bioruptor sonicator Diagenode UCD200 Section 5
15 ml polystyrene tubes BD Falcon 352095 Section 5
MagSepharose Protein G Xtra beads GE Healthcare 28-9670-66 Section 6
DynaMag-1.5 ml Side Magnetic Rack Invitrogen 12321D Sections 6-17, 22
Mini-Tube Rotator Fisher Scientific 05-450-127 Sections 7, 22
T4 DNA Polymerase New England BioLabs M0203 Section 9
DNA Polymerase I, Klenow New England BioLabs M0210 Section 9
10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) New England BioLabs B7002 Sections 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer C Eppendorf 5382 Sections 9-16
ATP Roche Life Science 010419979001 Sections 9, 11, 13
dNTPs New England BioLabs N0447 Sections 9, 12, 19, 23
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201 Sections 9, 13
dATP New England BioLabs N0440 Sections 10, 20
Klenow 3'-5' Exo Minus New England BioLabs M0212 Sections 10, 20
T4 DNA ligase  New England BioLabs M0202 Sections 11, 21
Φ-29 DNA Polymerase New England BioLabs M0269 Sections 12, 19
10x Φ-29 Buffer New England BioLabs B0269 Sections 12, 19
Lambda Exonuclease New England BioLabs M0262 Section 14
10x Lambda Buffer New England BioLabs B0262 Section 14
RecJf Exonuclease New England BioLabs M0264 Section 15
Proteinase K Roche Life Science 03115828001 Section 16
Glycogen Roche Life Science 010901393001 Section 18
10x T4 Ligase Buffer New England BioLabs B0202 Section 21
AMPure XP (clean up) beads  Beckman Coulter A63881 Section 22
Q5 Hot Start DNA Polymerase  New England BioLabs M0493 Section 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) New England BioLabs B9027 Section 23
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Section 25
Qubit Fluorometer Invitrogen Q33216 Section 26
Optical Clear Qubit tubes  Invitrogen Q32856 Section 26
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit Invitrogen Q32851 Section 26

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References

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  20. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).

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जैव रसायन अंक 118 चिप EXO चिप seq चिप प्रतिलेखन जीन विनियमन क्रोमेटिन एपिजेनेटिक्स प्रतिलेखन कारक आणविक जीव विज्ञान
चिप EXO विधि: निकट आधार जोड़ी प्रेसिजन साथ प्रोटीन डीएनए सहभागिता की पहचान
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Perreault, A. A., Venters, B. J. The … More

Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. J. Vis. Exp. (118), e55016, doi:10.3791/55016 (2016).

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