Utarbeidelse og kultur myogenisk forloperceller / Primær myoblasts fra Skeletal Muscle of Adult og Gamle mennesker

Summary

Denne protokollen beskriver en robust, reproduserbar og enkel metode for isolering og kultur av myoblast stamceller fra skjelettmuskulatur av voksne og eldre mennesker. De musklene som brukes her inkluderer fot og leggmusklene. Denne tilnærmingen muliggjør isoleringen av en anriket populasjon av primære myoblaster for funksjonelle studier.

Abstract

Skjelettmuskulatur homeostase avhengig av muskelvekst (hypertrofi), atrofi og regenerering. Under aldring og i flere sykdommer oppstår muskelsvinn. Tap av muskelmasse og funksjon er assosiert med muskelfibertype atrofi, fibertype, defekte muskelregenerasjonenen forbundet med dysfunksjon av satellittceller, muskel stamceller og andre patofysiologiske prosesser. Disse endringene er knyttet til endringer i intracellulær samt lokale og systemiske nisjer. I tillegg til de vanlig anvendte gnagermodeller på muskel aldring, er det behov for å studere muskel homeostase og sløse med humane modeller, som på grunn av etiske implikasjoner, består hovedsakelig av in vitro kulturer. Til tross for den utstrakte bruken av menneskelige myogenisk stamceller (MPCS) og primær myoblasts i myogenesen, det er begrensede data på bruk av humane primære myoblast og myotube kulturer for å studere molekylære mekanismer som regulerer ulike sider av aldersrelatert muscle sløse, hjelpe til validering av mekanismer for aldring foreslått i gnager muskel. Bruken av menneskelige MPCS, primær myoblasts og myotubes isolert fra voksne og eldre mennesker, gir en fysiologisk relevant modell av molekylære mekanismer av prosesser knyttet til muskelvekst, atrofi og regenerering. Her beskriver vi i detalj en robust, billig, reproduserbar og effektiv protokoll for isolering og vedlikehold av humane MPCS og deres avkom - myoblaster og myotubes fra menneskelige muskelprøver ved enzymatisk oppslutning. Videre har vi bestemt passasjen nummeret som primær myoblasts fra voksne og eldre mennesker gjennomgå senescence i en in vitro kultur. Til slutt viser vi muligheten til å transfektere disse myoblaster og evnen til å karakterisere deres proliferative og differensiering kapasitet og foreslår at de er egnet for å utføre funksjonelle studier av molekylære mekanismer for myogenese og muskelsvinn in vitro.

Introduction

Sykdoms- og aldersrelatert progressivt tap av skjelettmuskelmasse og funksjon resultater i skrøpelighet, nedgang i styrke og reduksjon i livskvaliteten for eldre mennesker. Skjelettmuskulatur står for omtrent 40% body mass ^1. Under aldring og sykdom, progressiv atrofi av individuelle myofibers og reduksjon av muskel kvalitet på grunn av infiltrasjon av fett og fibrose forekommer ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Nylig er det blitt foreslått at artsspesifikke forskjeller i aldring av skjelettmuskulatur oppstår, nemlig at muskelfibertapet som forekommer i gnagere, ikke kan forekomme hos mennesker ^7. Likevel er de gjenværende muskelfibre av alderen pattedyr preget av økt mottakelighet for skade og nedsatt regenerering Voksen muskel reparasjon og vedlikehold formidles av satellitten celler ^{9, 10.} Ved muskelskader og andre relevante stikkord, satellitt celler blir aktivert og sprer. En undergruppe av celler som vender tilbake til hviletilstanden og resten utvikler seg inn i myoblaster (myogenisk progenitorceller - MPCS). Disse bidrar til å reparere den eksisterende myofiber ^11. Funksjonaliteten av satellitten celler avgjør suksessen til muskel regenerasjon og endringene i satellitt-celle tilgjengelighet med aldring er påvist ^{12, 13, 14, 15.} Videre har satellitt celler fra muskelen av gamle mennesker og gnagere viser en transkripsjonen profil bryter og redusert regenerative potensialet ^{16, 17, 18, 19.} Satellittceller av muskel fra gamle mus og mennesker har også vist seg å gjennomgå senescence resulterer i deres redusert funksjonalitet ^20.

Den mest etablert cellelinje som muliggjør studium av muskel homeostase er murine cellelinje C2C12 ^21. En betydelig mengde studier har også benyttet murine primære myoblaster ^22. Disse kulturene har ført til en betydelig forståelse av muse og virveldyr myogenesen samt muskel regenerasjon, myotube / myofiber atrofi, og hypertrofi prosesser som skjer i løpet av muskel sykdom og aldring ^{23, 24, 25, 26.} Mer nylig har flere grupper beskrevet ved hjelp av humane primære myoblasts å studere myogenesen og muskel aldring. Men det er mangel på enighet med regards til forskjellene mellom primær myoblaster isolert fra muskel av voksne og eldre mennesker ^{27, 28, 29, 30, 31.} Til tross for forskjeller karakterisert ved den systemiske og lokale miljø som oppstår under utvikling, aldring og sykdom ^{6, 32, 33, 34,} in vitro myoblast og myotube kulturer forblir de mest tilgjengelige verktøy for å studere molekylære mekanismer forbundet med muskelutvikling, vekst og atrofi. I tillegg er disse studiene gir ikke bare en robust, men også en forholdsvis rask, billig og med høy gjennomstrømning in vitro verktøyet. Videre etiske implikasjoner knyttet til studier av menneskelige muskler betyr at for funksjonelle eksperimenter som involverer manipulering av genekspresjon

Her viser vi en enkel forsøksprotokoll for robust, billig og reproduserbar isolering av primære myoblasts eller MPCS, fra muskel av voksne og eldre mennesker og beskrive standardiserte betingelser for in vitro kultur (figur 1). Som primærkulturer fra muskel inneholder vanligvis fibroblaster i tillegg til myoblasts, anbefaler vi en forhåndspålegg skritt med sikte på forbedret renhet og kvalitet av primære myoblasts. For å oppsummere, har vi etablert en protokoll som åpner for effektiv og reproduserbar isolasjon, kultur og funksjonelle studier av beriket og funksjonelle MPCS / primær myoblasts fra skjelettmuskulatur av voksne og eldre mennesker.

Protocol

Alle eksperimenter med menneskelig vev beskrevet her ble godkjent på forhånd av University of Liverpool, universitetssykehus Aintree sykehus og South West Wales forskningsetiske komité (Godkjenning No: 13 / WA / 0374) og eksperimenter ble utført i henhold til god praksis veiledning. The University of Liverpool fungerte som etikk sponse for denne studien. Alle givere har gitt informert samtykke for innmelding av denne studien. Musklene ble isolert fra mennesker (BMI <25): voksen: 30 ± 2,8 år gammel og alderen: 69 ± 5 år gammel.

1. Forberedelse for kultur

1. Coating av kultur flater med laminin
   1. Fremstille en arbeidsløsning av 10 ug / ml laminin i 1x DPBS (Dulbeccos fosfatbufret saltvann).
   2. Pipetter en minimal mengde av laminin løsning for fullstendig å dekke den overflate hvorpå cellene skal bli belagt (tabell 1). Inkuber than dyrkningsskål på minst 30 minutter i en fuktet 37 ° C, _5% CO2 inkubator før utplating av cellene. Håndtak laminin forsiktig, unngå bruk av virvelen. Arbeids oppløsning av 10 ug / ml laminin fortynnet i DPBS kan lagres ved 4 ° C og gjenbrukes flere ganger.
   3. Bruke en 60 mm (20 ^cm2) petriskål eller 2 brønner i en 6-brønns plate (2 x 10 cm ²⁾ per ~ 18 - 19 mg av skjelettmuskulatur til platen celler (5,50 x 10 ⁴ celler totalt). Utfør celletelling til enhver tid ved plating celler for funksjonelle studier.
      MERK: Prøver ble opprinnelig hentet fra fot operasjoner (extensor digitorum brevis, tibialis anterior eller bortfører halluces muskler) av kvinnelige pasienter (voksne: 30 ± 2,8 år gammel, i alderen: 69 ± 5 år gammel, BMI <25).
2. Utarbeidelse av enzymatisk løsning
   1. Forbered 250 mM CaCl ₂ fungerende løsning: 277 mg på lager CaCl ₂ i 10 ml 1x DPBS. Filtrer såning med et 0,2 mikrometer filter membran og oppbevares ved 4 ° C.
   2. Fremstille en arbeidsløsning av 1,5 U / ml kollagenase D, 2,4 U / mL av Dispase II og 2,5 mM _CaCl2 i serumfritt DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium) (tabell 2).
   3. Bland godt og filtrerer den enzymatiske løsningen gjennom et 0,2 um membranfilter for sterilisering. Fremstille den enzymatiske oppløsning på forhånd og fryse ned (-20 ° C) på alikvoter for fremtidig bruk.

2. Tissue Fordøyelse: Mekanisk og Enzymatisk Dissosiasjon

1. Etter prøvetaking, holde muskelen ved 4 ° C i DPBS til fordøyelsen. Fremstille et minimum volum av 2 ml _{kollagenase-dispase-CaCl2-oppløsning} pr 18 - 19 mg av muskelvev og varme den til 37 ° C før vev dissosiasjon.
2. Dypp muskelbiopsi kort i 70% etanol, vask med friske DPBS og plassere vevet på en ny petriskål med 1 ml enzymatiskløsning.
3. Kast så mye fibrotisk og fettvev som mulig og rive muskler raskt, men forsiktig i små, men skjelnes biter (ca.> 0,5 mm ²⁾ med steril saks eller en kirurgisk skalpell (blad nr 10).
4. Overføre prøven til et 50 ml rør med de resterende 1 ml av _{kollagenase-dispase-CaCl2.}
5. Inkuber vevet ved 37 ° C opp til 30 - 40 min. Beveg muskelvev ved forsiktig omrøring av røret hvert 5. - 10 min.
6. Smør pipetter med media for å unngå vedheft av de frigitte cellene til plast veggene av pipetter. Tilsett 2 volumdeler sterilt vekstmedium, f.eks, 4 ml DMEM 20% FBS (føtalt bovint serum), 1% L-glutamin og 1% P / S (Penicillin-Streptomycin), for å stoppe fordøyelse.
7. Pipet opp og ned flere ganger med en 5 ml pipette for å hjelpe utgivelsen av cellene fra muskelfibrene.
   MERK: Prøven er vanligvis helt dissosiert på grunn av sin lille størrelse. However, hvis fragmenter av muskler fortsatt, bruke en andre inkubasjon med de resterende delene av muskler og med frisk enzymatisk løsning.
8. Filtrer muskelen løsningen gjennom et 70 mikrometer celle sil over et 50 ml konisk rør. Vask de gjenværende celler med flere medier og filter gjennom silen.
9. Sentrifuger ved 443 xg i 5 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene. Kast supernatanten forsiktig.
10. Oppløs pelleten til F-12 media (Hams F-12 Nutrient Mix), 20% FBS, 10% HS (hesteserum), 1% P / S, 1% α-glutamin og 2,5 ng / ml FGF-b ( rekombinant human basic fibroblast Growth Factor). Her bruker 4 ml av media per 60 mm petriskål.

3. Seeding Celler

1. Samle kulturen fartøyet tidligere belagt med 10 ug / ml laminin fra inkubatoren (avsnitt 1.1).
2. Fjern forsiktig overskudd av laminin fra kulturen fatet, og unngå å berøre overflaten (eller det vil forstyrre proteinstruktur). vaskkultur fatet med DPBS (valgfritt).
3. Plate cellene direkte på laminin belagte fartøyet og inkuberes i 24 timer i en fuktet 37 ° C, _5% CO2 inkubator.
4. Visual cellene under lyse-feltet mikroskop (100X total forstørrelse) dagen etter. Runde små celler festet til overflaten, og den gjenværende rester kan sees i kulturmediet.
5. Endre medie til friske F-12 media supplert med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin og 2,5 ng / ml FGF-b.

4. Kultur og aging av celler

1. Endre media hver 2 - 3 d og splitte cellene så snart grupper av celler som er synlige under mikroskop (100X total forstørrelse, eksempelvis i figur 2, celler fra eldre mennesker, passasje 0, etter 7 d) for å unngå spontan differensiering.
2. Ved første passering (P1), endre medie til høy glukose DMEM supplert med 20% FBS, 10% HS, 1%P / S, 1% α-glutamin. Unngå bruk av FGF-b fra dette punkt, som FGF er et potent mitogen og viktig faktor ved begynnelsen av kulturen, men det kan fremme fibroblast overvekst hvis det brukes lengre tid i kultur.
3. For celle aging:
   1. Fjern media og vaske cellene to ganger med DPBS.
   2. Legge til et minimalt volum 0,25% EDTA-trypsin for å dekke overflaten av cellene. Rock forsiktig for å sikre at alle cellene er dekket av løsrivelse løsning, inkuberes i 10 sekunder ved romtemperatur, og fjerne det.
   3. Cellene inkuberes i en fuktet 37 ° C, _5% CO2 inkubator i 3 - 5 min. Trykk forsiktig og sjekk under sterkt lys mikroskop (100X total forstørrelse) at cellene er avrundet, men ikke helt løsrevet fra overflaten. Hvis ingen endring er observert i cellene inkuberes i 5 flere min.
   4. Tilsett 5 ml vekstmedium (høy-glucose DMEM supplert med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin) for å samle cellene, blandesgodt og overføre celler med nye medier i en T75 kolbe. Vask de gjenværende cellene gjentatte dette trinnet med en annen 5 ml vekstmedium (10 ml totalt for en T75-kolbe).
   5. For å preplate (fortrinnsvis ved den første passasje), inkuberes cellene i en fuktet 37 ° C, _5% CO2 inkubator i 40 min. Samle supernatanten med cellene som ikke fester og inkuber dem i en ny T75 kolbe. Dette bør berike kulturen i myoblaster, som de fleste av fibroblaster skulle ha festet i den første kolbe.
4. Skift media hver 2 - 3 d og splitte cellene 1 til 4, så snart de når 70% konfluens i maksimalt utbytte.
5. For differensiering, når cellene nådde 70 - 80% konfluens, endre kulturen medium til Differensiering Medium (DM): høy glukose DMEM supplert med 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin. Cellene bør differensieres innen 5 - 7 d avhengig av kvaliteten og renheten av myoblast cruk.

5. trans Protocol

1. Seed 50.000 celler / brønn i en 12-brønns plate for MF 20, senescence og levedyktighet analyser. Kultur cellene på dekkglass eller i en skål belagt med laminin. For Ki67 farging, frø 25.000 celler / brønn i en 12-brønns plate.
2. For transfections, følger produsentens prosedyren med 5 mL av transfeksjon reagens, 100 nM av kontroll mikroRNA ligne eller hemmer, 100 nM av mikroRNA ligne eller 100 nM av mikroRNA inhibitor per brønn, med et samlet volum på 1 ml.
3. Bytt til Differensiering Medium seks timer etter transfeksjon (høy glukose DMEM supplert med 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin). For spredning eksperimenter, beis cellene 2 d etter transfeksjon; for senescence, 7 dager etter transfeksjon; og for MF20 flekker, sju dager etter transfeksjon.

6. Farging av cellene

1. Ki67, myod og MF 20 farging
   1. Forbered blokk 1 (10% HS og 0,1% Triton-X i PBS) og blokk 2 (10% HS og 0,05% Triton-X i PBS) løsninger. Bruk 500 ul av reagens per brønn til en 12-brønns plate.
      MERK: Utfør følgende trinn ved hjelp av en shaker for ruge trinn.
   2. Fjern materialet fra cellene.
   3. Skyll cellene med PBS.
   4. Fest cellene med kald metanol i 10 min på en rocker.
   5. Fjerne metanolen fra cellene og skylles 3 ganger med PBS i 5 min hver gang.
   6. Legg til en blokk 1 løsning og inkuberes cellene på en vippe ved RT i 1 time.
   7. Legg primær antistoff løsning: for Ki67 flekker, bruker Rabbit mAb til Ki67 (1: 1000 fortynning i blokk 2); for myod bruke MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb (1: 100 fortynning i blokk 2); for MF 20 flekker, bruk MYH1E (MF 20) primært antistoff (DSHB, 1: 1000 fortynning i blokk 2).
   8. Cellene inkuberes med det primære antistoff i 1 time (RT) til O / N (4 ° C) på et vippe.
   9. Samle det primære AB (det kan brukes om igjen flere ganger hvis storød ved 4 ° C).
   10. Skyll cellene 3x med PBS, 5 minutter hver gang.
   11. Legg den aktuelle sekundære antistoff: for Ki67 eller myod flekker, geit anti-kanin IgG (H + L) sekundært antistoff, Alexa Fluor 488 konjugert (1: 1000 fortynning i PBS); for MF 20 farging, geit-anti-mus IgG (H + L), sekundært antistoff, Alexa Fluor 488 konjugat (1: 1000 fortynning i PBS).
   12. Pakk platen inneholdende cellene og inkuberes sekundært antistoff i 2 timer i mørke på en vippe ved RT.
   13. Rens cellene 3x med PBS i 5 min hver gang.
   14. Legg DAPI-løsning (1: 1000 fortynning i PBS) inn i cellene og inkuberes på vippe ved RT i 5 - 10 min.
   15. Rens cellene 3x med PBS i 5 min hver gang.
   16. Tilsett 1 ml frisk PBS.
   17. Montere cellene på dekkglass på monteringsløsning eller tette platen inneholdende cellene i PBS med Parafilm for å forhindre fordampning.
   18. Oppbevar ved 4 ° C.
   19. Visual cellene medfluorescens mikroskop så snart som mulig (senest 2 uker).
2. Livskraftig assay
   1. Fjern materialet fra cellene.
   2. Rens cellene i PBS.
   3. Tilsett 1: 1000 etidiumbromid og 1: 1000 akridinorange fortynnet i PBS.
      Advarsel: Vær forsiktig og arbeide innenfor helse- og sikkerhetsforskrifter - etidiumbromid er kreftfremkallende.
   4. Pakk platen inneholdende cellene i fargeløsning og inkuber ved romtemperatur på vippe i 5 min.
   5. Ta bilder av celler med fluorescens-mikroskop: grønn kanal for akridinorange; røde kanalen for etidiumbromid.

Representative Results

MPCS / primær myoblasts skal være synlig 24 timer etter seeding på laminin lakkert overflate (figur 2). Cellene bør vedta en spindel-lignende form og skal uttrykke myod fortsatt i passasjen 4 (Figur 1A, B). Fibroblaster kan være preget av sin stjernelignende morfologi og manglende uttrykk for myod (figur 1B, C). Når cellene er festet på neste dag, bør media byttes ut med friske bFGF media. De kulturmedier bør byttes hver 48. time.

De representative resultater er vist her, og publiserte data fra vårt laboratorium ²² formål å støtte vår isolasjon og kultur-protokoll og demonstrere de forskjellige teknikker som kan brukes for funksjonelle studier av humane primære myoblaster. Myoblast spredning kan studeres ved hjelp av Ki67 farging og levedyktighet ved hjelp staining for celleviabilitet analysen (figur 3). For differensiering, bør kulturmediet endres til differensierings media. Myotubes bør danne i 5-7 d og være myosin tung kjede positive (figur 3). Merk at myotube formasjonen kan være mindre effektiv når myoblasts er isolert fra muskel av eldre mennesker (figur 3). Senescens (SA-β-galaktosidase) flekker kan også utføres for å etablere prosentandelen av senescent celler i kultur (figur 3). Vi har observert at med lengre kulturer (figur 3, passasje 4), flere myoblaster isolert fra muskel av eldre mennesker viser begynnende alderdom.

For funksjonelle studier, kan genet og mikroRNA ekspresjon bli manipulert ved hjelp av lipofile transfeksjon reagenser-mediert levering av ekspresjonsvektorer, sirnas, mikroRNA etterligner og antimiRs (figur 4). Dette gjør det mulig for 40 -70% transfeksjonseffektivitet med genet / mikroRNA nivå er opp- eller ned-reguleres innenfor et fysiologiske området (figur 4; ^22).

dyrkings-beholderen	Ca. Area (per brønn)	Volum på 10 mikrogram / ml laminin
35 mm fatet	10 cm 2	1 ml
60 mm fatet	20 cm 2	2 mL
100 mm fatet	60 cm 2	4 mL
24-brønns plate	2 cm 2	200 ul / brønn
12-brønns plate	4 cm 2	500 ul / brønn
6-brønns plate	10 cm 2	1 mL / brønn
T25	25 cm 2	3 mL
T75	75 cm 2	5 mL

Tabell 1. Anbefalt minimum Volumene av Laminin-DPBS Solution (10 mikrogram / ml) for Coating Kultur Surface.

	Spesifikk aktivitet / Molar masse	endelig Konsentrasjon	Masse eller volum som er nødvendig for 10 ml løsning
Collage D	0,15 U / mg	10 mg / ml (1,5 U / ml)	100 mg
dispase II	0,5 U / mg	4,8 mg / ml (2,4 U / ml)	48 mg
250 mM CaCl2	1100,98 g / mol	2,5 mm	100 mL

Tabell 2. Enzyme Forberedelse for Muscle fordøyelse.

Figur 1. Grafisk Abstract Oppsummering trinnene i protokollen. Dissosiasjon av den menneskelige muskelbiopsi med saks eller med en kirurgisk skalpell (I). Inkubasjon med enzymoppløsningen ved 37 ° C i 30 - 40 min (II). Slutten av fordøyelsen gjennom tilsetning av vekstmedier og filtrering av oppløsningen gjennom et 70 um membranfilter inn i et sentrifugerør (III). Sentrifugering ved 443 xg i 5 min (IV). Kassering av supernatanten og resuspendering i vekstmedier inneholdende 2,5 ng / ml FGF (V). Plating cellene på en tallerken dekket med 1081; g / ml laminin og endring av mediet etter 24 h (VI). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. myoblasts Isolerte fra Muscle of Adult og Gamle mennesker på forskjellige deler. A. Bilder representerer myoblasts isolert fra extensor digitorum brevis, tibialis anterior eller bortfører halluces musklene kvinnelige pasienter (voksne: 30 ± 2,8 år gammel, i alderen: 69 ± 5 år, BMI <25). Ved passering 0 og etter 5 dager for å bli belagt, celler er fortsatt rund og liten, men synlig under sterkt lys mikroskop (A). Myoblaster vil da innta en langstrakt form, som vist ved passasje 2 (A). Myod er uttrykt i myoblaster, men ikke i fibroblaster (B). Kvantifisering av myod-positive celler er vist; feilfelt viser standardavvik; n = 3 (B). Representative bilde som viser forskjellene mellom myoblast og fibroblast morfologi (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. humane primære myoblasts kan karakteriseres ved hjelp av forskjellige fargeteknikker. Levedyktighet av cellene kan bli visualisert ved hjelp av farging for celleviabilitet analyser, kan spredning vurderes ved hjelp av Ki67-immunfarging, kan differensiering vurderes ved hjelp av MF20 (myosin tung kjede) farging og begynnende alderdom kan visualiseres ved hjelp av begynnende alderdom forbundet beta-galaktosidase (SA-β-galaktosidase ) farging. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. humane primære myoblasts kan brukes for funksjonelle studier av Muscle Homeostase In Vitro. A. MF20 (myosin tung kjede) farging av differensierte primære myotubes fra voksne mennesker som viser virkningene av overekspresjon eller inhibering av MIR-378 på myotube størrelse og antall. B. qPCR viser relative uttrykk for MIR-378 og Igf1r, validert Mir-378 mål genet, etter MIR-378 overekspresjon eller hemning i humane primære myoblasts. Ekspresjon i forhold til Rnu-6 og β-2-mikroglobulin, henholdsvis, er vist. Feilsøylene viser SEM; n = 3, * - p <0,05, Student t-test.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her presenterer vi en enkel, robust, billig, reproduserbar og effektiv metode for å isolere muskelstamceller / primær myoblasts fra voksne og eldre mennesker fra extensor digitorium brevis, tibialis anterior eller bortfører halluces muskler. Denne protokollen har som mål å tillate studier med humane primære myoblaster fra voksne og eldre mennesker, særlig når mer sofistikerte metoder, slik som FACS- eller MACS-sortering, er ikke mulig eller praktisk.

Isoleringsfremgangsmåten presentert i dette manuskriptet tar omtrent 2 timer. Under muskel isolering, ble muskelen vasket i 70% etanol for å unngå forurensning. Forut for enzymatisk dissosiasjon av muskelen, er det viktig å skjære muskelen i små, men synlige biter, og unngå celleskader fra for mye hakking. Fordøyelsen resultater i dissosiasjon av myofibers og utgivelsen av satellittceller og myogeniske forløper celler. I vårt tilfelle for ~ 20 mg av skjelettmuskulatur, en 60 mm20 cm ⁽²⁾ Petriskål var den mest hensiktsmessige overflateareal for innhøsting av cellene. Celler belagt på en større flate viste redusert spredning, mens cellene sådd ut på en mindre flate viste økt celledød og agglutinasjon.

Etter isolering, ble cellene dyrket og ekspandert på laminin-dekket platene. Bruken av ikke-belagte overflater tendens til å redusere suksess for isolasjon. Av denne grunn kan cellene bli høstet fortrinnsvis på et forhåndsbelagt overflate direkte etter isolering. Fibroblaster-anrikede kulturer vil dominere i stedet for myoblaster-avledede celler hvis cellene høstes på en ikke-belagt overflate direkte etter isolering. Bortsett fra laminin, kan bruk av andre cellefesting løsninger som Matrigel og kollagenbaserte reagenser anvendes. Belegningsløsninger kan omfatte vekstfaktorer og andre forbindelser som vil fremme cellevekst, men disse kan forandre cellens oppførsel, og derfor de eksperimentelle resultatene. IVår erfaring er 10 mikrogram / ml laminin optimal konsentrasjon og riktig belegg reagens for satellittceller og myoblast vedlegg og spredning som det mangler noen vekstfaktor eller andre utfyller. Videre er laminin naturlig tilstede i basal lamina, direkte knyttet til sarcolemma, som spiller en nøkkelfunksjon i satellitt-celle vedlegg og migrasjon gjennom skjelettmuskelfiber.

De tilskudd av kulturmedier kan også ha en negativ innvirkning på oppførselen til den primære myoblast. For eksempel vekstfaktorgrupper, slik som FGF eller IGF, har pleiotropiske virkninger på primærkulturer myoblast, med FGF-2 kontrollere både mitogen og programmert celledød respons ^31. Det er derfor nødvendig å nøye kontrollere dyrkingsbetingelsene, særlig fordi forskjellene i oppførselen av primære myoblaster isolert fra muskel av voksne og eldre mennesker er svært sannsynlig å være på grunn av renheten of kulturer og sannsynligheten for fibroblaster overfyller myoblasts i kultur under langsiktig kulturer ^35. Vi har benyttet en time pre-plating av cellene i løpet av den første splitte på en ikke-belagt overflate for å minske forurensning av kulturene med fibroblaster.

Metoden beskriver vi er egnet for å isolere myogeniske progenitorceller fra musklene i både voksne og eldre mennesker. Det isolerte celle består av en representant myogenisk populasjon av celler som vist med en høy prosentandel av myogeniske celler (myod uttrykk og myogeniske egenskaper visualisert ved MF20 immunfarging i figur 1 og 2) og kan bli brukt som en in vitro modell for funksjonelle studier av fremgangsmåter forbundet med muskel homeostase.

Tidligere studier har preget isolasjon og forskjeller i egenskaper, eller mangel på sådan, av humane primære myoblasts fravoksne og eldre mennesker ^{6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 6, 37, 38.} Eksistensen av geriatrisk og / eller ikke-fungerende humane MPCS er blitt demonstrert ^{6, 20, 22.} Imidlertid har ingen forskjell i oppførselen til nylig isolerte humane MPCS også blitt vist ^27. Vår protokollen tillater for isolering av primære myoblaster som i det minste delvis beholder sin fenotype, for eksempel redusert proliferativ potensial eller senescens av primære myoblaster isolert fra muskel av eldre mennesker og tillater anvendelse av disseceller for funksjonelle studier av molekylære mekanismer for muskel homeostase under aldring ^22.

Den primære myoblasts isolert ved hjelp av metoden beskrevet her kan brukes ikke bare for myogeniske differensiering studier, men også for å undersøke intracellulære endringer, for eksempel endringer i genuttrykk som forekommer i menneske myogeniske forløper celler under aldring. Men endringene som skjer i cellene under langvarig ex vivo kultur må vurderes når analysere fenotypiske og genotypiske endringer som skjer under aldring. Vi anbefaler at du bruker nylig isolerte celler for dette formålet.

Videre er det primære myoblast dyrkningsmetode som er beskrevet her gjør det mulig for ekspansjon og relativt langvarig kultur av humane primære myoblaster, slik at for robuste funksjonelle studier in vitro. Vi har tidligere vist at myogeniske stamceller isolert ved hjelp av vår metode kan brukes til både uttrykk profilering og fulione studier av prosesser knyttet til muskel aldring ^22. Denne fremgangsmåte er også anvendelig til musklene i voksen og gamle gnagere og gir mulighet for isolering av en anriket kultur av myoblaster som kan benyttes for profilering genetiske og epigenetiske endringer under aldring og funksjonelle studier ^22. Begrensningene ved denne metoden omfatter bruken av, til en viss grad, blandet populasjon av celler i stedet for en ren populasjon av satellitten celler, noe som kan oppnås ved bruk av mer sofistikerte publiserte metoder ^{6, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43.}

Vi presenterer en forenklet, rimelig og reproduserbar protokoll for isolering av primære myoblasts celler fra voksne og eldremennesker. Vår erfaring er tilgjengelige, mer sofistikerte metoder for isolering og kultur av humane primære myoblasts (som MACS- eller FACS-sortert satellittceller) er ideelle for noen typer studier, for eksempel profilering transcriptomic eller proteomikk forandringer i cellene. Men disse fremgangsmåter er kostbare, krever i det minste noen grad av ekspertise, og kan vise seg å være vanskelig på grunn av den lave proliferative hastighet av rene primære myoblast kulturer og fibroblaster voksningen myoblaster.

Vi presenterer en reproduserbar protokoll som tillater enkel isolering og kultur av humane primære myoblaster for anvendelse ved funksjonelle studier. I tillegg foreslår vi bruk av laminin ⁴² og begrenset bruk av bFGF som nøkkelfaktorer for en vellykket kultur ^44. Vi foreslår også å unngå stress generert ved sentrifugering når splitte cellene og en pre-plating trinnet ved første passering ^45. For å oppsummere, vi haroptimalisert en effektiv protokoll for isolering og kultur av primære myoblaster / MPCS fra muskler av voksne og eldre mennesker, som er også anvendelig til musklene i gnagere og muliggjør ekspresjon og funksjonelle studier av muskel homeostase.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dishes	Greiner Bio One	628160	Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS.
Cell culture plates (6-well)	Sigma-Aldrich	CLS3516	Corning Costar cell culture plates. 6-well, flat bottom (Individually wrapped) .
Cell culture plates (12-well)	Greiner bio-one	657 160	Cellstar Cell culture Multiwell Plates.
Culture flasks	Greiner Bio One	690175 (25 cm2); 658175 (75 cm2).	Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks.
Standard Disposable Scalpel	Granton	91310	Sterile stainless steel blade, pattern: 10.
Pipettes	Greiner bio-one	606 180 (5 mL); 607 180 (10 mL); 760 180 (25 mL)	Cellstar Serological Pipettes.
Pasteur plastic pipettes	Starlab	E1414-0311	3.0 mL Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped.
Syringe	BD	300613	20 mL BD eccentric tip syringe.
0.2 µm filters	Gilson	ALG422A	Sterile Syringe Filters CA 0.2 µm 33 mm Pk50.
Cell strainers	Fisher Scientific	11597522	Cell culture strainer sterile individually packed 70 µm polypropylene.
Collagenase D	Roche	11088882001	Collagenase D; Activity: ≥0.15 U/mg
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693	Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 U/mg solid.
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709	Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis
Laminin	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1 mg/mL.
DMEM-high glucose	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose. With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate.
F-12 media	Gibco	21765029	Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine.
FGF-b	PetroTech	100-18B	Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106	Fetal Bovine Serum.
Horse serum (HS)	Sigma-Aldrich	H1270	Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered.
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered.
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered.
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered.
TrypLE Express	Gibco	12604-013	TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red.
DPBS (cell culture)	Sigma-Aldrich	D8537	Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride.
PBS (immunostaining)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	Phosphate-buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4).
Methanol	Fisher	M/4000/PC17	Methanol Analytical Reagent Grade
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 for molecular biology.
anti-MF 20 antibody	DSHB	MF20-c 2ea 211 µg/ml.	MYH1E (MF 20) Mouse mAb.
anti-MyoD antibody	Cell Signaling Technology	13812P	MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb.
anti-Ki67 antibody	Abcam	ab16667	Rabbit mAb to Ki67 [SP6].
Anti-mouse 488 secondary antibody	Invitrogen	A-11029	Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.
Anti-rabbit 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11034	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.
DAPI	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich	DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)
Senescence β-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860	Senescence β-Galactosidase Staining kit.
DMSO	Sigma-Aldrich	41639	Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC).
Acridine Orange	Sigma-Aldrich	A8097	Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O.
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	Lipofectamine 2000 Transfection Reagent
Scramble control for transfections	Qiagen	1027271	miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol)
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay	Qiagen	218300	Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor	Qiagen	219300	Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC
Megafuge 2.0 R Centrifuge	Heraeus	75003085	n/a
Centrifuge rotor	Heraeus	3360	Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm.
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System	Nikon	n/a	Eyepieces: CFI 10X/22; Total magnification: 100X (MF20, Live/dead and Ki67).
Axiovert 200 inverted microscope	Carl Zeiss	n/a	Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25; Total magnification: 100X (Senescence β-Galactosidase Staining).
Axiovert 25 inverted microscope	Carl Zeiss	n/a	Eyepieces: E-PL 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope	Nikon	n/a	Eyepiece: CFWN 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).
Hydromount	National Diagnostics	HS-106	Hydromount

References

1. Hughes, V. A., et al. Longitudinal muscle strength changes in older adults: influence of muscle mass, physical activity, and health. J Gerontol A Biol Sci. 56, B209-B217 (2001).
2. Ryall, J. G., Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Cellular and molecular mechanisms underlying age-related skeletal muscle wasting and weakness. Biogerontology. 9, 213-228 (2008).
3. Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 12, 143-152 (2010).
4. Lexell, J., Taylor, C. C., Sjostrom, M. What is the cause of the ageing atrophy? Total number, size and proportion of different fiber types studied in whole vastus lateralis muscle from 15- to 83-year-old men. J Neurol Sci. 84, 275-294 (1988).
5. Grounds, M. D. Reasons for the degeneration of ageing skeletal muscle: a central role for IGF-1 signalling. Biogerontology. 3, 19-24 (2002).
6. Carlson, M. E., et al. Molecular aging and rejuvenation of human muscle stem cells. EMBO Mol Med. 1, 381-391 (2009).
7. Brown, D. M., Goljanek-Whysall, K. microRNAs: Modulators of the underlying pathophysiology of sarcopenia? Ageing Res Rev. 24, 263-273 (2015).
8. Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contraction-induced injury: recovery of skeletal muscles in young and old mice. Am J Physiol. 258, C436-C442 (1990).
9. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3639-3646 (2011).
10. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
11. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).
12. Brack, A. S., Rando, T. A. Intrinsic changes and extrinsic influences of myogenic stem cell function during aging. Stem cell Rev. 3, 226-237 (2007).
13. Kadi, F., Charifi, N., Henriksson, J. The number of satellite cells in slow and fast fibres from human vastus lateralis muscle. Histochem Cell Biol. 126, 83-87 (2006).
14. Verdijk, L. B., et al. Satellite cell content is specifically reduced in type II skeletal muscle fibers in the elderly. Am J Physiol Endocrinol Metab. 292, E151-E157 (2007).
15. Collins, C. A., Zammit, P. S., Ruiz, A. P., Morgan, J. E., Partridge, T. A. A population of myogenic stem cells that survives skeletal muscle aging. Stem cells. 25, 885-894 (2007).
16. Bortoli, S., et al. Gene expression profiling of human satellite cells during muscular aging using cDNA arrays. Gene. 321, 145-154 (2003).
17. Thalacker-Mercer, A. E., Dell'Italia, L. J., Cui, X., Cross, J. M., Bamman, M. M. Differential genomic responses in old vs. young humans despite similar levels of modest muscle damage after resistance loading. Physiol Genomics. 40, 141-149 (2010).
18. Jejurikar, S. S., et al. Aging increases the susceptibility of skeletal muscle derived satellite cells to apoptosis. Exp Gerontol. 41, 828-836 (2006).
19. McArdle, A., Dillmann, W. H., Mestril, R., Faulkner, J. A., Jackson, M. J. Overexpression of HSP70 in mouse skeletal muscle protects against muscle damage and age-related muscle dysfunction. FASEB J. 18, 355-357 (2004).
20. Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506, 316-321 (2014).
21. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. J Cell Biochem. 105, 663-669 (2008).
22. Soriano-Arroquia, A., McCormick, R., Molloy, A. P., McArdle, A., Goljanek-Whysall, K. Age-related changes in miR-143-3p:Igfbp5 interactions affect muscle regeneration. ageing cell. 15, 361-369 (2016).
23. Goljanek-Whysall, K., et al. Regulation of multiple target genes by miR-1 and miR-206 is pivotal for C2C12 myoblast differentiation. J Cell Sci. 125, 3590-3600 (2012).
24. Georgantas, R. W., et al. Inhibition of myogenic microRNAs 1, 133, and 206 by inflammatory cytokines links inflammation and muscle degeneration in adult inflammatory myopathies. Arthritis Rheumatol. 66, 1022-1033 (2014).
25. Sharples, A. P., Al-Shanti, N., Stewart, C. E. C2 and C2C12 murine skeletal myoblast models of atrophic and hypertrophic potential: relevance to disease and ageing? Journal of cellular physiology. 225, 240-250 (2010).
26. Hidestrand, M., et al. Sca-1-expressing nonmyogenic cells contribute to fibrosis in aged skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 566-579 (2008).
27. Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. ageing cell. 12, 333-344 (2013).
28. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. , (2015).
29. Pietrangelo, T., et al. Molecular basis of the myogenic profile of aged human skeletal muscle satellite cells during differentiation. Exp Gerontol. 44, 523-531 (2009).
30. Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp Cell Res. 174, 252-265 (1988).
31. Woods, K., Marrone, A., Smith, J. Programmed cell death and senescence in skeletal muscle stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. , 331-335 (2000).
32. Chakkalakal, J. V., Jones, K. M., Basson, M. A., Brack, A. S. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490, 355-360 (2012).
33. Cornelison, D. D., et al. Essential and separable roles for Syndecan-3 and Syndecan-4 in skeletal muscle development and regeneration. Genes & development. 18, 2231-2236 (2004).
34. Pisconti, A., Cornelison, D. D., Olguin, H. C., Antwine, T. L., Olwin, B. B. Syndecan-3 and Notch cooperate in regulating adult myogenesis. J Cell Biol. 190, 427-441 (2010).
35. Schafer, R., et al. Age dependence of the human skeletal muscle stem cell in forming muscle tissue. Artificial organs. 30, 130-140 (2006).
36. Castiglioni, A., et al. Isolation of progenitors that exhibit myogenic/osteogenic bipotency in vitro by fluorescence-activated cell sorting from human fetal muscle. Stem cell reports. 2, 92-106 (2014).
37. Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: differential modulation of myoblast markers by TGF-beta2. J Cell Physiol. 196, 70-78 (2003).
38. Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PloS one. 4, e5846 (2009).
39. Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 109, 735-744 (2001).
40. Gaster, M., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. Proliferation conditions for human satellite cells. The fractional content of satellite cells. APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 109, 726-734 (2001).
41. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods Mol Biol. 798, 21-52 (2012).
42. Chowdhury, S. R., et al. One-Step Purification of Human Skeletal Muscle Myoblasts and Subsequent Expansion Using Laminin-Coated Surface. Tissue engineering. Part C, Methods. 21, 1135-1142 (2015).
43. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal muscle. 1, 34 (2011).
44. Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. Fibro/adipogenic progenitors: a double-edged sword in skeletal muscle regeneration. Cell cycle. 9, 2045-2046 (2010).
45. Ciofani, G., et al. Hypergravity effects on myoblast proliferation and differentiation. J Biosci Bioeng. 113, 258-261 (2012).

Tags

Developmental Biology primær myoblasts muskel aldring gjenfødelse mikroRNA human