Forberedelse og Kultur Myogenic precursorceller / Primær Myoblaster af skeletmuskulatur af Voksen og Aged Mennesker

Summary

Denne protokol beskriver en robust, reproducerbar og enkel fremgangsmåde til isolering og dyrkning af myoblast progenitorceller fra skeletmuskel af voksne og ældre mennesker. De muskler, der anvendes her, omfatter fod og ben muskler. Denne tilgang muliggør isolering af en beriget population af primære myoblaster for funktionelle studier.

Abstract

Skeletal muscle homeostase afhænger muskelvækst (hypertrofi), atrofi og regenerering. Under aldring og i adskillige sygdomme, muskelsvind forekommer. Tab af muskelmasse og funktion er associeret med muskelfibertypesammensætningen atrofi, fibertype switching, defekt muskel regenerering forbundet med dysfunktion af satellit-celler, muskel stamceller og andre patofysiologiske processer. Disse ændringer er forbundet med ændringer i intracellulært samt lokale og systemiske nicher. Ud over de hyppigst anvendte gnavermodeller for muskel aldring, er der behov for at studere muskel homeostase og spilder anvendes humane modeller, der på grund af etiske implikationer, består overvejende af in vitro kulturer. På trods af den brede anvendelse af menneskelige myogene progenitorceller (MPCS) og primære myoblaster i myogenese, er der begrænsede data om brugen af ​​humane primære myoblast og myotube kulturer til at studere molekylære mekanismer der regulerer forskellige aspekter af alder-associeret muscle spilde, medvirken i validering af mekanismerne for aldring foreslået i gnaver muskel. Brugen af ​​menneskelige Middelhavspartnerlandene, primære myoblaster og myorør isoleret fra voksne og ældre mennesker, giver en fysiologisk relevant model af molekylære mekanismer i processer forbundet med muskelvækst, atrofi og regeneration. Her beskriver vi detaljeret en robust, billig, reproducerbar og effektiv protokol til isolering og opretholdelse af humane Middelhavspartnerlandene, og deres afkom - myoblaster og myorør fra human muskel prøver under anvendelse enzymatisk fordøjelse. Endvidere har vi bestemt passage nummer, hvor primære myoblaster fra voksne og ældre mennesker undergår ældning i en in vitro-dyrkning. Endelig viser vi evnen til at transficere disse myoblaster og evnen til at karakterisere deres proliferative og differentiering kapacitet og foreslå deres egnethed til at udføre funktionelle studier af molekylære mekanismer myogenese og muskelsvind in vitro.

Introduction

Sygdoms- og aldersrelateret progressivt tab af skelet muskelmasse og funktion resulterer i skrøbelighed, nedgang i styrke og fald i livskvalitet ældre mennesker. Skeletal muscle tegner sig for ca. 40% kropsmasse ^1. Under ældning og sygdom, progressiv atrofi af individuelle myofibre og reduktion af muskel kvalitet på grund af infiltration af fedt og fibrose forekommer ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} For nylig er det blevet foreslået, at artsspecifikke forskelle i ældning af skeletmuskulatur forekomme, specifikt, at muskelfibrene tab, der opstår hos gnavere, kan ikke finde sted hos mennesker ^7. Ikke desto mindre er de tilbageværende muskelfibre af alderen pattedyr karakteriseret ved øget modtagelighed for beskadigelse og nedsat regenerering Voksen muskel reparation og vedligeholdelse er medieret af satellit celler ^{9, 10.} Ved muskelskader og andre relevante stikord, satellit celler bliver aktiveret og formere sig. En delmængde af cellerne tilbage til den hvilende tilstand og resten skrider ind myoblaster (Myogenic progenitorceller - MPCS). Disse bidrager til reparation af den eksisterende myofiber ^11. Funktionaliteten af satellit-celler er afgørende for succes af muskel regenerering og ændringerne i satellit celle tilgængelighed med aldring er påvist ^{12, 13, 14, 15.} Endvidere satellitceller fra musklen af gamle mennesker og gnavere viser en transskriptionsprofilen switch og reduceret regenerativ potentiale ^{16, 17, 18, 19.} Satellitceller i muskler fra gamle mus og mennesker har også vist sig at undergå senescens resulterer i deres reducerede funktioner ^20.

Den mest etableret cellelinie muliggør studiet af musklen homeostase er murine C2C12 cellelinje ^21. En væsentlig del af undersøgelser har også brugt murine primære myoblaster ^22. Disse kulturer har ført til en betydelig forståelse af murine og hvirveldyr myogenese samt muskel regenerering, myotube / myofiber atrofi, og hypertrofi processer, der forekommer i løbet af muskel sygdom og aldring ^{23, 24, 25, 26.} For nylig har adskillige grupper beskrevet under anvendelse humane primære myoblaster at studere myogenese og muskel aldring. Men der er mangel på konsensus med Regards til forskelle mellem primære myoblaster isoleret fra musklen af voksne og ældre mennesker ^{27, 28, 29, 30, 31.} Trods forskelle kendetegnet ved den systemiske og lokale miljø opstår under udvikling, aldring og sygdom ^{6, 32, 33, 34,} in vitro myoblast og myotube kulturer forbliver de mest tilgængelige værktøjer til at studere molekylære mekanismer, der er forbundet med muskel udvikling, vækst og atrofi. Derudover disse undersøgelser tilvejebringer ikke kun et robust, men også en relativt hurtig, billig og høj kapacitet in vitro værktøj. Desuden etiske implikationer forbundet med studier af menneskelige muskler betyder, at for funktionelle forsøg med manipulationer af genekspression

Her viser vi en simpel forsøgsprotokol for robust, billig og reproducerbar isolering af primære myoblaster eller Middelhavspartnerlandene, fra musklen af voksne og ældre mennesker og beskrive standardiserede betingelser for in vitro-dyrkning (figur 1). Som primære kulturer fra muskel indeholder normalt fibroblaster foruden myoblaster, anbefaler vi en preplating skridt sigter mod forbedret renhed og kvalitet af primære myoblaster. For at opsummere, har vi etableret en protokol der giver mulighed for en effektiv og reproducerbar isolation, kultur og funktionelle studier af beriget og funktionelle Middelhavspartnerlandene / primære myoblaster fra skeletmuskulatur af voksne og ældre mennesker.

Protocol

Alle forsøg med humant væv beskrevet heri blev godkendt på forhånd af University of Liverpool, Universitetshospital Aintree Hospital og South West Wales Research Ethics Committee (Godkendelse No: 13 / WA / 0374) og eksperimenter blev udført i overensstemmelse med god praksis vejledning. The University of Liverpool fungerede som etikken sponsor til denne undersøgelse. Alle donorer har givet informeret samtykke til registrering af denne undersøgelse. Musklerne blev isoleret fra mennesker (BMI <25): voksen: 30 ± 2,8 år og alderen: 69 ± 5 år.

1. Forberedelse til Kultur

1. Coating af kultur overflader med laminin
   1. Forbered en arbejdsgruppe opløsning af 10 mg / ml laminin i 1x DPBS (Dulbeccos phosphatbufrede saltvand).
   2. Afpipetteres en minimal mængde laminin opløsning til helt at dække den overflade, på hvilken cellerne vil være belagt (tabel 1). inkuber than dyrkningsskål mindst 30 minutter i en befugtet 37 ° C, _5% CO2 inkubator før udpladning af cellerne. Håndtag laminin omhyggeligt og undgå brugen af ​​vortex. Arbejdsopløsningen på 10 ug / ml laminin fortyndet i DPBS kan opbevares ved 4 ° C og genbruges flere gange.
   3. Anvend en 60 mm (20 ^cm2) petriskål eller 2 brønde i en 6-brønds plade (2 x 10 ^cm2) pr -18 - 19 mg af skeletmuskulatur til pladen cellerne (5,50 x 10 ⁴ celler i alt). Udfør celletælling på alle tidspunkter, når plating celler til funktionelle studier.
      BEMÆRK: Prøver blev oprindeligt fremstillet af mund kirurgi (extensor digitorum brevis, tibialis anterior eller bortføreren halluces muskler) af kvindelige patienter (voksne: 30 ± 2,8 år, alderen: 69 ± 5 år, BMI <25).
2. Fremstilling af enzymatisk opløsning
   1. Forbered 250 mM _CaCl2 brugsopløsning: 277 mg lager _CaCl2 i 10 ml 1x DPBS. Filtrer sålution med et 0,2 um filter membran og opbevares ved 4 ° C.
   2. Der fremstilles en arbejdsopløsning af 1,5 U / ml kollagenase D, 2,4 U / ml Dispase II og 2,5 mM _CaCl2 i serumfrit DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Medium) (tabel 2).
   3. Bland omhyggeligt og filtreres den enzymatiske opløsning gennem et 0,2 um filter membran til sterilisering. Forbered den enzymatiske opløsning i forvejen og fryse ned (-20 ° C) i portioner til senere brug.

2. Tissue Fordøjelse: Mekanisk og Enzymatisk Dissociation

1. Efter prøvetagning, holde muskler ved 4 ° C i DPBS indtil fordøjelsen. Forbered en mindste mængde på 2 ml _{collagenasedispase-CaCl2} opløsning pr 18 - 19 mg muskelvæv og varme det til 37 ° C før væv dissociation.
2. Nedsænkes muskel biopsi kortvarigt i 70% ethanol, vaskes med frisk DPBS og placere vævet på en ny petriskål med 1 ml enzymatiskløsning.
3. Kassér så meget fibrøst og fedtvæv som muligt og rive musklen hurtigt, men forsigtigt i små, men skelnes stykker (ca.> 0,5 ^mm2) med steril saks eller en kirurgisk skalpel (blad nr 10).
4. Overfør prøven i en 50 ml rør med de resterende 1 ml af den _{collagenasedispase-CaCl2.}
5. Inkuber vævet ved 37 ° C op til 30 - 40 min. Flyt muskelvævet ved forsigtig omrøring røret hver 5 - 10 min.
6. Coat pipetterne med medier for at undgå adhæsion af de frigivne celler til plastik vægge pipetterne. Tilsæt 2 volumener sterilt vækstmedium, fx 4 ml DMEM 20% FBS (føtalt bovint serum), 1% L-glutamin og 1% P / S (penicillin-streptomycin), for at stoppe fordøjelsen.
7. Pipette op og ned flere gange med en 5 ml pipette til at hjælpe frigivelse af cellerne fra muskelfibrene.
   BEMÆRK: Prøven er normalt helt dissocieret grund af sin lille størrelse. However, hvis fragmenter af muskler stadig bruge en anden inkubation med de resterende stykker af muskler og med frisk enzymatisk løsning.
8. Filtrer musklen opløsning gennem en 70 um cellefilter over en 50 ml konisk rør. Vask de resterende celler med flere medier og filtreres gennem sien.
9. Centrifuger ved 443 xg i 5 minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerne. Supernatanten kasseres omhyggeligt.
10. Pellet opløses i F-12 medier (Hams F-12 Nutrient Mix), 20% FBS, 10% HS (hesteserum), 1% P / S, 1% α-glutamin og 2,5 ng / ml FGF-b ( rekombinant human basisk fibroblastvækstfaktor). Her anvende 4 ml medium pr 60 mm petriskål.

3. Såning Celler

1. Saml kulturen fartøj tidligere belagt med 10 ug / ml laminin fra inkubatoren (afsnit 1.1).
2. Fjern forsigtigt det overskydende laminin fra kultur fad, og undgå at berøre overfladen (eller det vil forstyrre proteinstruktur). Vaskkultur fad med DPBS (valgfrit).
3. Plate cellerne direkte på lamininovertrukne fartøj og inkuberes i 24 timer i en befugtet 37 ° C, _5% CO2 inkubator.
4. Visualiser cellerne under den lyse-felt mikroskop (100X total forstørrelse) den følgende dag. Runde små celler bundet til overfladen, og den resterende snavs kan ses i dyrkningsmedierne.
5. Skift mediet friske F-12 medier suppleret med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin og 2,5 ng / ml FGF-b.

4. Kultur og Passage Celler

1. Skift medierne hver 2 - 3 D og opdele cellerne så snart grupper af celler er synlige under mikroskopet (100X total forstørrelse, eksempel i figur 2, celler fra ældre mennesker, passage 0 efter 7 d) for at undgå spontan differentiering.
2. Ved den første passage (P1), ændre mediet til høj-glucose DMEM suppleret med 20% FBS, 10% HS, 1%P / S, 1% α-glutamin. Undgå at bruge FGF-b fra dette punkt, som FGF er et potent mitogen og vigtig faktor ved begyndelsen af ​​dyrkningen, men det kan fremme fibroblast overvækst hvis de anvendes længere i kultur.
3. For celle passage:
   1. Fjern mediet og vask cellerne to gange med DPBS.
   2. Tilføj et minimalt volumen af ​​0,25% EDTA-trypsin at dække overfladen af ​​cellerne. Rock forsigtigt for at sikre, at alle cellerne er dækket af detachement løsning, inkuberes i 10 sekunder ved stuetemperatur, og fjern det.
   3. Inkubér cellerne i en befugtet 37 ° C, _5% CO2 inkubator i 3 - 5 min. Tap forsigtigt og tjek under lyse lysmikroskop (100X total forstørrelse) at cellerne er afrundede, men ikke helt løsrevet fra overfladen. Hvis der observeres ingen ændring i cellerne, inkuberes i 5 flere min.
   4. Der tilsættes 5 ml vækstmedium (high-glucose DMEM suppleret med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin) at indsamle de celler, blandgodt og overføre cellerne med de nye medier i en T75 kolbe. Vask de resterende celler gentage dette trin med en anden 5 ml vækstmedium (10 ml i alt for en T75 kolbe).
   5. At præplade (foretrukket ved den første passage), inkuber cellerne i en befugtet 37 ° C, _5% CO2 inkubator i 40 min. Opsaml supernatanten med de celler, som ikke vedhæfte og inkuber dem i en ny T75 kolbe. Dette skulle berige kulturen i myoblaster, da de fleste af de fibroblaster burde have fastgjort i den første kolbe.
4. Skift medierne hver 2 - 3 i d og opdele cellerne 1 til 4, så snart de når 70% konfluens i maksimalt udbytte.
5. For differentiering, når cellerne nåede 70 - med 80% konfluens, ændre dyrkningsmediet til differentiering Medium (DM): høj glucose DMEM suppleret med 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin. Cellerne bør differentieres inden for 5 - 7 d afhængigt af kvaliteten og renheden af ​​myoblast cULTUR.

5. Transfektioner Protokol

1. Seed 50.000 celler / brønd i en 12-brønds plade til MF 20, senescens og levedygtighed assays. Kultur celler på dækglas eller i et fad belagt med laminin. For Ki67-farvning, frø 25.000 celler / brønd i en 12-brønds plade.
2. For transfektioner Følg producentens procedure ved hjælp 5 pi transfektionsreagens, 100 nM af kontrol microRNA efterligne eller inhibitor, 100 nM microRNA efterligning eller 100 nM microRNA inhibitor per brønd, med et samlet volumen på 1 ml.
3. Skift til Differentiering Medium 6 timer efter transfektion (høj-glucose DMEM suppleret med 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin). For spredning eksperimenter, bejdse cellerne 2 d efter transfektion; for ældning, 7 d efter transfektion; og for MF20-farvning, syv dage efter transfektion.

6. immunfarvning af cellerne

1. Ki67, MyoD og MF 20 immunfarvning
   1. Forbered blok 1 (10% HS og 0,1% Triton-X i PBS) og blokere 2 (10% HS og 0,05% Triton-X i PBS) løsninger. Brug 500 pi reagens per brønd i en 12-brønds plade.
      BEMÆRK: Udfør følgende trin ved hjælp af en shaker til inkubationstrinnene.
   2. Fjern mediet fra cellerne.
   3. Skyl cellerne med PBS.
   4. Fastgør cellerne med kold methanol i 10 min på en rocker.
   5. Fjern methanolen fra cellerne og skyl 3x med PBS i 5 minutter hver gang.
   6. Tilføj blok 1 opløsning og inkuber cellerne på en rocker ved stuetemperatur i 1 time.
   7. Tilføj primært antistof løsning: for Ki67 farvning, bruge Kanin mAb til Ki67 (1: 1000 fortynding i blok 2); for MyoD, bruge MYOD1 (D8G3) XP Rabbit mAb (1: 100 fortynding i blok 2); for MF 20 farvning, brug MYH1E (MF 20) primære antistof (DSHB, 1: 1000 fortynding i blok 2).
   8. Inkubér cellerne med det primære antistof i 1 time (RT) til O / N (4 ° C) på en rocker.
   9. Saml den primære AB (det kan genbruges flere gange, hvis storød ved 4 ° C).
   10. Skyl cellerne 3x med PBS, 5 min hver gang.
   11. Derpå tilsættes en passende sekundære antistof: for Ki67 eller MyoD-farvning, ged anti-kanin IgG (H + L) sekundært antistof, Alexa Fluor 488-konjugat (1: 1.000 fortynding i PBS); for MF 20-farvning, ged anti-mus IgG (H + L) sekundært antistof, Alexa Fluor 488-konjugat (1: 1.000 fortynding i PBS).
   12. Wrap pladen indeholdende cellerne og inkuberes sekundært antistof i 2 timer i mørke på en rocker ved stuetemperatur.
   13. Skyl cellerne 3 x med PBS i 5 minutter hver gang.
   14. Tilføj DAPI-opløsning (1: 1.000 fortynding i PBS) på cellerne og inkuber på rocker ved stuetemperatur i 5 - 10 min.
   15. Skyl cellerne 3 x med PBS i 5 minutter hver gang.
   16. Tilsæt 1 ml frisk PBS.
   17. Monter cellerne på dækglassene ved montering opløsning eller forsegle pladen indeholdende cellerne i PBS med Parafilm at undgå fordampning.
   18. Opbevares ved 4 ° C.
   19. Visualiser cellerne medfluorescens mikroskop så hurtigt som muligt (senest 2 uger).
2. levedygtighedsassayet
   1. Fjern mediet fra cellerne.
   2. Skyl cellerne i PBS.
   3. Tilsæt 1: 1.000 ethidiumbromid og 1: 1.000 acridinorange fortyndet i PBS.
      Forsigtig: Pas og arbejde inden for sundheds- og sikkerhedsregler - ethidiumbromid er kræftfremkaldende.
   4. Wrap pladen indeholdende cellerne i farveopløsning og inkubere ved stuetemperatur på rocker i 5 min.
   5. Tage billeder af cellerne med fluorescens mikroskop: grønne kanal for acridinorange; rød kanal for ethidiumbromid.

Representative Results

MPCS / primære myoblaster skal være synlig 24 timer efter podning på laminin-coatede overflade (figur 2). Cellerne bør vedtage en spindel-lignende form og bør udtrykke MyoD stadig i passagen 4 (figur 1A, B). Fibroblaster kan skelnes ved deres stjerne-lignende morfologi og manglende udtryk for MyoD (figur 1B, C). Når cellerne er bundet på den følgende dag, bør medier erstattes med friske bFGF medier. De dyrkningsmedier skal udskiftes hver 48. time.

De repræsentative resultater vist her og offentliggjorte data fra vores laboratorium ²² mål at støtte vores isolering og dyrkning protokol og demonstrere de forskellige teknikker, der kan anvendes til funktionelle undersøgelser af humane primære myoblaster. Myoblast proliferation kan studeres ved hjælp Ki67-immunfarvning og levedygtighed under anvendelse staining i celleviabilitetstest (figur 3). For differentiering, bør dyrkningsmediet ændres til differentieringsfaktorer medier. Myorør bør danne hos 5 - 7 d og være myosin tung kæde positive (figur 3). Bemærk, at myotube dannelse kan være mindre effektive, når myoblaster isoleres fra musklen af ældre mennesker (figur 3). Senescens (SA-β-galactosidase) farvning kan også udføres for at fastslå procentdelen af senescentceller i kulturen (figur 3). Vi observerede, med længere kulturer (Figur 3, passage 4), flere myoblaster isoleret fra musklen af ældre mennesker viser senescens.

For funktionelle undersøgelser, kan genet og microRNA ekspression manipuleres under anvendelse lipofile transfektionsreagenser-medieret levering af ekspressionsvektorer, siRNA'er, microRNA efterligner og antimiRs (figur 4). Dette giver mulighed for 40 -70% transfektionseffektivitet med gen / microRNA niveauer er op- eller nedreguleret i en fysiologisk område (figur 4; ^22).

dyrkningsbeholder	Ca.. Område (per brønd)	Volumen af 10 mikrogram / ml laminin
35 mm skål	10 cm 2	1 ml
60 mm skål	20 cm 2	2 ml
100 mm skål	60 cm 2	4 ml
24-brønds plade	2 cm 2	200 pl / brønd
plade med 12 brønde	4 cm 2	500 pl / brønd
plade med 6 brønde	10 cm 2	1 ml / brønd
T25	25 cm 2	3 ml
T75	75 cm 2	5 ml

Tabel 1. Anbefalede minimum Mængden af laminin-DPBS Solution (10 ug / ml) i Coating Kultur Surface.

	Specifik aktivitet / Mol masse	slutkoncentration	Masse eller volumen nødvendig for 10 ml løsning
collagenase D	0,15 U / mg	10 mg / ml (1,5 U / ml)	100 mg
dispase II	0,5 U / mg	4,8 mg / ml (2,4 U / ml)	48 mg
250 mM CaCl2	110.98 G / mol	2,5 mM	100 pi

Tabel 2. enzympræparat til Muscle fordøjelse.

Figur 1. Grafisk Abstrakt sammenfatter trinene, i protokollen. Dissociation af human muskel biopsi med en saks eller med en kirurgisk skalpel (I). Inkubering med den enzymatiske opløsning ved 37 ° C i 30 - 40 min (II). Ende af fordøjelse gennem tilsætning vækstmedier og filtrering af opløsningen gennem et 70 um membranfilter I et centrifugeglas (III). Centrifugering ved 443 xg i 5 min (IV). Bortkastning af supernatanten og resuspendering i vækstmedier indeholdende 2,5 ng / mL FGF (V). Udpladning af cellerne på et fad overtrukket med 1081 g / ml laminin og ændre mediet efter 24 timer (VI). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Myoblaster Isoleret fra Muscle af Voksen og Aged Mennesker på forskellige passager. A. Billeder repræsenterer myoblaster isoleret fra extensor digitorum brevis, tibialis anterior eller bortføreren halluces muskler kvindelige patienter (voksne: 30 ± 2,8 år, alderen: 69 ± 5 år gamle, BMI <25). Ved passage 0 og efter 5 dage for at blive belagt, celler er stadig rund og små, men synlige under lyse lysmikroskop (A). Myoblaster vil derefter vedtage en aflang form, som vist ved passage 2 (A). MyoD udtrykkes i myoblaster, men ikke i fibroblaster (B). Kvantificering af MyoD-positive celler er vist; fejlsøjler viser standardafvigelse; n = 3 (B). Repræsentativt billede demonstrere forskellene mellem myoblast og fibroblast morfologi (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Menneskelige Primære Myoblaster kan karakteriseres Brug af forskellige farvningsteknikker. Cellernes levedygtighed kan visualiseres ved anvendelse farvning for cellelevedygtighedsassays, kan proliferation vurderes ved anvendelse Ki67-immunfarvning, kan differentiering vurderes ved anvendelse MF20 (myosin tung kæde) immunfarvning og senescens kan visualiseres ved hjælp senescens associeret beta galactosidase (SA-β-galactosidase ) farvning. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Menneskelige Primære Myoblaster kan bruges for Funktionelle studier af Muscle Homeostase In Vitro. A. MF20 (myosin tung kæde) immunfarvning af differentierede primære myorør fra voksne mennesker, der viser virkningerne af overekspression eller inhibering af MIR-378 på myotube størrelse og antal. B. qPCR viser relative udtryk for miR-378 og IGF1R, valideret miR-378 target gen, efter miR-378 overekspression eller hæmning i humane primære myoblaster. Ekspression i forhold til Rnu-6 og β-2-mikroglobulin henholdsvis er vist. Fejl søjler viser SEM; n = 3, * - p <0,05, Student T-test.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her præsenterer vi en enkel, robust, billig, reproducerbar og effektiv metode til at isolere muskel stamceller / primære myoblaster fra voksne og ældre mennesker fra extensor digitorium brevis, tibialis anterior eller bortføreren halluces muskler. Denne protokol er at tillade undersøgelser med humane primære myoblaster fra voksne og ældede mennesker, især når mere sofistikerede metoder, såsom FACS- eller MACS-sortering, er ikke er muligt eller praktisk.

Isoleringen metode præsenteres i dette håndskrift tager ca. 2 timer. Under muskel isolation, blev muskel vasket i 70% ethanol for at undgå forurening. Før enzymatisk dissociering af musklen, er det vigtigt at skære musklen i små men synlige stykker, og undgå celleskader fra for meget hakning. De fordøjelse resultater i dissociation af myofibre og frigivelse af satellit celler og myogene præcursorceller. I vores tilfælde for ~ 20 mg skeletmuskler, en 60 mm(20 ^cm2) petriskål var den mest passende overfladeareal til høst af cellerne. Celler udpladet på en større overflade udviste reduceret proliferation, hvorimod celler udpladet på en mindre overflade viste øget celledød og agglutinering.

Efter isolering, blev cellerne dyrket og ekspanderet på laminin-dækket plader. Anvendelsen af ​​ikke-coatede overflader tendens til at falde succes isolation. Af denne grund kan celler fortrinsvis høstet på et forud belagt overflade direkte efter isolation. Fibroblaster-berigede kulturer vil dominere i stedet myoblaster-afledte celler, hvis cellerne høstes på et ikke-belagte overflade direkte efter isolation. Bortset fra laminin, kan anvendes brugen af ​​andre cellevedhæftningsfaktorer løsninger såsom Matrigel og collagen-baserede reagenser. Coating løsninger kan omfatte vækstfaktorer og andre forbindelser, der vil fremme cellevækst, men disse kunne ændre cellens opførsel og derfor de eksperimentelle resultater. Ivores erfaring, 10 ug / ml laminin er den optimale koncentration og passende belægning reagens til satellit celler og myoblast vedhæftning og spredning, da det mangler enhver vækstfaktor eller andre komplementer. Desuden laminin er naturligt til stede i den basale lamina, direkte forbundet med sarcolemma, som spiller en central funktion i satellit cellebinding og migration gennem skeletmuskulatur fiber.

Tillæggene af kulturen medier kan også have en skadelig indflydelse på adfærden af ​​den primære myoblast. For eksempel vækstfaktor grupper, såsom FGF'er eller IGF'er, har pleiotrope virkninger på primær myoblast kulturer, med FGF-2 styrer både mitogen og programmeret celledød svar ^31. Det er derfor nødvendigt at strengt styre dyrkningsbetingelser, især fordi forskellene i adfærd primære myoblaster isoleret fra muskel af voksne og ældre mennesker er meget sandsynligt, at være på grund af renheden of kulturer og sandsynligheden for fibroblaster enden heraf myoblaster i kultur under langvarige kulturer ^35. Vi har anvendt 1 time før udpladning af cellerne under den første opdeling på et ikke-belagte overflade for at mindske kontamineringen af ​​kulturerne med fibroblaster.

Fremgangsmåden beskriver vi er hensigtsmæssig til isolering af myogene progenitorceller fra musklerne i både voksne og ældede mennesker. Den isolerede celle består af en repræsentativ myogene population af celler som indikeret ved en høj procentdel af myogene celler (MyoD ekspression og myogene egenskaber visualiseret ved MF20 immunofarvning i figur 1 og 2) og kan anvendes som en in vitro model for funktionelle studier af processer forbundet med muskel homeostase.

Tidligere undersøgelser har karakteriseret den isolation og forskelle i egenskaber, eller mangel på samme, af humane primære myoblaster fravoksen og ældre mennesker ^{6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 6, 37, 38.} Eksistensen af geriatriske og / eller ikke-funktionelle humane Middelhavspartnerlandene er påvist ^{6, 20, 22.} Men ingen forskel i opførslen af frisk isolerede humane Middelhavspartnerlandene har også vist sig, ^27. Vores protokol giver mulighed for isolering af primære myoblaster der i det mindste delvist bevarer deres fænotype, såsom reduceret proliferativ potentiale eller ældning af primære myoblaster isoleret fra muskel i ældre mennesker og tillader anvendelsen af ​​disseceller til funktionelle studier af molekylære mekanismer muskel homeostase under aldring ^22.

De primære myoblaster isoleret under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet her, kan anvendes ikke kun til myogene differentierings- studier, men også for at undersøge intracellulære ændringer, såsom ændringer i genekspression forekommer i humane myogene precursorceller under ældning. Men har brug for, forandringer, der sker i celler under langvarig ex vivo kultur, der skal overvejes, når man analyserer fænotypiske og genotypiske forandringer under ældning. Vi anbefaler at bruge frisk isolerede celler til dette formål.

Desuden primære myoblaster kultur her beskrevne fremgangsmåde giver mulighed for ekspansion og relativt langvarig dyrkning af humane primære myoblaster, der giver mulighed for robuste in vitro funktionelle undersøgelser. Vi har tidligere vist, at myogene progenitorceller isoleret ved hjælp af vores fremgangsmåde kan anvendes til både ekspression profilering og functional studier af processer i forbindelse med muskel aldring ^22. Denne metode kan også anvendes til musklerne i voksne og gamle gnavere og tillader isolering af en beriget kultur af myoblaster, der kan anvendes til profilering genetiske og epigenetiske ændringer under aldring og funktionelle studier ^22. Begrænsningerne ved denne fremgangsmåde indbefatter anvendelsen af, til en vis grad, blandet population af celler frem for en ren population af satellitceller, der kan opnås ved anvendelse mere sofistikerede publicerede fremgangsmåder ^{6, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43.}

Vi præsenterer en forenklet, overkommelige og reproducerbar protokol til isolering af primære myoblaster celler fra voksne og ældremennesker. Det er vores erfaring, de tilgængelige, mere sofistikerede metoder til isolering og dyrkning af humane primære myoblaster (såsom MACS- eller FACS-sorteret satellit celler) er ideelle til nogle typer af undersøgelser, såsom profilering transkriptom eller proteomiske forandringer i cellerne. Disse fremgangsmåder er dyre, kræver i det mindste nogle niveau af ekspertise, og kan vise sig vanskelig på grund af den lave proliferative sats af rene primære myoblast kulturer og fibroblaster tilgroning myoblaster.

Vi præsenterer en reproducerbar protokol, der tillader enkel isolering og dyrkning af humane primære myoblaster til anvendelse i funktionelle studier. Derudover foreslår vi brug af laminin ⁴² og den begrænsede brug af bFGF som væsentlige faktorer for en vellykket kultur ^44. Vi foreslår også at undgå stress genereret ved centrifugering, når opdele cellerne og en pre-plating skridt ad den første passage ^45. For at opsummere, vi haroptimeret en effektiv protokol til isolering og dyrkning af primære myoblaster / Middelhavspartnerlandene fra musklerne i voksne og ældre mennesker, der også gælder for musklerne i gnavere og muliggør udtryk og funktionelle studier af muskel homeostase.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dishes	Greiner Bio One	628160	Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS.
Cell culture plates (6-well)	Sigma-Aldrich	CLS3516	Corning Costar cell culture plates. 6-well, flat bottom (Individually wrapped) .
Cell culture plates (12-well)	Greiner bio-one	657 160	Cellstar Cell culture Multiwell Plates.
Culture flasks	Greiner Bio One	690175 (25 cm2); 658175 (75 cm2).	Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks.
Standard Disposable Scalpel	Granton	91310	Sterile stainless steel blade, pattern: 10.
Pipettes	Greiner bio-one	606 180 (5 mL); 607 180 (10 mL); 760 180 (25 mL)	Cellstar Serological Pipettes.
Pasteur plastic pipettes	Starlab	E1414-0311	3.0 mL Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped.
Syringe	BD	300613	20 mL BD eccentric tip syringe.
0.2 µm filters	Gilson	ALG422A	Sterile Syringe Filters CA 0.2 µm 33 mm Pk50.
Cell strainers	Fisher Scientific	11597522	Cell culture strainer sterile individually packed 70 µm polypropylene.
Collagenase D	Roche	11088882001	Collagenase D; Activity: ≥0.15 U/mg
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693	Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 U/mg solid.
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709	Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis
Laminin	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1 mg/mL.
DMEM-high glucose	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose. With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate.
F-12 media	Gibco	21765029	Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine.
FGF-b	PetroTech	100-18B	Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106	Fetal Bovine Serum.
Horse serum (HS)	Sigma-Aldrich	H1270	Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered.
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered.
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered.
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered.
TrypLE Express	Gibco	12604-013	TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red.
DPBS (cell culture)	Sigma-Aldrich	D8537	Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride.
PBS (immunostaining)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	Phosphate-buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4).
Methanol	Fisher	M/4000/PC17	Methanol Analytical Reagent Grade
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 for molecular biology.
anti-MF 20 antibody	DSHB	MF20-c 2ea 211 µg/ml.	MYH1E (MF 20) Mouse mAb.
anti-MyoD antibody	Cell Signaling Technology	13812P	MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb.
anti-Ki67 antibody	Abcam	ab16667	Rabbit mAb to Ki67 [SP6].
Anti-mouse 488 secondary antibody	Invitrogen	A-11029	Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.
Anti-rabbit 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11034	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.
DAPI	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich	DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)
Senescence β-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860	Senescence β-Galactosidase Staining kit.
DMSO	Sigma-Aldrich	41639	Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC).
Acridine Orange	Sigma-Aldrich	A8097	Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O.
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	Lipofectamine 2000 Transfection Reagent
Scramble control for transfections	Qiagen	1027271	miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol)
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay	Qiagen	218300	Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor	Qiagen	219300	Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC
Megafuge 2.0 R Centrifuge	Heraeus	75003085	n/a
Centrifuge rotor	Heraeus	3360	Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm.
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System	Nikon	n/a	Eyepieces: CFI 10X/22; Total magnification: 100X (MF20, Live/dead and Ki67).
Axiovert 200 inverted microscope	Carl Zeiss	n/a	Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25; Total magnification: 100X (Senescence β-Galactosidase Staining).
Axiovert 25 inverted microscope	Carl Zeiss	n/a	Eyepieces: E-PL 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope	Nikon	n/a	Eyepiece: CFWN 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).
Hydromount	National Diagnostics	HS-106	Hydromount

References

1. Hughes, V. A., et al. Longitudinal muscle strength changes in older adults: influence of muscle mass, physical activity, and health. J Gerontol A Biol Sci. 56, B209-B217 (2001).
2. Ryall, J. G., Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Cellular and molecular mechanisms underlying age-related skeletal muscle wasting and weakness. Biogerontology. 9, 213-228 (2008).
3. Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 12, 143-152 (2010).
4. Lexell, J., Taylor, C. C., Sjostrom, M. What is the cause of the ageing atrophy? Total number, size and proportion of different fiber types studied in whole vastus lateralis muscle from 15- to 83-year-old men. J Neurol Sci. 84, 275-294 (1988).
5. Grounds, M. D. Reasons for the degeneration of ageing skeletal muscle: a central role for IGF-1 signalling. Biogerontology. 3, 19-24 (2002).
6. Carlson, M. E., et al. Molecular aging and rejuvenation of human muscle stem cells. EMBO Mol Med. 1, 381-391 (2009).
7. Brown, D. M., Goljanek-Whysall, K. microRNAs: Modulators of the underlying pathophysiology of sarcopenia? Ageing Res Rev. 24, 263-273 (2015).
8. Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contraction-induced injury: recovery of skeletal muscles in young and old mice. Am J Physiol. 258, C436-C442 (1990).
9. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3639-3646 (2011).
10. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
11. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).
12. Brack, A. S., Rando, T. A. Intrinsic changes and extrinsic influences of myogenic stem cell function during aging. Stem cell Rev. 3, 226-237 (2007).
13. Kadi, F., Charifi, N., Henriksson, J. The number of satellite cells in slow and fast fibres from human vastus lateralis muscle. Histochem Cell Biol. 126, 83-87 (2006).
14. Verdijk, L. B., et al. Satellite cell content is specifically reduced in type II skeletal muscle fibers in the elderly. Am J Physiol Endocrinol Metab. 292, E151-E157 (2007).
15. Collins, C. A., Zammit, P. S., Ruiz, A. P., Morgan, J. E., Partridge, T. A. A population of myogenic stem cells that survives skeletal muscle aging. Stem cells. 25, 885-894 (2007).
16. Bortoli, S., et al. Gene expression profiling of human satellite cells during muscular aging using cDNA arrays. Gene. 321, 145-154 (2003).
17. Thalacker-Mercer, A. E., Dell'Italia, L. J., Cui, X., Cross, J. M., Bamman, M. M. Differential genomic responses in old vs. young humans despite similar levels of modest muscle damage after resistance loading. Physiol Genomics. 40, 141-149 (2010).
18. Jejurikar, S. S., et al. Aging increases the susceptibility of skeletal muscle derived satellite cells to apoptosis. Exp Gerontol. 41, 828-836 (2006).
19. McArdle, A., Dillmann, W. H., Mestril, R., Faulkner, J. A., Jackson, M. J. Overexpression of HSP70 in mouse skeletal muscle protects against muscle damage and age-related muscle dysfunction. FASEB J. 18, 355-357 (2004).
20. Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506, 316-321 (2014).
21. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. J Cell Biochem. 105, 663-669 (2008).
22. Soriano-Arroquia, A., McCormick, R., Molloy, A. P., McArdle, A., Goljanek-Whysall, K. Age-related changes in miR-143-3p:Igfbp5 interactions affect muscle regeneration. ageing cell. 15, 361-369 (2016).
23. Goljanek-Whysall, K., et al. Regulation of multiple target genes by miR-1 and miR-206 is pivotal for C2C12 myoblast differentiation. J Cell Sci. 125, 3590-3600 (2012).
24. Georgantas, R. W., et al. Inhibition of myogenic microRNAs 1, 133, and 206 by inflammatory cytokines links inflammation and muscle degeneration in adult inflammatory myopathies. Arthritis Rheumatol. 66, 1022-1033 (2014).
25. Sharples, A. P., Al-Shanti, N., Stewart, C. E. C2 and C2C12 murine skeletal myoblast models of atrophic and hypertrophic potential: relevance to disease and ageing? Journal of cellular physiology. 225, 240-250 (2010).
26. Hidestrand, M., et al. Sca-1-expressing nonmyogenic cells contribute to fibrosis in aged skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 566-579 (2008).
27. Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. ageing cell. 12, 333-344 (2013).
28. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. , (2015).
29. Pietrangelo, T., et al. Molecular basis of the myogenic profile of aged human skeletal muscle satellite cells during differentiation. Exp Gerontol. 44, 523-531 (2009).
30. Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp Cell Res. 174, 252-265 (1988).
31. Woods, K., Marrone, A., Smith, J. Programmed cell death and senescence in skeletal muscle stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. , 331-335 (2000).
32. Chakkalakal, J. V., Jones, K. M., Basson, M. A., Brack, A. S. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490, 355-360 (2012).
33. Cornelison, D. D., et al. Essential and separable roles for Syndecan-3 and Syndecan-4 in skeletal muscle development and regeneration. Genes & development. 18, 2231-2236 (2004).
34. Pisconti, A., Cornelison, D. D., Olguin, H. C., Antwine, T. L., Olwin, B. B. Syndecan-3 and Notch cooperate in regulating adult myogenesis. J Cell Biol. 190, 427-441 (2010).
35. Schafer, R., et al. Age dependence of the human skeletal muscle stem cell in forming muscle tissue. Artificial organs. 30, 130-140 (2006).
36. Castiglioni, A., et al. Isolation of progenitors that exhibit myogenic/osteogenic bipotency in vitro by fluorescence-activated cell sorting from human fetal muscle. Stem cell reports. 2, 92-106 (2014).
37. Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: differential modulation of myoblast markers by TGF-beta2. J Cell Physiol. 196, 70-78 (2003).
38. Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PloS one. 4, e5846 (2009).
39. Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 109, 735-744 (2001).
40. Gaster, M., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. Proliferation conditions for human satellite cells. The fractional content of satellite cells. APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 109, 726-734 (2001).
41. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods Mol Biol. 798, 21-52 (2012).
42. Chowdhury, S. R., et al. One-Step Purification of Human Skeletal Muscle Myoblasts and Subsequent Expansion Using Laminin-Coated Surface. Tissue engineering. Part C, Methods. 21, 1135-1142 (2015).
43. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal muscle. 1, 34 (2011).
44. Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. Fibro/adipogenic progenitors: a double-edged sword in skeletal muscle regeneration. Cell cycle. 9, 2045-2046 (2010).
45. Ciofani, G., et al. Hypergravity effects on myoblast proliferation and differentiation. J Biosci Bioeng. 113, 258-261 (2012).

Tags

Developmental Biology primære myoblaster muskel aldring regenerering microRNA menneske