Upprättande och kultur Myogenic prekursorceller / Primära myoblaster från skelettmuskulatur av vuxna och äldre människor

Summary

Detta protokoll beskriver en robust, reproducerbar och enkel metod för isolering och odling av myoblast progenitorceller från skelettmuskel av vuxna och äldre människor. De muskler som används här inkluderar fot- och benmusklerna. Detta tillvägagångssätt möjliggör isolering av en berikad population av primära myoblaster för funktionella studier.

Abstract

Skelettmuskel homeostas beror på muskeltillväxten (hypertrofi), atrofi och förnyelse. Under åldrande och i flera sjukdomar, sker muskelförtvining. Förlust av muskelmassa och funktion är associerad med muskelfibertypen atrofi, fibertyp växling, defekt muskelregenerering associerad med dysfunktion av satellitceller, muskelceller stamceller och andra patofysiologiska processer. Dessa förändringar är förknippade med förändringar i intracellulära samt lokala och systemiska nischer. I tillägg till de vanligaste gnagarmodeller av muskel åldrande, finns det ett behov att studera muskel homeostas och slösa med användning av humana modeller, som på grund av etiska konsekvenser, består främst av in vitro-kulturer. Trots den utbredda användningen av mänskliga myogenic stamceller (MPC) och primär myoblaster i myogenes finns begränsade uppgifter om användning av humana primära myoblast och myotube kulturer för att studera molekylära mekanismer som reglerar olika aspekter av åldersrelaterad muskel slöseri, medhjälp i validering av mekanismer för åldrande föreslås i gnagare muskel. Användningen av mänskliga Medelhavsländerna, primära myoblaster och myotuber isolerade från vuxna och äldre människor, ger en fysiologiskt relevant modell av molekylära mekanismer av processer i samband med muskeltillväxt, atrofi och förnyelse. Här beskriver vi i detalj en robust, billig, reproducerbar och effektiv protokoll för isolering och underhåll av mänskliga Medelhavsländerna och deras avkomma - myoblaster och myotuber från humana muskelprover med hjälp av enzymatisk nedbrytning. Dessutom har vi fastställt antal passage där primära myoblaster från vuxna och äldre människor genomgår åldrande i en in vitro-kultur. Slutligen visar vi förmågan att transfektera dessa myoblaster och förmågan att karakterisera deras proliferativa och differentieringskapacitet och föreslå deras lämplighet för att utföra funktionella studier av molekylära mekanismer myogenes och muskelförtvining in vitro.

Introduction

Sjukdoms- och åldersrelaterad progressiv förlust av skelett muskelmassa och funktion resulterar i svaghet, minskad styrka och minskad livskvalitet äldre människor. Skelettmuskulatur svarar för cirka 40% body mass ^1. Under åldrande och sjukdom, progressiv atrofi av individuella myofibers och nedsättning av muskel kvalitet på grund av infiltrationen av fett och fibros inträffar ^{en, två, tre, fyra, fem, sex.} Nyligen har det föreslagits att artspecifika skillnader i åldrande skelettmuskel inträffa, särskilt att muskelfiberförlust inträffar hos gnagare, inte kan förekomma i människor ^7. Ändå är de återstående muskelfibrer av åldern däggdjur som kännetecknas av ökad känslighet för skador och nedsatt förnyelse Vuxen muskel reparation och underhåll förmedlas av satellitceller ^{9, 10.} Vid muskelskada och andra relevanta ledtrådar, satellitceller blir aktiverade och föröka sig. En undergrupp av cellerna återvänder till vilotillståndet och resten fortskrider in i myoblaster (Myogenic progenitorceller - MPCs). Dessa bidrar till reparation av den befintliga myofiber ^11. Funktionaliteten av satellitceller avgör framgången av muskelregenerering och förändringarna i satellitcell tillgänglighet med åldrandet har visats ^{12, 13, 14, 15.} Dessutom satellitceller från muskel hos gamla människor och gnagare visar en transkriptionell profil switch och reducerad regenerativ potential ^{16, 17, 18, 19.} Satellitceller av muskel från gamla möss och människor har också visat att genomgå åldrande resulterar i sin reducerad funktionalitet ^20.

Den mest etablerad cellinje som möjliggör studier av muskel homeostas är murina C2C12 cellinje ^21. En betydande del av studier har också använt murina primära myoblaster ^22. Dessa kulturer har lett till en betydande förståelse för mus och ryggradsdjur myogenes liksom muskelregenerering, myotube / myofiber atrofi, och hypertrofi processer som sker under muskelsjukdom och åldrande ^{23, 24, 25, 26.} På senare tid har flera grupper som beskrivs med hjälp av humana primära myoblaster att studera myogenes och muskel åldrande. Men det är brist på samförstånd med regards till skillnader mellan primära myoblaster isolerade från muskeln av vuxna och åldrade människor ^{27, 28, 29, 30, 31.} Trots skillnader som kännetecknas i den systemiska och lokala miljön inträffar under utveckling, åldrande och sjukdom ^{6, 32, 33, 34,} i myoblast och myotube vitro kulturer fortfarande de mest tillgängliga verktyg för att studera molekylära mekanismer i samband med muskel utveckling, tillväxt och atrofi. Dessutom dessa studier ger inte bara en robust, men också en relativt snabbt, billigt och med hög genomströmning in vitro verktyg. Dessutom etiska konsekvenser i samband med studier av mänskliga muskler innebär att för funktionella försök med manipulationer av genuttryck

Här visar vi en enkel försöksprotokoll för robust, billig och reproducerbar isolering av primära myoblaster, eller MPC, från muskeln av vuxna och äldre människor och beskriva standardiserade villkor för odling in vitro (Figur 1). Som primära kulturer från muskler innehåller vanligtvis fibroblaster förutom myoblaster, rekommenderar vi en preplating steg som syftar till förbättrad renhet och kvalitet på primär myoblaster. Sammanfattningsvis har vi etablerat ett protokoll som möjliggör effektiv och reproducerbar isolering, kultur och funktionella studier av berikade och funktionella Medelhavsländerna / primära myoblaster från skelettmuskel av vuxna och äldre människor.

Protocol

Alla experiment som involverar mänsklig vävnad beskrivs häri godkändes i förväg av University of Liverpool, Universitetssjukhuset Aintree sjukhus och South West Wales forskningsetiska kommittén (godkännande nr: 13 / WA / 0374) och experiment genomfördes i enlighet med god praxis vägledning. University of Liverpool agerade som etik sponsor för denna studie. Alla donatorer har gett informerat samtycke för inskrivning av denna studie. Musklerna isolerades från människor (BMI <25): vuxen: 30 ± 2,8 år gammal och åldras: 69 ± 5 år gammal.

1. Förberedelse för kultur

1. Beläggning av kultur ytor med laminin
   1. Bered en arbetslösning av 10 | ig / ml laminin i 1 x DPBS (Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning).
   2. Pipettera en minimal mängd laminin lösning för att fullständigt täcka den yta på vilken cellerna kommer att vara pläterad (tabell 1). Inkubera than odlingsskål minst 30 min i en fuktad 37 ° C, 5% _CO2 inkubator innan plätering cellerna. Hantera laminin försiktigt, undvika användning av virveln. Den verksamma lösningen enligt 10 mikrogram / ml laminin utspädd i DPBS kan lagras vid 4 ° C och återanvändas flera gånger.
   3. Använd en 60 mm (20 cm ²⁾ petriskål eller 2 brunnar i en platta med 6 brunnar (2 x 10 cm ²⁾ per ~ 18-19 mg skelettmuskulaturen till tallrik cellerna (5,50 x 10 ⁴ celler totalt). Utför cellräkning vid alla tillfällen då plätering celler för funktionella studier.
      OBS: Prover erhölls ursprungligen från fot operationer (extensor digitorum brevis, tibialis anterior eller kidnappare halluces muskler) av de kvinnliga patienter (vuxna: 30 ± 2,8 år gammal, åldern: 69 ± 5 år gammal, BMI <25).
2. Beredning av enzymatisk lösning
   1. Förbered 250 mM _CaCl2 arbetslösning: 277 mg lager _CaCl2 i 10 ml 1x DPBS. Filtrera den sålution med en 0,2 fim filtermembran och förvara vid 4 ° C.
   2. Bered en arbetslösning av 1,5 U / ml kollagenas D, 2,4 U / ml Dispase II och 2,5 mM _CaCl2 i serumfritt DMEM (Dulbeccos modifierade Eagles medium) (tabell 2).
   3. Blanda väl och filtrera den enzymatiska lösningen genom ett 0,2 | im filtermembran för sterilisering. Förbereda den enzymatiska lösning i förväg och frysa ned (-20 ° C) i alikvoter för framtida användning.

2. Tissue Uppslutning: Mekanisk och enzymatisk dissociation

1. Efter provtagning, hålla muskeln vid 4 ° C i DPBS tills matsmältningen. Förbered en minimivolym av 2 ml _{kollagenas-dispas-CaCl2-lösning} per 18 - 19 mg muskelvävnad och värm till 37 ° C före vävnadsdissociering.
2. Sänk ned muskelbiopsi kort i 70% etanol, tvätta med färska DPBS och placera vävnaden på en ny petriskål med 1 ml av enzymatisklösning.
3. Kasta så mycket fibrotisk och fettvävnad som möjligt och riva muskler snabbt men försiktigt i små men urskiljbara bitar (cirka> 0,5 mm ²⁾ med steril sax eller en kirurgisk skalpell (blad nr 10).
4. Överföra provet i en 50 ml rör med de återstående 1 ml av _{kollagenas-dispas-CaCl2.}
5. Inkubera vävnaden vid 37 ° C upp till 30 till 40 min. Flytta muskelvävnaden genom att försiktigt röra om röret var 5 - 10 min.
6. Belägga pipetter med material för att undvika vidhäftning av de frigjorda cellerna till plastväggarna hos de pipetter. Tillsätt 2 volymer steril tillväxtmedium, t ex 4 ml DMEM 20% FBS (fetalt bovint serum), 1% L-glutamin och 1% P / S (penicillin-streptomycin), för att stoppa digerering.
7. Pipett upp och ner flera gånger med en 5 ml pipett för att hjälpa frisättningen av cellerna från muskelfibrerna.
   OBS: Provet är oftast helt dissocierad på grund av sin ringa storlek. However om fragment av muskeln fortfarande använda en andra inkubation med de återstående bitar av muskler och med färsk enzymatisk lösning.
8. Filtrera muskeln lösningen genom ett 70 ^ m cellfilter över en 50 ml koniska rör. Tvätta de kvarvarande cellerna med mer media och filter genom silen.
9. Centrifugera vid 443 xg under 5 min vid RT för att pelletera cellerna. Kasta supernatanten försiktigt.
10. Lös pelleten in i F-12-medium (Hams F-12 Nutrient Mix), 20% FBS, 10% HS (Horse Serum), 1% P / S, 1% α-glutamin och 2,5 ng / ml av FGF-b ( rekombinant human basisk fibroblasttillväxtfaktor). Här använder 4 ml av media per 60 mm petriskål.

3. Sådd Celler

1. Samla odlingskärlet som tidigare belagts med 10 mikrogram / ml laminin från inkubatorn (avsnitt 1.1).
2. Försiktigt bort överskottet av laminin från odlingsskålen, och undvika att röra vid ytan (eller det kommer att störa proteinstrukturen). Tvättakulturen skålen med DPBS (tillval).
3. Plattan cellerna direkt på laminin belagda kärl och inkubera under 24 timmar i en fuktad 37 ° C, 5% _CO2 inkubator.
4. Visualisera cellerna under den ljusa fält mikroskop (100X total förstoring) följande dag. Runda små celler fäst till ytan och den kvarvarande skräp kan ses i odlingsmediet.
5. Byt till färska F-12-medium kompletterat med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin och 2,5 ng / ml av FGF-b.

4. Kultur och Aging av celler

1. Ändra media varje 2-3 d och dela cellerna så snart grupper av celler är synliga under mikroskop (100X total förstoring, exempelvis i figur 2, celler från äldre människor, passage 0, efter 7 d) för att undvika spontan differentiering.
2. Vid den första passagen (P1), ändra media till hög-glukos DMEM kompletterat med 20% FBS, 10% HS, 1%P / S, 1% α-glutamin. Undvika att använda FGF-b från denna punkt, såsom FGF är en potent mitogen och viktig faktor vid början av kulturen, men det kan främja fibroblast överväxt om de används längre i kultur.
3. För cell passage:
   1. Ta bort media och tvätta cellerna två gånger med DPBS.
   2. Lägga till en minimal volym av 0,25% EDTA-trypsin för att täcka ytan av cellerna. Skaka för att säkerställa att alla celler täcks av lösgör lösning, inkubera under 10 sekunder vid rumstemperatur, och ta bort den.
   3. Inkubera cellerna i en fuktad 37 ° C, 5% _CO2 inkubator under 3-5 min. Knacka försiktigt och kolla under starkt ljusmikroskop (100X total förstoring) att cellerna är avrundade men inte helt fristående från ytan. Om ingen förändring observeras i cellerna, inkubera i 5 mer min.
   4. Tillsätt 5 ml tillväxtmedium (hög glukos DMEM kompletterat med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin) för att samla upp cellerna, blandaväl och överföra celler med de nya medierna i en T75 kolv. Tvätta de återstående cellerna upprepande detta steg med en annan 5 mL tillväxtmedium (10 ml totalt för en T75-flaska).
   5. Att preplate (föredraget vid första passagen), inkubera cellerna i en fuktad 37 ° C, 5% _CO2 inkubator under 40 min. Samla in supernatanten med de celler som inte fäste och inkubera dem i ett nytt T75-flaska. Detta bör anrika kulturen i myoblaster, eftersom de flesta av de fibroblaster borde ha fäst i den första kolven.
4. Ändra media varje 2-3 d och dela upp cellerna 1 till 4 så fort de når 70% konfluens för maximalt utbyte.
5. För differentiering, när cellerna nådde 70-80% konfluens, ändra odlingsmediet till differentieringsmedium (DM): hög-glukos DMEM kompletterat med 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin. Cellerna bör differentieras inom 5-7 d beroende på kvalitet och renhet av myoblast culture.

5. Transfektioner protokoll

1. Seed 50000 celler / brunn i en 12-brunnsplatta för MF 20, åldrande och viabilitetsanalyser. Kultur celler på täckglas eller i en skål belagd med laminin. För Ki67 färgning, utsäde 25.000 celler / brunn i en 12-brunnars platta.
2. För transfektioner, följa tillverkarens förfarande med användning av 5 mikroliter av transfektionsreagens, 100 nM kontroll microRNA härma eller hämmare, 100 nM mikroRNA härma eller 100 nM mikroRNA inhibitor per brunn, med en total volym av 1 ml.
3. Byt till Differentiering Medium 6 timmar efter transfektion (hög-glukos DMEM kompletterat med 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin). För spridningsexperiment, färga cellerna 2 d efter transfektion; för åldrande, 7 d efter transfektion; och för MF20 färgning, sju dagar efter transfektion.

6. Immunfärgning av cellerna

1. Ki67, MyoD och MF 20 immunfärgning
   1. Förbered blocket 1 (10% HS och 0,1% Triton-X i PBS) och block 2 (10% HS och 0,05% Triton-X i PBS) lösningar. Använda 500 mikroliter av reagens per brunn under en 12-brunnars platta.
      OBS: Utför följande steg med hjälp av en shaker för inkuberingssteg.
   2. Ta bort materialet från cellerna.
   3. Skölj cellerna med PBS.
   4. Fixera cellerna med kall metanol under 10 minuter på en rocker.
   5. Avlägsna metanolen från cellerna och skölj 3x med PBS under 5 minuter varje gång.
   6. Lägg blocket en lösning och inkubera cellerna på en rocker vid RT under 1 h.
   7. Lägg till primär antikropp lösning: för Ki67 färgning, använd Rabbit mAb till Ki67 (1: 1000 utspädning i block 2); för MyoD använder MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb (1: 100 utspädning i block 2); MF 20 färgning, användning MYH1E (MF 20) primär antikropp (DSHB, 1: 1000 utspädning i block 2).
   8. Inkubera cellerna med den primära antikroppen under 1 timme (RT) och O / N (4 ° C) på en vippa.
   9. Samla in den primära AB (det kan återanvändas flera gånger om storöd vid 4 ° C).
   10. Skölj cellerna 3x med PBS, 5 min varje gång.
   11. Tillsätt en lämplig sekundär antikropp: för Ki67 eller MyoD färgning, get-anti-kanin-IgG (H + L) sekundär antikropp, Alexa Fluor 488-konjugat (1: 1000 spädning i PBS); för MF 20 färgning, get-anti-mus-IgG (H + L) sekundär antikropp, Alexa Fluor 488-konjugat (1: 1000 spädning i PBS).
   12. Linda plattan innehållande cellerna och inkubera sekundär antikropp under 2 h i mörker på en rocker vid RT.
   13. Skölj cellerna 3x med PBS i 5 min varje gång.
   14. Lägg DAPI-lösning (1: 1000 spädning i PBS) på cellerna och inkubera på rocker vid RT under 5-10 min.
   15. Skölj cellerna 3x med PBS i 5 min varje gång.
   16. Tillsätt 1 ml av färsk PBS.
   17. Montera cellerna på täckglas i monteringslösning eller försegla plattan innehållande cellerna i PBS med Parafilm för att undvika avdunstning.
   18. Lagra vid 4 ° C.
   19. Visualisera cellerna medfluorescensmikroskop så snart som möjligt (senast två veckor).
2. viabilitetsanalys
   1. Ta bort materialet från cellerna.
   2. Skölj cellerna i PBS.
   3. Lägg 1: 1000 etidiumbromid och en: 1000 akridinorange utspädd i PBS.
      Varning: Var försiktig och arbeta inom hälso- och säkerhetsföreskrifter - etidiumbromid är cancerframkallande.
   4. Linda plattan innehållande cellerna i färgningslösning och inkubera vid RT på vipparmen under 5 min.
   5. Ta bilder av cellerna med fluorescensmikroskop: gröna kanalen för akridinorange; röda kanalen för etidiumbromid.

Representative Results

MPCs / primära myoblaster bör vara synlig 24 h efter sådd på laminin-belagda ytan (figur 2). Cellerna bör anta en spindelliknande form och bör uttrycka MyoD fortfarande i passagen 4 (Figur 1A, B). Fibroblaster kan kännetecknas av sin stjärnliknande morfologi och frånvaro av uttryck av MyoD (Figur 1B, C). När cellerna är fästa på följande dag, bör media ersätts med färska bFGF media. Odlingsmedia bör bytas ut efter 48 timmar.

De representativa resultat som visas här och publicerade data från vårt laboratorium ²² syftar till att stödja vår isolering och odling protokoll och visar de olika tekniker som kan användas för funktionella studier av humana primära myoblaster. Myoblast spridning kan studeras med hjälp av Ki67 immunfärgning och lönsamhet med hjälp av staining för cellviabilitet analys (Figur 3). För olika behandling, bör odlingsmediet ändras till differentieringsmedia. Myotuber bör bildas i 5-7 d och vara myosin tung kedja positiva (Figur 3). Observera att myotube bildningen kan vara mindre effektiva när myoblaster isoleras från muskeln av äldre människor (Figur 3). Senescens (SA-β-galaktosidas) färgning kan också utföras för att fastställa procentandelen av åldrande celler i kulturen (figur 3). Vi observerade att med längre kulturer (Figur 3, passage 4), fler myoblaster isolerade från muskeln av äldre människor visar åldrande.

För funktionella studier, kan genen och mikroRNA expression manipuleras med användning av lipofila transfektionsreagens-förmedlad leverans av expressionsvektorer, siRNA, mikroRNA härmar och antimiRs (Figur 4). Detta möjliggör för 40 -70% transfektionseffektivitet med genen / mikroRNA nivåer som upp- eller nedregleras inom ett fysiologiskt intervall (Figur 4, ^22).

odlingskärl	Cirka. Område (per brunn)	Volym av 10 mikrogram / ml laminin
35 mm maträtt	10 cm 2	1 ml
60 mm skål	20 cm 2	2 ml
100 mm skål	60 cm 2	4 ml
24-brunnar	2 cm 2	200 pl / brunn
12-brunnar	4 cm 2	500 mikroliter / brunn
6-brunnar	10 cm 2	1 ml / brunn
T25	25 cm 2	3 ml
T75	75 cm 2	5 ml

Tabell 1. Rekommenderade minimi Volymerna av Laminin-DPBS Solution (10 | ig / ml) under Coating Culture yta.

	Specifik aktivitet / Molekylvikt	slutlig koncentration	Massa eller volym som behövs för 10 ml lösning
kollagenas D	0,15 U / mg	10 mg / ml (1,5 U / ml)	100 mg
dispas II	0,5 U / mg	4,8 mg / ml (2,4 U / ml)	48 mg
250 mM CaCl2	1100,98 g / mol	2,5 mm	100 mikroliter

Tabell 2. enzympreparat för Muscle matsmältningen.

Figur 1. Grafisk abstrakt Summera stegen i protokollet. Dissociation av den humana muskelbiopsi med sax eller med en kirurgisk skalpell (I). Inkubering med den enzymatiska lösningen vid 37 ° C under 30-40 min (II). Änden av digestion genom tillsats av tillväxtmedier och filtrering av lösningen genom ett 70 ^ m membranfilter in i ett centrifugrör (III). Centrifugering vid 443 xg under 5 min (IV). Kasta supernatanten och återsuspendering i tillväxtmedier innehållande 2,5 ng / ml FGF (V). Utstrykning av cellerna på ett fat belagd med 1081; ig / ml laminin och byta media efter 24 h (VI). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. myoblaster isolerade från Muscle av vuxna och äldre människor vid olika passager. A. Bilder representerar myoblaster isolerade från extensor digitorum brevis, tibialis anterior eller kidnappare halluces muskler kvinnliga patienter (vuxna: 30 ± 2,8 år gammal, åldern: 69 ± 5 år gammal, BMI <25). Vid passage 0 och efter 5 dagar efter att de pläterade, cellerna fortfarande runda och små, men synliga under den ljusa ljusmikroskop (A). Myoblaster kommer då att anta en avlång form, som visas vid passage 2 (A). MyoD uttrycks i myoblaster men inte i fibroblaster (B). Kvantifiering av MyoD-positiva celler visas; felstaplar visar standardavvikelse; n = 3 (B). Representativ bild som visar skillnaderna mellan myoblast och fibroblast morfologi (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. humana primära myoblaster kan karaktäriseras Använda olika färgningstekniker. Cellernas viabilitet kan visualiseras med hjälp av färgning för cell viabilitetsanalyser kan spridning bedömas med hjälp av Ki67 immunofärgning, kan differentiering bedömas med hjälp av MF20 (myosin tung kedja) immunofärgning och åldras kan visualiseras med åldrande samband betagalaktosidas (SA-β-galaktosidas ) färgning. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. humana primära myoblaster kan användas för funktionella studier av muskel Homeostasis in vitro. A. MF20 (myosin tung kedja) immunfärgning av differentierade primära myotuber från vuxna människor som visar effekterna av överuttryck eller hämning av MIR-378 på myotube storlek och antal. B. qPCR visar relativ uttryck av MIR-378 och Igf1r, validerade miR-378 målgen efter MIR-378 uttryck eller hämning i humana primära myoblaster. Expression i förhållande till Rnu-6 och β-2-mikroglobulin, respektive, visas. Felstaplar visar SEM; n = 3, * - p <0,05, Student T-test.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här presenterar vi en enkel, robust, billig, reproducerbar och effektiv metod för att isolera muskel progenitorceller / primära myoblaster från vuxna och äldre människor från extensor digitorium brevis, tibialis anterior eller kidnappare halluces muskler. Detta protokoll syftar till att möjliggöra studier med hjälp av humana primära myoblaster från vuxna och äldre människor, särskilt när mer sofistikerade metoder, såsom FACS- eller MACS sortering, är inte är möjligt eller praktiskt.

Metoden isolering som presenteras i detta manuskript tar ungefär 2 timmar. Under muskel isolering, var muskeln tvättas i 70% etanol för att undvika kontaminering. Före enzymatisk dissociation av muskeln, är det viktigt att skära muskeln i små men synliga bitar, och undvika cellskador från för mycket malning. De matsmältningen resulterar i dissociation av myofibers och frisläppandet av satellitceller och myogena prekursorceller. I vårt fall för ~ 20 mg skelettmuskulaturen, en 60 mm(20 cm ²⁾ Petri-skål var det lämpligaste ytarea för skörd av cellerna. Celler ströks ut på en större yta uppvisade minskad proliferering, medan celler ströks ut på en mindre yta visade ökad celldöd och agglutination.

Vid isolering, cellerna odlades och expanderat på laminin-täckta plattor. Användning av icke-belagda ytor tenderade att minska framgången av isolering. Av denna anledning, kan celler företrädesvis skördades på en i förväg belagd yta direkt efter isolering. Fibroblaster-berikade kulturer kommer att dominera i stället för myoblaster-härledda celler om cellerna skördas på en icke-belagd yta direkt efter isolering. Bortsett från laminin, kan användas vid användning av andra cellvidhäftnings lösningar såsom Matrigel och kollagenbaserade reagens. Beläggningslösningar kan inkludera tillväxtfaktorer och andra föreningar som kommer att främja celltillväxt, men dessa skulle kunna ändra cellbeteende och därför de experimentella resultaten. IVår erfarenhet är 10 mikrogram / ml laminin den optimala koncentrationen och lämplig beläggning reagens för satellitceller och myoblast fastsättning och spridning eftersom det saknar tillväxtfaktor eller andra komplement. Dessutom är laminin naturligt förekommer i den basala lamina, direkt kopplad till sarcolemma, som spelar en nyckelfunktion i satellitcellvidhäftning och migration genom skelettmuskulaturen fiber.

De tillskott av odlingsmedia kan också ha en skadlig inverkan på beteendet hos den primära myoblast. Till exempel tillväxtfaktor grupper, såsom FGF eller IGF, har pleiotropa effekter på primär myoblast kulturer, med FGF-2 styra både mitogen och programmerad celldöd svar ^31. Det är därför nödvändigt att noggrant kontrollera odlingsbetingelserna, i synnerhet på grund av skillnader i beteendet hos primär myoblaster isolerade från muskler av vuxna och äldre människor är mycket sannolikt att bero på renheten of kulturerna och sannolikheten för fibroblaster överskridande de myoblaster i odling under långa kulturer ^35. Vi har använt en-timmars för-plätering av cellerna under den första klyvningen på en icke-belagd yta i syfte att minska kontaminering av kulturerna med fibroblaster.

Den metod vi beskriver är lämpliga för att isolera myogenic stamceller från musklerna i både vuxna och äldre människor. Den isolerade cellen består av en representativ myogenic population av celler såsom indikeras av en hög procentandel av myogena celler (MyoD expression och myogena egenskaper kan visualiseras med MF20 immunofärgning i fig 1 och 2) och kan användas som en modell för funktionella studier av processer in vitro i samband med muskel homeostas.

Tidigare studier har präglat isolering och skillnader i egenskaper, eller brist på sådan, av humana primära myoblaster frånvuxna och äldre människor ^{6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 6, 37, 38.} Förekomsten av geriatriska och / eller icke-funktionell human MPCs har visats ^{6, 20, 22.} Däremot har ingen skillnad i beteendet hos nyligen isolerade mänskliga partnerländerna också visats ^27. Våra protokoll möjliggör för isolering av primära myoblaster som åtminstone delvis bibehåller sin fenotyp, såsom minskad proliferativ potential eller åldrandet av primär myoblaster isolerade från muskler av äldre människor och tillåter användning av dessaceller för funktionella studier av molekylära mekanismer för muskel homeostas under åldrande ^22.

De primära myoblaster isolerade med hjälp av den metod som beskrivs här kan användas inte bara för myogena differentieringsstudier utan också att undersöka intracellulära förändringar, såsom förändringar i genuttryck som förekommer i humana myogena prekursorceller under åldrandet. Men förändringar som sker i celler under förlängd ex vivo kultur måste beaktas när man analyserar fenotypiska och genotypiska förändringar som sker under åldrandet. Vi rekommenderar att du använder nyisolerade celler för detta ändamål.

Dessutom den primära myoblast odlingsmetoden som beskrivs här medger expansion och relativt långvarig odling av humana primära myoblaster, vilket möjliggör robusta funktionella studier in vitro. Vi har tidigare visat att myogenic stamceller som isolerats med hjälp av vår metod kan användas för både uttrycksprofilering och functional studier av processer i samband med muskel åldrande ^22. Denna metod är också tillämplig på musklerna i vuxna och gamla gnagare och möjliggör isolering av en berikad kultur av myoblaster som kan användas för profilering genetiska och epigenetiska förändringar under åldrande och funktionella studier ^22. Begränsningarna med denna metod innefattar användningen av, i viss utsträckning, blandad population av celler snarare än en ren population av satellitceller, som kan erhållas genom att använda mer sofistikerade publicerade metoder ^{6, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43.}

Vi presenterar en förenklad, prisvärda och reproducerbar protokoll för isolering av primära myoblaster celler från vuxna och äldremänniskor. I vår erfarenhet, tillgängliga, mer sofistikerade metoder för isolering och odling av humana primära myoblaster (t.ex. MACS- eller FACS-sorterade satellitceller) är idealiska för vissa typer av undersökningar, såsom profilering transcriptomic eller proteomik förändringar i cellerna. Men dessa metoder är dyra, kräver minst en viss nivå av kompetens, och kan visa sig vara svår på grund av den låga proliferativa hastigheten för rena primära myoblast kulturer och fibroblaster igenväxande myoblaster.

Vi presenterar en reproducerbar protokoll som möjliggör enkel isolering och odling av humana primära myoblaster för användning i funktionella studier. Dessutom föreslår vi användning av laminin ⁴² och den begränsade användningen av bFGF som nyckelfaktorer för en framgångsrik kultur ^44. Vi föreslår också att undvika den stress som genereras genom centrifugering vid delning av cellerna och en pre-plating steg i den första passagen ^45. För att summera, har vioptimerat ett effektivt protokoll för isolering och odling av primära myoblaster / MPCs från musklerna i vuxna och åldrade människor som också är tillämplig på musklerna i gnagare och möjliggör uttryck och funktionella studier av muskel homeostas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dishes	Greiner Bio One	628160	Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS.
Cell culture plates (6-well)	Sigma-Aldrich	CLS3516	Corning Costar cell culture plates. 6-well, flat bottom (Individually wrapped) .
Cell culture plates (12-well)	Greiner bio-one	657 160	Cellstar Cell culture Multiwell Plates.
Culture flasks	Greiner Bio One	690175 (25 cm2); 658175 (75 cm2).	Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks.
Standard Disposable Scalpel	Granton	91310	Sterile stainless steel blade, pattern: 10.
Pipettes	Greiner bio-one	606 180 (5 mL); 607 180 (10 mL); 760 180 (25 mL)	Cellstar Serological Pipettes.
Pasteur plastic pipettes	Starlab	E1414-0311	3.0 mL Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped.
Syringe	BD	300613	20 mL BD eccentric tip syringe.
0.2 µm filters	Gilson	ALG422A	Sterile Syringe Filters CA 0.2 µm 33 mm Pk50.
Cell strainers	Fisher Scientific	11597522	Cell culture strainer sterile individually packed 70 µm polypropylene.
Collagenase D	Roche	11088882001	Collagenase D; Activity: ≥0.15 U/mg
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693	Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 U/mg solid.
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709	Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis
Laminin	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1 mg/mL.
DMEM-high glucose	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose. With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate.
F-12 media	Gibco	21765029	Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine.
FGF-b	PetroTech	100-18B	Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106	Fetal Bovine Serum.
Horse serum (HS)	Sigma-Aldrich	H1270	Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered.
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered.
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered.
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered.
TrypLE Express	Gibco	12604-013	TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red.
DPBS (cell culture)	Sigma-Aldrich	D8537	Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride.
PBS (immunostaining)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	Phosphate-buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4).
Methanol	Fisher	M/4000/PC17	Methanol Analytical Reagent Grade
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 for molecular biology.
anti-MF 20 antibody	DSHB	MF20-c 2ea 211 µg/ml.	MYH1E (MF 20) Mouse mAb.
anti-MyoD antibody	Cell Signaling Technology	13812P	MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb.
anti-Ki67 antibody	Abcam	ab16667	Rabbit mAb to Ki67 [SP6].
Anti-mouse 488 secondary antibody	Invitrogen	A-11029	Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.
Anti-rabbit 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11034	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.
DAPI	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich	DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)
Senescence β-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860	Senescence β-Galactosidase Staining kit.
DMSO	Sigma-Aldrich	41639	Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC).
Acridine Orange	Sigma-Aldrich	A8097	Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O.
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	Lipofectamine 2000 Transfection Reagent
Scramble control for transfections	Qiagen	1027271	miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol)
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay	Qiagen	218300	Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor	Qiagen	219300	Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC
Megafuge 2.0 R Centrifuge	Heraeus	75003085	n/a
Centrifuge rotor	Heraeus	3360	Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm.
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System	Nikon	n/a	Eyepieces: CFI 10X/22; Total magnification: 100X (MF20, Live/dead and Ki67).
Axiovert 200 inverted microscope	Carl Zeiss	n/a	Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25; Total magnification: 100X (Senescence β-Galactosidase Staining).
Axiovert 25 inverted microscope	Carl Zeiss	n/a	Eyepieces: E-PL 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope	Nikon	n/a	Eyepiece: CFWN 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).
Hydromount	National Diagnostics	HS-106	Hydromount

References

1. Hughes, V. A., et al. Longitudinal muscle strength changes in older adults: influence of muscle mass, physical activity, and health. J Gerontol A Biol Sci. 56, B209-B217 (2001).
2. Ryall, J. G., Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Cellular and molecular mechanisms underlying age-related skeletal muscle wasting and weakness. Biogerontology. 9, 213-228 (2008).
3. Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 12, 143-152 (2010).
4. Lexell, J., Taylor, C. C., Sjostrom, M. What is the cause of the ageing atrophy? Total number, size and proportion of different fiber types studied in whole vastus lateralis muscle from 15- to 83-year-old men. J Neurol Sci. 84, 275-294 (1988).
5. Grounds, M. D. Reasons for the degeneration of ageing skeletal muscle: a central role for IGF-1 signalling. Biogerontology. 3, 19-24 (2002).
6. Carlson, M. E., et al. Molecular aging and rejuvenation of human muscle stem cells. EMBO Mol Med. 1, 381-391 (2009).
7. Brown, D. M., Goljanek-Whysall, K. microRNAs: Modulators of the underlying pathophysiology of sarcopenia? Ageing Res Rev. 24, 263-273 (2015).
8. Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contraction-induced injury: recovery of skeletal muscles in young and old mice. Am J Physiol. 258, C436-C442 (1990).
9. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3639-3646 (2011).
10. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
11. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).
12. Brack, A. S., Rando, T. A. Intrinsic changes and extrinsic influences of myogenic stem cell function during aging. Stem cell Rev. 3, 226-237 (2007).
13. Kadi, F., Charifi, N., Henriksson, J. The number of satellite cells in slow and fast fibres from human vastus lateralis muscle. Histochem Cell Biol. 126, 83-87 (2006).
14. Verdijk, L. B., et al. Satellite cell content is specifically reduced in type II skeletal muscle fibers in the elderly. Am J Physiol Endocrinol Metab. 292, E151-E157 (2007).
15. Collins, C. A., Zammit, P. S., Ruiz, A. P., Morgan, J. E., Partridge, T. A. A population of myogenic stem cells that survives skeletal muscle aging. Stem cells. 25, 885-894 (2007).
16. Bortoli, S., et al. Gene expression profiling of human satellite cells during muscular aging using cDNA arrays. Gene. 321, 145-154 (2003).
17. Thalacker-Mercer, A. E., Dell'Italia, L. J., Cui, X., Cross, J. M., Bamman, M. M. Differential genomic responses in old vs. young humans despite similar levels of modest muscle damage after resistance loading. Physiol Genomics. 40, 141-149 (2010).
18. Jejurikar, S. S., et al. Aging increases the susceptibility of skeletal muscle derived satellite cells to apoptosis. Exp Gerontol. 41, 828-836 (2006).
19. McArdle, A., Dillmann, W. H., Mestril, R., Faulkner, J. A., Jackson, M. J. Overexpression of HSP70 in mouse skeletal muscle protects against muscle damage and age-related muscle dysfunction. FASEB J. 18, 355-357 (2004).
20. Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506, 316-321 (2014).
21. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. J Cell Biochem. 105, 663-669 (2008).
22. Soriano-Arroquia, A., McCormick, R., Molloy, A. P., McArdle, A., Goljanek-Whysall, K. Age-related changes in miR-143-3p:Igfbp5 interactions affect muscle regeneration. ageing cell. 15, 361-369 (2016).
23. Goljanek-Whysall, K., et al. Regulation of multiple target genes by miR-1 and miR-206 is pivotal for C2C12 myoblast differentiation. J Cell Sci. 125, 3590-3600 (2012).
24. Georgantas, R. W., et al. Inhibition of myogenic microRNAs 1, 133, and 206 by inflammatory cytokines links inflammation and muscle degeneration in adult inflammatory myopathies. Arthritis Rheumatol. 66, 1022-1033 (2014).
25. Sharples, A. P., Al-Shanti, N., Stewart, C. E. C2 and C2C12 murine skeletal myoblast models of atrophic and hypertrophic potential: relevance to disease and ageing? Journal of cellular physiology. 225, 240-250 (2010).
26. Hidestrand, M., et al. Sca-1-expressing nonmyogenic cells contribute to fibrosis in aged skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 566-579 (2008).
27. Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. ageing cell. 12, 333-344 (2013).
28. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. , (2015).
29. Pietrangelo, T., et al. Molecular basis of the myogenic profile of aged human skeletal muscle satellite cells during differentiation. Exp Gerontol. 44, 523-531 (2009).
30. Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp Cell Res. 174, 252-265 (1988).
31. Woods, K., Marrone, A., Smith, J. Programmed cell death and senescence in skeletal muscle stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. , 331-335 (2000).
32. Chakkalakal, J. V., Jones, K. M., Basson, M. A., Brack, A. S. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490, 355-360 (2012).
33. Cornelison, D. D., et al. Essential and separable roles for Syndecan-3 and Syndecan-4 in skeletal muscle development and regeneration. Genes & development. 18, 2231-2236 (2004).
34. Pisconti, A., Cornelison, D. D., Olguin, H. C., Antwine, T. L., Olwin, B. B. Syndecan-3 and Notch cooperate in regulating adult myogenesis. J Cell Biol. 190, 427-441 (2010).
35. Schafer, R., et al. Age dependence of the human skeletal muscle stem cell in forming muscle tissue. Artificial organs. 30, 130-140 (2006).
36. Castiglioni, A., et al. Isolation of progenitors that exhibit myogenic/osteogenic bipotency in vitro by fluorescence-activated cell sorting from human fetal muscle. Stem cell reports. 2, 92-106 (2014).
37. Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: differential modulation of myoblast markers by TGF-beta2. J Cell Physiol. 196, 70-78 (2003).
38. Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PloS one. 4, e5846 (2009).
39. Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 109, 735-744 (2001).
40. Gaster, M., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. Proliferation conditions for human satellite cells. The fractional content of satellite cells. APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 109, 726-734 (2001).
41. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods Mol Biol. 798, 21-52 (2012).
42. Chowdhury, S. R., et al. One-Step Purification of Human Skeletal Muscle Myoblasts and Subsequent Expansion Using Laminin-Coated Surface. Tissue engineering. Part C, Methods. 21, 1135-1142 (2015).
43. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal muscle. 1, 34 (2011).
44. Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. Fibro/adipogenic progenitors: a double-edged sword in skeletal muscle regeneration. Cell cycle. 9, 2045-2046 (2010).
45. Ciofani, G., et al. Hypergravity effects on myoblast proliferation and differentiation. J Biosci Bioeng. 113, 258-261 (2012).

Tags

Utvecklingsbiologi primära myoblaster muskel åldrande regeneration microRNA mänsklig