Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Chippen-exo Metode: Identifikation Protein-DNA interaktioner med nærheden Base Pair Precision

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/55016
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Abstract

Kromatin immunofældning (chip) er et uundværligt redskab inden for epigenetik og genregulering, der isolerer specifikke protein-DNA interaktioner. Chip koblet til high throughput sekventering (chip-seq) er almindeligt anvendt til at bestemme den genomiske placering af proteiner, der interagerer med kromatin. Imidlertid er chip-seq hæmmet af forholdsvis lav kortlægning opløsning på flere hundrede basepar og høj baggrundssignal. Chippen-exo-metoden er en raffineret udgave af chip-seq, der væsentligt forbedrer både opløsning og støj. Det centrale skelnen af ​​chip-exo metode er inkorporeringen af ​​lambda exonucleasefordøjelse i biblioteket forberedelse workflow til effektivt fodaftryk venstre og højre 5'DNA-grænser af proteinet-DNA krydsbinding site. Chippen-exo biblioteker underkastes derefter high throughput sekventering. De resulterende data kan udnyttes til at give unikke og ultra-høj indsigt opløsning til den funktionelle organisation of genomet. Her beskriver vi chippen-exo-metoden, som vi har optimeret og strømlinet for mammale systemer og næste generation sekventering-by-syntese platform.

Introduction

Chromatin immunoprecipitation (chip) er en kraftfuld metode til at studere mekanismer genregulering ved selektivt at berige for DNA-fragmenter, der interagerer med et givet protein i levende celler. Fremgangsmåder til chip-beriget DNA-fragmenter Detection har udviklet sig som teknologien forbedres, fra detektering af et enkelt locus (standard chip-qPCR) til hybridisering på oligonucleotid-mikroarrays (chip-chip) til high-throughput sekventering (chip-seq) 1. Selvom chip-seq har set udbredt anvendelse, kromatin heterogenitet og uspecifikke DNA interaktioner er hæmmet datakvalitet, der fører til falsk positive og upræcis kortlægning. For at omgå disse begrænsninger, Dr. Frank Pugh udviklet chip-exo metode 2. Den iøjnefaldende træk ved chip-exo er, at de indeholder et 5 'til 3' exonuklease, effektivt footprinting transkriptionsfaktor bindende steder. Som følge heraf chippen-exo metode opnår højere opløsning, større dynamikområde detection, og lavere baggrundsstøj.

Selvom chip-exo er mere teknisk udfordrende at mestre end chip-seq, er det i vid udstrækning vedtaget som undersøgelser har til formål at få unikke ultra indsigt høj opløsning ved hjælp af forskellige biologiske systemer 3-8. Faktisk har chip-exo med held været anvendt til bakterier, gær, mus, rotte, og humane cellekulturer. Som bevis på princippet blev chip-exo oprindeligt brugt til at identificere den præcise bindende motiv for en håndfuld af gær transskription faktorer 2. Teknikken blev også anvendt i gær til at undersøge organiseringen af transkription pre-initieringskompleks, og at dechifrere subnucleosomal struktur af forskellige histoner 9,10. For nylig vi gearede chip-exo at løse tilstødende TFIIB og Pol II bindende begivenheder på humane promotorer, og viste, at udbredt divergent transkription skyldes distinkt initieringskomplekser 11.

Arbejdsgangen præsenteres her er optimeret og streamlined For mammale chip-exo (figur 1). Først lever primære eller vævskulturceller behandlet med formaldehyd for at bevare in vivo protein-DNA-interaktioner gennem en kovalent tværbinding. Cellerne lyseres og chromatin sheared til ~ 100 - 500 basepar størrelse fragmenter. Chip derefter selektivt beriger for DNA-fragmenter tværbundet til proteinet af interesse. På dette tidspunkt er chip-seq biblioteker fremstilles typisk, som i sagens natur begrænser påvisning beslutning til gennemsnitlige fragment størrelse på nogle få hundrede basepar. Imidlertid chip-exo overvinder denne begrænsning ved at trimme den venstre og højre 5 'DNA-grænserne af proteinet-DNA krydsbinding site med lambda exonuklease. Sekventeringsreaktioner biblioteker konstrueres derefter fra exonuklease fordøjet DNA som beskrevet nedenfor. De resulterende indlejrede 5'grænser udgør en in vivo fodaftryk af proteinet-DNA interaktion (figur 1, trin 14), og detekteres af high throughput sekventering. altHough chip-exo metode er mere involveret end chip-seq, overgange mellem de fleste trin kræver enkel perle vask, hvilket minimerer prøvetab og eksperimentel variabilitet. Vigtigere er det, da chip-exo er en raffineret udgave af chip-seq, enhver prøve, som er vellykket med chip-seq bør også være en succes med chip-exo.

In vivo footprinting af protein-DNA-interaktioner med chip-exo resulterer i en grundlæggende forskellige datastruktur fra chip-seq. Selvom almindelige Chip-seq opkaldere kan anvendes på chip-exo-data, for at opnå de mest præcise peak opkald anbefaler vi bioinformatiske værktøjer specifikt designet med den unikke struktur i chip-exo-data i tankerne. Disse omfatter Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla, og ExoProfiler 12-15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Dobbelt destilleret H2O eller molekylærbiologisk kvalitet tilsvarende anbefales til alle buffere og reaktioner blandinger.

Dag 0: Klargøring og Cell Harvest

1. Buffer Fremstilling

  1. Forbered Lysis Buffere 1 - 3 (tabel 1 - 3), og der tilsættes 100 pi komplet proteaseinhibitor lager (CPI) til 50 ml af hver buffer lige før anvendelse. Forbered CPI lager ved at opløse en tablet i en ml molekylærbiologisk kvalitet H 2 O.
  2. Forbered Chip Buffere (tabel 4 - 7). Tilsæt 100 pi CPI lager til 50 ml Blokering og RIPA buffere. Tilføj ikke CPI til Tris og chip Elueringspuffere.

2. Annealing af adapteroligonukleotider

Bemærk: Specifikke oligonucleotidsekvenser kan findes i den Yderligere information sektionen.

  1. Forbered Adapter Annealing blandinger (tabel 8 - 9). Vortex at blande og kortvarigtspinde rør til at indsamle indhold. Portion 100 pi af hver blanding i 0,5 ml rør.
  2. Hybridiserer de oligonukleotider ved at køre programmet (tabel 10) i Thermocycler.
    Opbevares annealede oligonukleotider ved -80 ° C.

3. In vivo chromatin Tværbinding med Formaldehyd

BEMÆRK: For en typisk chip eksperiment, bør udgangsmaterialet indeholde ca. 50 millioner celler.

  1. Tilføj frisk 37% methanol-frit formaldehyd stamopløsning til phosphatpufret saltopløsning (PBS) vasket cellekultur til en endelig koncentration på 1% (v / v) og blandes grundigt, og lad stå ved stuetemperatur i 10 min.
    BEMÆRK: For eksempel har vi typisk tilsættes 1,4 ml 37% methanol-frit formaldehyd til celler i 50 ml stuetemperatur PBS. Undgå også formaldehyd krydsbinding i medier siden proteiner i medierne vil slukke nogle af formaldehyd.
  2. Stands tværbindingsreaktionen ved tilsætning af 2,5 M glycine til en slutkoncentration på 125 mM. Bland grundigt.
  3. Overfør celler til 50 ml rør på is. Spin celler i 5 minutter ved 1.000 xg ved 4 ° C. Dekanteres supernatanten.
  4. Tilsæt 1 ml iskold 1x PBS til cellepellet og resuspender ved pipettering. Overførsel til 1,5 ml rør.
  5. Spin celler i 3 min ved 2000 xg ved 4 ° C. Aspirer supernatanten.
  6. Umiddelbart flash fryse cellepellets i 1,5 ml rør med flydende nitrogen. Opbevar ved -80 ° C. Tværbundne celler er stabile på ubestemt tid ved -80 ° C.

Dag 1: Cell Lysis, Sonikering, og chip

4. Cell Lysis

BEMÆRK: Under alle celle lysis sektioner, SKAL prøverne opbevares på is eller ved 4 ° C for at minimere tværbinde vending.

  1. Kort fortalt tø tværbundet cellepellet. Grundigt resuspender hver pellet i 0,5 ml Lysis Buffer 1 og kombinere med 4,5 ml Lysis Buffer 1 i et 15 ml polystyrenrør.
  2. Rock rør i 10 minutter ved 4 ° Cfor på en vippende platform. Spin i 4 minutter ved 2.000 xg ved 4 ° C. Dekanteres supernatanten.
  3. Grundigt resuspender hver pellet i 0,5 ml Lysis Buffer 2 og tilsæt 4,5 ml Lysis Buffer 2 engang resuspenderes.
  4. Rock i 5 minutter ved 4 ° C på en vippeplatform. Spin i 5 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C. Dekanteres supernatanten og forsigtigt trykke overskydende på køkkenrulle.
  5. Grundigt resuspender hver pellet i 0,5 ml Lysis Buffer 3 og der tilsættes 1 ml Lysis Buffer 3 gang resuspenderes. Hold nukleare lysater på is og straks gå videre til lydbehandling.

5. Sonikering nukleare Lysater

BEMÆRK: Under alle lydbehandling sektioner, SKAL prøverne opbevares på is for at minimere tværbinde vending. Den specifikke model af sonikator anvendes i forbindelse med protokollen nedenfor kan findes i tabellen i Materials. Nærmere oplysninger om specifikke sonikator brug og retningslinjer for andre instrumenter kan findes i Yderligere information sektionen.

  1. place resonance adaptere i 15 ml polystyrenrør indeholdende nukleare ekstrakter (det metalliske bar må ikke røre væggen af ​​røret).
  2. Soniker nukleare lysater i en iskold vandbad i 2 x 15 min sessioner med 30 sek ON / 30 sek OFF ved middel effekt. lydbehandling kun to 15 ml rør ad gangen. Disse indstillinger arbejde på en bred vifte af cellelinjer og primære celletyper, men yderligere optimering kan være nødvendig, hvis kromatin klipning er ufuldstændig.
  3. For at kontrollere lydbehandling, formidling 2 x 10 pi prøver fra lysat i 1,5 ml rør.
    1. For at vende tværbindinger, kombineres de første 10 pi alikvot med 10 pi TE-RNase A og 0,2 pi proteinase K. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Tilsæt 4 pi 6x xylen DNA farvestof.
    2. For at bevare krydsbindinger, kombinere det andet 10 pi portion med 2 pi 6x xylen DNA farvestof.
    3. Kør begge prøver på en 1,5% agarosegel ved 140 V i ca. 30 - 45 min, indtil bromphenol farvestof i stigen is ¾ af vejen ned gelen.
  4. Hvis lydbehandling var vellykkede (de fleste DNA-fragmenter klippet til 100 - 500 bp), overførsel sonikeret lysater til 2 ml rør indeholdende 150 pi 10% Triton X-100. Vortex at blande.
  5. At pelletere uopløselige chromatin og snavs, centrifugering sonikeret nuklear lysat i 10 minutter ved 20.000 xg ved 4 ° C.
  6. Overfør supernatanten til et nyt 2 ml rør. Fortsæt straks til chip eller opbevare prøver ved -80 ° C på ubestemt tid. Sonikerede uddrag bør ikke fryses og optøs mere end én gang.

6. Kobling Antistof mod Beads

BEMÆRK: Aldrig vortex eller fryse / tø magnetiske perler, da de vil ryste og øge baggrund signal.

  1. Efter grundig blanding lager, alikvot Y pi perle gylle i 1,5 ml rør, hvor Y = 1,1 x 2,5 pi x (antal chip prøver). Bindingskapacitet i 2,5 pi bead opslæmning er op til 13 ug IgG. Vask poolede perler 3x med 1 ml BlokeringPuffer.
  2. For mere konsekvent aliquotting af perler efter vask, resuspender perler i 10x oprindelige gylle volumen (25 pl / chip) med blokerende buffer. Portion 25 pi per chip prøve i 1,5 ml rør.
  3. Tilføj 5 - 10 ug af antistof til tilsvarende alikvot af resuspendere perlerne. Bring endelige volumen op til 250 pi med blokerende buffer. Inkuber prøver i 4 timer (alternativt natten over i 16 timer) på en roterende platform ved 4 ° C.
  4. Aspirer supernatanten. At fjerne ubundet eller overskydende antistof, vaskes perler en gang med 1 ml blokeringsbuffer.
  5. Efter opsugning sidste vask straks tilføje 50 millioner celle ækvivalenter af sonikerede ekstrakter (~ 1,6 ml) til antistof: perle konjugater. Hvis sonikerede ekstrakter er ikke klar, resuspender perler i 100 pi blokerende buffer, indtil de er klar. Det er vigtigt at aldrig lade perlerne tørre.

7. chromatin Immunpræcipitation (chip)

  1. For hver chip prøve, kombinere 1,5 ml sonikatd ekstrakter med antistof: perle konjugater i 1,5 ml eller 2 ml rør.
  2. Inkubér rør på en mini-rør rotator natten over (ca. 16 timer) ved hastighed indstilling 9 ved 4 ˚C. Check efter et par minutter for at sikre prøverne ikke lækker og blander korrekt.

Dag 2: Chip Vasker og On-harpiks enzymatiske reaktioner

8. CHIP Vasker

BEMÆRK: For at minimere krydskontaminering, kortvarigt spinde rør mellem hver vask. For første aspiration, ændre tips mellem hver prøve. Under efterfølgende vaske, kan den samme spids anvendes, så længe det ikke røre perlerne. Se Yderligere information Sektion for retninger på en ordentlig chip vask.

  1. Meget kort spinde rør ved hjælp af en mikrocentrifuge (~ 3 sek ved 500 xg) at indsamle væske i hætter og placere på magnetiske rack til 1 min. Mens stadig på magnetiske rack, aspirat ekstrakt.
  2. Tilføj 0,75 ml RIPA buffer til hvert rør. Fjern rør fra magnetisk rackog vend adskillige gange for at blande. Udskift rør på magnetisk rack og aspirat supernatant. Gentag 7x.
  3. Tilføj 0,75 ml 10 mM Tris-HCI (pH 7,5) til hvert rør. Fjern rør fra magnetisk rack og vend flere gange for at blande. Udskift rør på magnetisk rack og aspirat supernatant. Gentag 2x.
  4. Efter opsugning sidste vask, videre til polering.
    Bemærk: Efter hver inkubation reaktion i §§ 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3, og 15.3, kortvarigt spin-rør og sted mod magnetisk stativ til 1 min og aspirat supernatant. Vask 2x med 0,75 ml RIPA puffer og 2 gange med 0,75 ml Tris-HCI (pH 7,5).

9. Polering Reaktion

  1. Udfyld Polering mester mix beregninger (tabel 11). Lav Polering mix i 1,5 ml rør på is. Pipette at blande.
  2. Umiddelbart efter den sidste chip vask opsuges, tilsættes 50 pi af polering mix til hver prøve harpiks, mens du stadig på den magnetiske rack. Inkuber prøverne i 30 minutter ved 3 xgved 30 ˚C i en termomikser.
  3. Efter opsugning sidste vask som beskrevet i note efter afsnit 8.4, gå videre til A-hale.

10. A-hale Reaktion

  1. Udfylde en-hale mester mix beregninger (tabel 12). Make A-hale mix i et 1,5 ml rør på is. Pipette at blande.
  2. Umiddelbart efter polering sektion, tilsættes 50 ul A-hale mix til hver prøve harpiks, mens du stadig på den magnetiske rack. Inkuber prøver i 30 minutter ved 3 x g ved 37 ° C i en termomikser.
  3. Efter opsugning sidste vask som beskrevet i note efter afsnit 8.4, gå videre til P7 Adapter Ligation.

11. P7 Adapter ligeringsreaktion

  1. Udfyld æggelederne mester mix beregninger (tabel 13). Gør ligeringsblandingen i 1,5 ml rør på is. Pipette at blande.
  2. Umiddelbart efter A-hale sektion, tilsættes 48 ul P7 æggelederne mester mix og 2 pi af en anden adapter Indeks to hver prøve harpiks mens den stadig på den magnetiske rack. Inkuber prøver i 2 timer ved 3 xg ved 25 ˚C i en termomikser.
    Bemærk: Anvendelsen af ​​forskellige indekser for hver prøve vil tillade flere prøver, der skal sekventeres i en enkelt strømningscelle.
  3. Efter opsugning sidste vask som beskrevet i note efter afsnit 8.4, gå videre til Φ-29 Nick Repair.

12. Phi-29 Nick Repair Reaction

  1. Udfyld Φ-29 mester mix beregninger (tabel 14). Make Φ-29 mix i 1,5 ml rør på is. Pipette at blande.
  2. Umiddelbart efter P7 æggelederne sektion, tilsættes 50 ul Φ-29 mix til hver prøve harpiks, mens du stadig på den magnetiske rack. Inkuber prøver i 20 min ved 3 xg ved 30 ˚C i en termomikser.
  3. Efter opsugning sidste vask som beskrevet i note efter afsnit 8.4, fortsætte til Kinasereaktion.

13. kinasereaktion

  1. Udfyld kinase mester mix beregninger (
  2. Umiddelbart efter Φ-29 sektion, tilsættes 50 pi kinase blandes til hver prøve harpiks mens den stadig på den magnetiske rack. Inkuber prøver i 20 min ved 3 xg ved 37 ˚C i en termomikser.
  3. Efter opsugning sidste vask som beskrevet i note efter afsnit 8.4, gå videre til Lambda Exonuclease reaktion.

14. Lambda Exonuclease Reaction

  1. Udfyld Lambda exonuclease mester mix beregninger (tabel 16). Gør Lambda Exonuclease mix i 1,5 ml rør på is. Pipette at blande.
  2. Umiddelbart efter kinase sektion, tilsættes 50 ul Lambda Exonuclease mix til hver prøve harpiks, mens du stadig på den magnetiske rack. Inkuber prøver i 30 minutter ved 3 x g ved 37 ° C i en termomikser.
  3. Efter opsugning sidste vask som beskrevet i note efter afsnit 8.4, gå videre til RecJ f reaktion.

15. RecJ fnucleasereaktionen

  1. Udfyld RecJ f mester mix beregninger (tabel 17). Gør RecJ f mix i 1,5 ml rør på is. Pipette at blande.
  2. Umiddelbart efter Lambda Exonuclease sektion, tilsættes 50 ul RecJ f mix til hver prøve harpiks, mens du stadig på den magnetiske rack. Inkuber prøver i 30 minutter ved 3 x g ved 37 ° C i en termomikser.
  3. Efter opsugning sidste vask som beskrevet i note efter afsnit 8.4, fortsæt at chip Elution.

16. Eluering og Crosslink Tilbageførsel

  1. Forbered stamblanding: antal prøver x 1,1 x (200 pi ChIP Elution Buffer + 1 pi 20 mg / ml proteinase K) i 1,5 ml rør. Tilsæt 200 pi chip Elution Buffer + proteinase K mester mix til hver prøve harpiks.
  2. Inkuber prøver natten over (ca. 16 timer) ved 3 xg ved 65 ˚C i en termomikser med en opvarmet låg for at forhindre kondens.

Dag 3: DNA Uddragion og adapter Ligation

17. Eluering og Crosslink Reversal (fortsat)

  1. Efter inkubation natten over ved 65 ° C, kortvarigt dreje prøver at indsamle kondensat. Anbring prøverne på magnetisk stativ til 1 min.
  2. Transfer 200 pi supernatant til nyt 1,5 ml rør indeholdende 200 pi TE-buffer (pH 7,5).

18. Phenol Chloroform Isoamylalkohol (PCIAA) Udvinding

  1. Tilsæt 400 pi phenol chloroform isoamylalkohol til hver prøve. Vortex for at blande i 20 sekunder.
  2. Centrifugeres i 10 minutter ved 20.000 xg ved stuetemperatur (RT). overføre omhyggeligt 325 pi af det øvre vandige lag til et frisk rør.
    Bemærk: Pas på ikke at overføre nogen af ​​det organiske (nederste lag) i det nye rør.
  3. Tilføj 1/10 volumen 3 M NaOAc (pH 5,5) og 1 pi 20 mg / ml glycogen til hver prøve. For flere prøver, forberede en master mix.
  4. Tilsæt 3 volumener iskold 100% ethanol til hver prøve. Vortexat blande. Inkuber i 15 minutter ved -80 C.
  5. Centrifuge i 15 minutter ved 20.000 xg ved 4 ° C. dekanteres forsigtigt supernatanten, og sørg for ikke at forstyrre bundfaldet.
  6. Forsigtigt tilføje 500 pi frisklavet iskold 70% ethanol, og sørg for ikke at forstyrre bundfaldet. Centrifuger i 5 minutter ved 20.000 xg ved 4 ° C. dekanteres forsigtigt supernatanten.
  7. Tør pellet i ca. 20 min (eller indtil tør) i en hastighed vakuum ved 45 ˚C.
    BEMÆRK: Dette er en pause punkt i protokollen. Tørre DNA pellets kan opbevares ved -20 ° C.
  8. Resuspender pellets i 10 pi Hedeselskabet 2 O. Pipetter gentagne gange over det område, hvor DNA pelleteret, selv om den tørrede pellet kan ikke ses.
  9. Overfør 10 pi af hver prøve til et frisk 0,3 ml PCR-rør eller 8-rack, afhængigt af antallet af prøver.

19. P7 primerforlængelsesreaktion

  1. Udfyld P7 Primer Extension mester mix beregninger (tabel 18). Gør Extension mix i 1,5 ml rør på is. Pipette at blande.
  2. Tilsæt 10 pi Extension mix (minus Φ-29 polymerase) til hver 10 pi prøve. Pipette at blande.
  3. Køre prøver i Thermocycler hjælp af programmet (tabel 19) at anneale primer til templaten indtil 30 C "hold" trin.
  4. Tilsæt 1 pi Φ-29 polymerase under 30 ˚C "hold" skridt i programmet. Pipette at blande. Genoptag resten af programmet (tabel 19).

20. A-Haledannelsesreaktionen

  1. Udfylde en-hale mester mix beregninger (tabel 20). Make A-hale mix i et 1,5 ml rør på is. Pipette at blande.
  2. Tilsæt 10 pi af A-hale mix til hver prøve. Pipette at blande.
  3. I Thermocycler, inkuber prøverne i 30 minutter ved 37 ° C, hvorefter der opvarmes inaktivere i 20 minutter ved 75 ° C.

21. P5 Adapter ligeringsreaktion

  1. fill ud P5 adaptorligering mester mix beregninger (tabel 21). Gør ligeringsblandingen i 1,5 ml rør på is. Pipette at blande.
  2. Tilsæt 20 pi P5 ligeringsblandingen til hver prøve. Pipette at blande.
  3. I Thermocycler, inkuberes prøverne i 2 timer ved 25 ° C.

22. Bead Oprydning

Bemærk: Se venligst afsnittet Materialer til producentens oplysninger om perle rydde op.

  1. Overfør hver 50 pi prøve til et nyt 1,5 ml rør.
  2. Resuspender rense perler på en mini-rør rotator ved hastighedsindstilling på 15 i 15 minutter ved stuetemperatur. Lad ikke perlerne afregne før pipettering.
  3. Tilføj 60 pi rydde op perler prøve (1,2: 1 rydde op perler til prøvetagningskvotient er kritisk at fjerne DNA, som er kortere end 200 basepar). Pipetter at blande i 20 sek.
  4. Resuspender rense perler på en mini-rør rotator ved hastighedsindstilling på 15 for 3 minutter ved stuetemperatur. Kort fortalt spinde rør.
  5. Rørene anbringes på den magnetiske stativ i 1 min.Pipette off og kassér supernatanten.
    BEMÆRK: Brug IKKE vakuum aspiration i denne sektion, fordi det vil suge op oprydning perler.
  6. Tilføj 400 pi frisklavet RT 70% ethanol til hver prøve, mens de er på magnetisk rack. Bland ikke. Aspirer supernatanten. Gentag 2x.
  7. Tør oprydning perler i 10 min ved stuetemperatur. Farven på perlerne vil vende mørke til lys brun og meget små revner vil være synlige i harpiksen pillen når perler er tørre.
  8. Til eluering DNA, der tilsættes 40 ul 10 mM Tris (pH 7,5). Grundigt pipette til at blande i 20 sekunder.
  9. Placer prøverne på den magnetiske stativ i 1 min. pipetteres langsomt og overføre 36 pi eluat direkte til 0,3 ml PCR-rør.
  10. Gå direkte til PCR-reaktion eller opbevare eluaterne ved -20 ˚C.

Dag 4: PCR og Gel Analysis

23. PCR

  1. Udfyld PCR Master mix beregninger (tabel 22). Foretag PCR mix. Pipette meget forsigtigt for at blande for at undgåbobler.
  2. Tilføj 14 pi PCR-blanding til hver 36 pi DNA-prøve. Pipette at blande. Hold prøverne på is indtil klar til at sætte i Thermocycler.
  3. For den positive PCR-kontrol, omfatter en tidligere fremstillet bibliotek. For den negative PCR-kontrol, indbefatter vand. Køre prøver i Thermocycler anvendelse af PCR-programmet (tabel 23).

24. Gel Forberedelse, DNA Excision og visualisering

  1. Rengør og skyl en passende størrelse gelboksen med demineraliseret vand. Der fremstilles en 1,5% agarosegel (indeholdende 0,5 mg / ml ethidiumbromid) med tyk, bred brønde kam, der kan holde 60 pi.
    BEMÆRK: Ethidiumbromid (EtBr) er kræftfremkaldende og skal håndteres med forsigtighed.
  2. Spin down PCR prøverør kort for at samle kondens.
  3. Tilføj 1/5 volumen af ​​6x xylen DNA farvestoffet til kombineret prøve. Brug ikke bromphenolblåt i DNA-farvestof, da det migrerer på samme sted som prøve-DNA.
  4. Læg hele prøven into hver brønd, fortrinsvis med tomme brønde i mellem prøverne.
    Note: Biblioteker med de samme indekser må IKKE køre i samme gel.
  5. Load 7 pi 100 bp stige på begge sider af prøver. Kør gel ved 140 V i ca. 30-45 min, indtil bromphenol farvestof i stigen er ¾ vej ned gelen.
  6. Billede og visualisere gel på en transilluminator ved en lav UV indstilling. Udskære dele af agarose indeholdende DNA-fragmenter 200-500 bp. Vær meget omhyggelig med at undgå at skære ud adapter dimer band, der kører på 125 bp.
  7. Placer hver udskåret gelskive i et 15 ml rør. Optag nettovægt hver gel skive. Skriv denne vægt direkte på røret.
  8. Billede, gemme og anmærke udskårne gel for at bekræfte korrekte størrelse interval valgt.

25. Gel Oprensning

  1. Oprense DNA fra udskårne gel skive ifølge producentens instruktioner, med følgende modifikationer.
  2. Opløs gelskiven ved rockingved stuetemperatur på vippeplatform. Det vil tage ca. 20 min for at opløse.
  3. Til opnåelse højt oprenset DNA, vaskes kolonnerne med 0,5 ml puffer QG efter opløst gel er passeret gennem kolonnen.
  4. Efter Buffer PE vask, lad kolonner sidde ved stuetemperatur til 2 - 5 min. Spin i 1 minut ved 13.000 xg ved stuetemperatur.
  5. For at give plads til PCR reaktion mester mix, elueres prøver med 40 pi EB Buffer i en frisk 1,5 ml rør.

26. DNA Kvantificering

  1. Forbered prøver i overensstemmelse med producentens instruktioner (tabel 24). Mål prøver i angivne instrument med optiske rør.
  2. Når chip-exo biblioteker kvantificeres, indsende til sekventering på en platform, der bruger sekventering-by-syntese kemi 16, der er kompatibel med DNA adaptere i denne protokol.
    BEMÆRK: Typisk 2 pi prøve er tilstrækkeligt til kvantificering, men mere kan være nødvendig, hvis koncentrationen prøve er lavere. DNA giver typiskly området mellem 50 og 200 ng.
  3. Efter kvantificering, opbevare prøver ved -20 ˚C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De følgende figurer illustrerer repræsentative resultater fra chippen-exo-protokol præsenteres her. I modsætning til traditionelle chip-seq metoder med få enzymatiske trin, chip-exo kræver elleve sekventielt afhængige enzymatiske reaktioner (figur 1). Således skal man passe på hvert trin for at sikre, at hver reaktion komponent tilføjes til dets respektive reaktion mester mix. Vi anbefaler, at generere en stereotyp regneark baseret på reaktionen Borde til automatisk at udføre de reaktion master-mix beregninger, udskrive de resulterende tabeller, og derefter kontrollere off hvert element, når det er føjet til master mix.

Vi beskæftiger en række kvalitetskontrol hele protokollen for at sikre høj kvalitet sekventering resultater (figur 2). Hver chip reaktion indeholder tre grundlæggende komponenter: 1) sonikerede kromatin ekstrakt fra celler af interest, 2) et antistof rettet mod proteinet af interesse og 3) ProteinG (eller protein A) harpiks for at immobilisere de udfældede immunkomplekser. Opnåelse af høj kvalitet sonikeret kromatin ekstrakter (figur 2a) kan være ganske udfordrende, da lydbehandling betingelser skal optimeres for hver celletype og sonikering instrument. Det er værd at bruge tid til at optimere dette trin, fordi den højeste kvalitet biblioteker starter med en sonication resultat, der giver DNA-fragmenter mellem 100 - 500 bp (figur 2A, "+" bane). Da formaldehyd krydsbindinger er labile og formaldehyd selv har en begrænset holdbarhed, bruger vi en elektroforetisk mobilitet shift assay (figur 2A, "-" bane) for at kontrollere, at de sonikerede ekstrakter indeholder intakte protein-DNA tværbindinger, tydelig som super-shift af DNA-fragmenterne. For at vurdere baggrunden signal, vi rutinemæssigt udføre en "mock" chip, der udelader antistof fra chippen reaktion. En høj kvalitet chip-exo bibliotek forberedelse vil have meget lidt, om nogen, baggrundssignal i "mock" chip ( "-") i forhold til den specifikke chip antistof, i dette tilfælde rettet mod Pol II. Som det ses i figur 2B, traditionelle chip-seq biblioteker har væsentligt mere baggrundssignal end chip-exo. Endelig før sekventering, chip-exo bibliotek kvalitet vurderes på Bioanalyzer (Figur 2C - D). Analyse måler nøjagtigt biblioteket størrelsesfordeling og detekterer kontaminerende adapter dimerer (angivet med pil), der kører ved 125 bp. Hvis adapter dimerer er til stede, vil de reducerer sekventering båndbredde. Derfor anbefaler vi en ekstra perle oprydning, som effektivt fjerner DNA fragmenter mindre end 200 bp.

Chip-exo er en kraftfuld funktionel genomisk teknik, fordi det er den eneste metode er i stand til rumligt løse divergerende, initiering, standsede, og forlængede RNA-polymerase II ona genom-plan (figur 3) 11. Da disse tilgrænsende bindende begivenheder er snesevis af basepar fra hinanden, chip-seq kan ikke skelne disse bindende begivenheder med opløsningsevne af flere hundrede basepar.

figur 1
Figur 1: Chip-exo Skematisk. Efter chip bliver P7 adapter ligeret til sonication grænser. Lambda exonuklease trimmer derefter DNA 5 'til 3' til tværbinding punkt og derved fodaftryk protein-DNA-interaktion. Efter eluering og crosslink vending, primerforlængelse syntetiserer duplex DNA. Endelig ligering af P5 adapteren markerer venstre og højre exonuclease grænser og det resulterende bibliotek underkastes high-throughput sekventering. Kortlægning af 5 'enderne af sekvensmærker til referencen genomet afgrænser exonuklease barrieren og dermed den præcise lokalitet af protein-DNAtværbinding. Figur modificeret fra Rhee og Pugh 17. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Chip-exo kvalitetskontrol. Paneler AC viser repræsentative resultater fra uafhængige eksperimenter. (A) Kvaliteten af lydbehandlet kromatin ekstrakt (fra den humane HCC1806 brystcancercellelinie) er bedømt ved agarosegelelektroforese på ekstrakter med (+) og uden (-) tværbindingerne omvendt. Intakte tværbindinger vil forårsage protein-DNA-komplekser til at migrere langsommere. Således kører ekstrakt uden tværbindinger omvendt (-) giver mulighed for kvaliteten af ​​de formaldehyd krydsbindinger, der skal vurderes, som er afgørende for en vellykket chip. (B) Sammenligning af en mock IP (-) and Pol II (+) chip-exo og chip-seq bibliotek præparater efter 21 cykler af PCR-amplifikation. Efter PCR DNA-fragmenter 200-500 bp udskæres (angivet med rød hash'et boks) og oprenset under anvendelse af et Gel Extraction kit. (CD) I felt C, den øverste spor repræsenterer en ideel spor fra en poolet bibliotek (P1), og den nederste spor viser en pooled bibliotek (P2), der indeholder adapter dimerer. Panel D viser DNA tæthed plot svarende til P1-2 bibliotekets spor fra felt C (pil angiver adapter dimer band). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Chip-exo Rumligt Løser Distinct Bidirectional transkriptionsinitiering komplekser. (A) Udglattet fordeling af streng-separatelyed chip-exo tag 5'-ender for Pol II, TFIIB, og TBP ved den humane RPS12 gen i prolifererende K562-celler. (B) i gennemsnit chip-exo omkring det tætteste RefSeq TSS. Peak-pair-tags blev tilpasset til TSS-gen-for-gen, arkiveret lodret i ikke-overlappende 10bp intervaller i forhold til TSS, og derefter den gennemsnitlige maksimale-pair tæthed værdi på tværs af alle TFIIB besatte (n = 6.511) gener blev plottet som en procent af totalen. De "spikes" af TBP og TFIIB er indiscernible (lodret forskudt i indsat). (C) model baseret på panel B data, der illustrerer forskellige transkriptionsinitiering komplekser løst af Chip-exo (sort trace). Pol II besatte to separate opløselige steder, faldt sammen med steder af divergent transkriptionsinitiering ( "divergerende") og "pause" websteder. Denne klare rumlig adskillelse af Pol II-komplekser indikerer, at divergerende transkripter skyldes forskellige initieringskomplekser. Langt de fleste Pol II tværbundet abo ut 50 bp nedstrøms for TSS på "Pause" site, hvor det forventes at holde pause efter start transskription. Pol II blev mest udtømt 20-60 bp opstrøms for TSS, hvor præ-indledning kompleks ( "PIC") former, hvilket indikerer, at det i gennemsnit sandsynligvis tilbringer mindre tid der end på de midlertidigt afbrudte websteder. Dette antyder, at i de fleste (men ikke nødvendigvis alle) tilfælde, når Pol II rekrutteres, reddede hurtigt promotoren og påtager sig en på pause-state cirka 30-50 bp nedstrøms for TSS, i overensstemmelse med den observation, at Pol II pause udgivelse er et hastighedsbegrænsende trin i transskription. Disse tilstødende initiation komplekser er uløselig af Chip-seq (illustreret ved gråt fyld spor) siden sin beslutning er begrænset til nogle få hundrede basepar. Figur modificeret fra Pugh og Venters 11. Klik her for at se en større version af dette tal.

Indholdsproduktion "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Supplerende Fil 1:. Yderligere information Klik her for at downloade denne fil.

Reagens Volumen (ml) [Final]
1 M HEPES-KOH (pH 7,5) 50 50 mM
5 M NaCl 28 140 mM
0,5 M EDTA 2 1 mM
100% Glycerol 100 10%
10% NP40 50 0,50%
10% Triton X100 25 0,25%
Hedeselskabet 2 O Fyld til 1 l

Tabel 1. Opskrift på Lysis Buffer 1. Filter hjælp 0,22 um filter. Opbevares i 50 ml rør ved 4 ˚C. Tilsæt 100 pi CPI lager til 50 ml buffer lige før anvendelse.

Reagens Volumen (ml) [Final]
1 M Tris-HCl (pH 8) 10 10 mM
5 M NaCl 40 200 mM
0,5 M EDTA 2 1 mM
0,5 M EGTA 1 0,5 mM
Hedeselskabet2 O Fyld til 1 l

Tabel 2. Opskrift på Lysis Buffer 2. Filter hjælp 0,22 um filter. Opbevares i 50 ml rør ved 4 ˚C. Tilsæt 100 pi CPI lager til 50 ml buffer lige før anvendelse.

Reagens Volumen (ml) [Final]
1 M Tris-HCl (pH 8) 10 10 mM
5 M NaCl 20 100 mM
0,5 M EDTA 2 1 mM
0,5 M EGTA 1 0,5 mM
10% deoxycholat 10 0,10%
5 g 0,5% (vægt / volumen)
Hedeselskabet 2 O Fyld til 1 l

Tabel 3. Opskrift på Lysis Buffer 3. Filter hjælp 0,22 um filter. Opbevares i 50 ml rør ved 4 ˚C. Tilsæt 100 pi CPI lager til 50 ml buffer lige før anvendelse.

Reagens Volumen (ml) [Final]
10x PBS 50 1x
Bovint serumalbumin 2,5 g 0,50%
Hedeselskabet 2 O Fyld til 500

Tabel 4. Opskrift på Blokering Puffer. Filter bruge 0,22 um filter. Opbevares i 50 ml rør ved 4 ˚C. Tilsæt 100 pi CPI lager til 50 ml buffer lige før anvendelse.

Reagens Volumen (ml) [Final]
1 M HEPES (pH 7,5) 25 50 mM
0,5 M EDTA (pH 8) 1 1 mM
10% natriumdeoxycholat 35 0,70%
10% NP40 50 1%
1 M LiCI 250 500 mM
Hedeselskabet 2 O Fyld til 500
indhold "fo: holde-together.within-side =" 1 "fo: holde-med-next.within-page =" altid ">

Tabel 5. Opskrift på RIPA buffer. Filter bruge 0,22 um filter. Opbevares i 50 ml rør ved 4 ˚C. Tilsæt 100 pi CPI lager til 50 ml buffer lige før anvendelse.

Reagens Volumen (ml) [Final]
1 M Tris-CI (pH 7,5) 2.5 50 mM
0,5 M EDTA 1 10 mM
20% SDS 2.5 1%
Hedeselskabet 2 O Fyld til 50

Tabel 6. Opskrift på chip Elution Buffer. Filter bruge 0,22 um filter. Opbevar ved stuetemperatur.

Reagens Volumen (ml) [Final]
1 M Tris-CI (pH 7,5) 0.5 10 mM
Hedeselskabet 2 O Fyld til 50

Tabel 7. Opskrift på TE buffer. Filter bruge 0,22 um filter. Opbevar ved 4 ˚C.

Volumen (pi) [Final]
100 uM ExA2-iX 75 15 uM
100 uM ExA2-33 75 15 uM
1 M Tris (pH 7,5) 50 100 mM
5 M NaCl 5 50 mM
Hedeselskabet 2 O 295 -
totalvolumen 500

Tabel 8. P7 Adapter Annealing mix.

Tabel 9. P5 Adapter Annealing mix.

Volumen (pi) [Final]
100 uM ExA1-58 75 15 uM
100 uM ExA1-13 75 15 uM
1 M Tris (pH 7,5) 50 100 mM
5 M NaCl 5 50 mM
Hedeselskabet 2 O 295 -
totalvolumen 500
Temp (C) Tid
95 5 min
72 5 min
65-60 rampe tilbagegang 5 min
55-50 rampe tilbagegang 3 min
45-40 rampe tilbagegang 3 min
30 3 min
20 3 min
10 3 min
4 For evigt

Tabel 10. Adapter Annealing Program.

1x (pi) [Final]
Hedeselskabet 2 O 39,8
10x Reaction Buffer 2 5 1x
100 uM ATP 0.5 1 mM
3 mM dNTP'er 1.7 100 uM
3 U / pl T4 polymerase 1 3 U
5 U / pl Klenow 1 5 U
10 U / pl T4-polynukleotidkinase 1 10 U
Totalt reaktionsvolumen 50

Tabel 11. Polering mastermix.

1x (pi) [Final]
Hedeselskabet 2 O 42.3
10x Reaction Buffer 2 5 1x
3 mM dATP 1.7 100 uM
5 U / pl Klenow 3'-5'-exo minus 1 5 U
Totalt reaktionsvolumen 50

Tabel 12. A-hale-blandingen.

1x (pi) [Final]
Hedeselskabet 2 O 41
100 mM ATP 0.5 1 mM
10x Reaction Buffer 2 5 1x
400 U / pl T4 DNA Ligase 1.5 600 U
Reaktionsblanding volumen 48
15 mM Index Adapter 2 30 picomol
Totalt reaktionsvolumen 50

Tabel 13. P7 adaptorligering Master Mix.

1x (pi) [Final]
Hedeselskabet 2 O 41
10x Φ-29 Buffer 5 1x
3 mM dNTP'er 2.5 150 uM
10 U / pl Φ-29 polymerase 1.5 15 U
Totalt reaktionsvolumen 50

Tabel 14. Φ-29 Nick Repair mastermix.

1x (pi) [Final]
Hedeselskabet 2 O 43,5
100 mM ATP 0.5 1 mM
10x Reaction Buffer 2 5 1x
10 U / pl T4-polynukleotidkinase 1 10 U
Totalt reaktionsvolumen 50

Tabel 15. Kinase Reaction mastermix.

1x (&# 956; l) [Final]
Hedeselskabet 2 O 43
10x Lambda Buffer 5 1x
5 U / pl Lambda exonuklease 2 10 U
Totalt reaktionsvolumen 50

Tabel 16. Lambda exonuklease Reaction mastermix.

1x (pi) [Final]
Hedeselskabet 2 O 44
10x Reaction Buffer 2 5 1x
30 U / pl RecJ f exonuklease 1 30 U
Total reaktionstid vlydstyrken 50

Tabel 17. RecJ f nucleasereaktionen mastermix.

1x (pi) [Final]
Hedeselskabet 2 O 6,45
10x Φ-29 Buffer 2 1x
3 mM dNTP 1.3 200 uM
20 uM P7 Primer 0.25 0,25 uM
Reaktionsblanding volumen 10
EtOH udfældede prøve 10
Totalt reaktionsvolumen 20

Tabel 18. P7Primerforlængelsesreaktion mastermix.

Temp (C) Tid
95 5 min
65 5 min
30 2 min
30 Hold indtil Φ-29 tilsættes
30 20 min
65 10 min
4 For evigt

Tabel 19. P7 Primer Extension program.

1x (pi) [Final]
Hedeselskabet 2 O 5
3 1x
3 mM dATP 1 0,1 mM
5 U / pl Klenow 3 'til 5' exo minus 1 5 U
Reaktionsblanding volumen 10
Primer extended prøve 20
Totalt reaktionsvolumen 30

Tabel 20. A-hale-blandingen.

1x (pi) [Final]
Hedeselskabet 2 O 11.5
10x T4 Ligase Buffer 5 1x
15 uM ExA1-58 /13 adapter 2 30 picomol
400 U / pl T4 DNA ligase 1.5 600 U
Reaktionsblanding volumen 20
A-tailed prøve 30
Totalt reaktionsvolumen 50

Tabel 21. P5 adaptorligering Master Mix.

1x (pi) [Final]
5x PCR-buffer 10 1x (2 mM MgCl2)
10 mM af hver dNTP 1 200 uM hver
20 uM P1.3 Primer 1.25 0,5 um
20 uM P2.1 Primer 1.25 0,5 um
2 U / pl Hot Start polymerase 0.5 1 U
Reaktionsblanding volumen 14
Bead eluerede prøve 36
Totalt reaktionsvolumen 50

Tabel 22. PCR.

<tr>
Temp (C) Tid Cykler
98 30 sek 1
98 10 sek 15-21 (afhængigt af chip effektivitet)
52 30 sek
72 20 sek
72 2 min 1
4 For evigt Holde

Tabel 23. PCR program.

Per DNA Standard (pi) Per prøve (pi)
1: 200 fortyndet buffer / farvestof mix 190 198
DNA-standarder 10
Chip-exo-bibliotek 2
totalvolumen 200 200

Tabel 24. Kvantificering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer en funktionel genomisk protokol til at bestemme den præcise bindende sted for kromatin interagerende proteiner i en fordomsfri, genom-dækkende måde ved nær basepar opløsning. Det mest kritiske trin for at opnå nær basepar kortlægningsopløsning er exonukleasebehandling af chip-beriget DNA mens immunopræcipitatet forbliver på magnetiske harpiks. Tilsyneladende kunne proteinkomplekser potentielt blokere in vivo footprinting af enhver given underenhed (fx chromatin remodeling komplekser eller nukleosom kernepartikel). Men som tidligere rapporteret 10, eftersom formaldehyd er en ineffektiv tværbinder, bliver det mere og mere usandsynligt, at flere underenheder af et kompleks ville tværbinde til DNA og hinanden i den samme celle på samme locus. Således in vivo footprinting af individuelle underenheder af et proteinkompleks, såsom individuelle histon underenheder af en nukleosom, er muligt med chip-exo.

t "> De mest bemærkelsesværdige fordele ved chip-exo er dens nær basepar opløsning og lav baggrund. Den ultra-høj opløsning muliggør detaljerede strukturelle og rumlige indsigt, der skal foretages på en genom-plan, der ikke aktuelt er muligt med nogen anden metode . på den anden side, den primære begrænsning chip-exo er, at det er et teknisk udfordrende molekylærbiologi metode at mestre. desuden er de generelle begrænsninger af chip trin også anvendelse på chip-exo (f.eks kommercielt antistof tilgængelighed og specificitet , epitop tilgængelighed og relativt stort antal celler påkrævet). fælles faldgruber indbefatter dårlig kvalitet sonikerede ekstrakter, anvendelse af en ikke-chIP kvalitet antistof og ikke holder prøver på is så meget som muligt. derfor skal lydbehandling betingelser omhyggeligt optimeres og hver antistof valideret som tidligere beskrevet 18 for at undgå de skadelige virkninger disse parametre kan have på den eksperimentelle resultat.

Så vidt somsekventering dybde for en transskription faktor mål, vi typisk sigte efter omkring 20 millioner entydigt rettet læser. Da Pol II og histon modifikationer mere bredt fordelt, sigter vi for 30-50.000.000 læser. Det er vigtigt at bemærke, at eftersom chip-exo har betydeligt mindre baggrund end chip-seq, læser færre er nødvendige for at opnå lignende sekventering dybde.

Chippen-exo-teknologi bliver nu udbredt til trods for sine tekniske udfordringer, som robuste varianter af den oprindelige protokol fortsat blive offentliggjort 17,19,20. Især er en variation, der kan være nyttigt for vanskelige at CHIP proteiner kaldet chip-nexus, som anvender en enkelt ligering trin at øge effektivt af biblioteket fremstilling 20. Sammenfattende chip-exo er en stadig ansat og kraftfuld metode til ultrahøj opløsning kortlægning af kromatin interagerende proteiner på globalt plan. Da listen af ​​kommercielt tilgængeligt chip-grade antibodies fortsætter med at vokse, vil fremtidige applikationer af chippen-exo metode rettes mod kortlægning uudforsket gen regulatoriske netværk til at forstå den molekylære kredsløb af cellen i ultrahøj opløsning. Desuden vil chip-exo sandsynligvis være yderligere forbedret og tilpasset til fodaftryk i vivo protein-RNA-interaktioner på nær basepar opløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% formaldehyde, methanol free, 10 x 10 ml ampules ThermoFisher Scientific 28908 Section 3
Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) Roche Life Science 11873580001 Sections 4, 8
Bioruptor sonicator Diagenode UCD200 Section 5
15 ml polystyrene tubes BD Falcon 352095 Section 5
MagSepharose Protein G Xtra beads GE Healthcare 28-9670-66 Section 6
DynaMag-1.5 ml Side Magnetic Rack Invitrogen 12321D Sections 6-17, 22
Mini-Tube Rotator Fisher Scientific 05-450-127 Sections 7, 22
T4 DNA Polymerase New England BioLabs M0203 Section 9
DNA Polymerase I, Klenow New England BioLabs M0210 Section 9
10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) New England BioLabs B7002 Sections 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer C Eppendorf 5382 Sections 9-16
ATP Roche Life Science 010419979001 Sections 9, 11, 13
dNTPs New England BioLabs N0447 Sections 9, 12, 19, 23
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201 Sections 9, 13
dATP New England BioLabs N0440 Sections 10, 20
Klenow 3'-5' Exo Minus New England BioLabs M0212 Sections 10, 20
T4 DNA ligase  New England BioLabs M0202 Sections 11, 21
Φ-29 DNA Polymerase New England BioLabs M0269 Sections 12, 19
10x Φ-29 Buffer New England BioLabs B0269 Sections 12, 19
Lambda Exonuclease New England BioLabs M0262 Section 14
10x Lambda Buffer New England BioLabs B0262 Section 14
RecJf Exonuclease New England BioLabs M0264 Section 15
Proteinase K Roche Life Science 03115828001 Section 16
Glycogen Roche Life Science 010901393001 Section 18
10x T4 Ligase Buffer New England BioLabs B0202 Section 21
AMPure XP (clean up) beads  Beckman Coulter A63881 Section 22
Q5 Hot Start DNA Polymerase  New England BioLabs M0493 Section 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) New England BioLabs B9027 Section 23
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Section 25
Qubit Fluorometer Invitrogen Q33216 Section 26
Optical Clear Qubit tubes  Invitrogen Q32856 Section 26
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit Invitrogen Q32851 Section 26

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
  2. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
  5. Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
  6. Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
  7. Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
  8. Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
  10. Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
  11. Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
  12. Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
  13. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
  14. Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
  15. Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
  16. Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
  17. Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
  18. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
  19. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
  20. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).

Tags

Biokemi chip-exo chip-seq chip transskription genregulering kromatin epigenetik transkriptionsfaktorer molekylærbiologi
Chippen-exo Metode: Identifikation Protein-DNA interaktioner med nærheden Base Pair Precision
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perreault, A. A., Venters, B. J. The … More

Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. J. Vis. Exp. (118), e55016, doi:10.3791/55016 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter