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Biology

कड़ा हो जाना घटनाओं की विशेषता एक मरीन Tubeworm लाइव ऑप्टिकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक का प्रयोग

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/55164
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biological Sciences, Clemson University, 2Department of Marine Biodiversity Research (BioDive), Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Advanced Material Research Laboratory (AMRL), Clemson University, 4Swire Institute of Marine Sciences and School of Biological Sciences, The University of Hong Kong

Introduction

Biomineralization घटनाओं की एक जटिल श्रृंखला है, जो सेलुलर नजाकत का आदेश दिया खनिजों 1 के उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप गतिविधियों का एक सूट को पुल है। चुनौती दोनों गतिशील सेलुलर प्रक्रिया और ऑप्टिकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के तरीकों का एक संयोजन का उपयोग कर परिष्कृत खनिज संरचनाओं को चिह्नित करने के लिए है। Intracellular पीएच की ऊंचाई CaCO 3 क्रिस्टल के गठन के पक्ष में है, इसलिए, जीवन स्तर एक वृद्धि की पीएच है कि पहचान के समय जब कड़ा हो जाना संभावना 2, 3 उत्पन्न हो रहा है पता चलता है।

परिवार Serpulidae से tubeworms महासागर 4 में आम calcifiers हैं। यह भी विशेष रूप से जैव अवरोध 5, 6 में समुद्री अनुसंधान के लिए एक लोकप्रिय अकशेरुकी मॉडल है। इस अध्ययन में, mineralizing डिब्बों में कड़ा हो जाना करने की प्रक्रिया Duriएनजी biomineralization मनाया जाता है। कायापलट की तेजी से प्रक्रिया कैल्शियम कार्बोनेट संरचनाओं 7, 8 के उद्भव भी शामिल है।

हम कैसे आंतरिक पीएच माप tubeworm पर किया जा सकता का प्रदर्शन, और कैसे जीवन चरणों और कड़ा हो जाना के लिए प्रासंगिक ऊतकों की जांच की जा सकती है। ब्याज की जीवन स्तर के बाद की पहचान की है, ऊतक कड़ा हो जाना करने के लिए जिम्मेदार एक उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तरीकों का उपयोग पर होती जा सकता है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, हम समय रूपांतरित शामिल होने के बाद प्रकट करने के लिए कैल्शियम कार्बोनेट के लिए आवश्यक का निर्धारण। जीवन का एक समान मंच बाद में मौलिक रचना वितरण के लिए SEM-ईडीएस के साथ कल्पना की गई थी, और जमा खनिज दो अलग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तरीकों, विशेष रूप से SEM-EBSD और मिथ्या-मंदिर का उपयोग विश्लेषण किया गया था।

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Protocol

1. लाइफ स्टेज के लिए स्क्रीनिंग और लाइव इमेजिंग के साथ ब्याज की ऊतक

  1. योग्यता के लिए संस्कृति समुद्री लार्वा पहले से सूचना दी तरीकों 6, 7, 9 के अनुसार। समुद्री जल में 10 माइक्रोन के Snarf -1 AM रातोंरात के साथ फ़िल्टर के साथ एमएल घनत्व प्रति 5 लार्वा पर tubeworm लार्वा सेते हैं। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कंटेनर कवर तस्वीर विरंजन से फ्लोरोसेंट जांच की रक्षा के लिए।
  2. लार्वा एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग का निरीक्षण करें। सक्षम tubeworm लार्वा कायापलट के लिए तैयार एक आगे की बजाय दिशा एक परिपत्र गति में तैर जाएगा।
  3. एक 60 माइक्रोन जाल करने के लिए सक्षम लार्वा स्थानांतरण। तरल बनाए रखने के लिए एक अच्छा मुहर उपलब्ध कराने, एक पेट्री डिश के खिलाफ जाल दबाएँ। जल्दी मुहर जारी है और फ्लोरोसेंट डाई युक्त समुद्री जल त्यागने के लिए, लार्वा को बनाए रखना जारी।
  4. फ़िल्टर कृत्रिम समुद्री जल (FASW) के साथ लार्वा धो दो बार ले रही है,इस प्रक्रिया में लार्वा बाहर सुखाने के लिए नहीं परवाह है।
  5. कायापलट की प्रक्रिया की निगरानी के लिए 10 -4 एम isobutylmethylxanthine (IBMX) युक्त FASW के 5 एमएल के साथ 10 से 20 पतली गिलास नीचे व्यंजन में लार्वा को रखें।
  6. और लार्वा की डीआईसी छवि:;: (पूर्व 510/25 एम 640/35 चैनल 2 पूर्व 510/25 एम 580/30 चैनल 1) Snarf -1 संकेत का पता लगाने के लिए फिल्टर क्यूब्स डालें।
  7. 20X उद्देश्य के तहत metamorphosing लार्वा स्थिति है, तो, शटर समय (100-300 एमएस) काफी तेजी से अनुकूलन सुनिश्चित करने के लिए कि जीवित पशुओं का एक स्पष्ट छवि पर कब्जा कर लिया है।
  8. सेट 1 माइक्रोन दूरी सभी तीन चैनलों की एक जेड ढेर पर कब्जा करने के लिए, एक जीवित पशु इमेजिंग है, सभी तीन चैनलों के लिए प्रत्येक परत इमेजिंग Z-दिशा के अगले परत पर जाने से चैनलों के बीच एक बेहतर सहसंबंध के लिए सक्षम होगा पहले।
  9. सभी चैनलों और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर से TIF फाइल के रूप में परतों के लिए निर्यात ग्रे स्केल छवियों: फ़ाइल | निर्यात | फाइल प्रकार TIF | प्रारंभ।
  10. ImageJ का उपयोग, आईएमपोर्ट प्रत्येक चैनल के लिए छवि अनुक्रम: फ़ाइल | आयात | छवि अनुक्रम।
    1. चैनल आयात करने के लिए 1 λ 1 उन्हें, छवि 3 और वेतन वृद्धि शुरू दर्ज: 4।
    2. चैनल आयात करने के लिए 2 λ 2 उन्हें, छवि 4 और वेतन वृद्धि शुरू दर्ज: 4।
  11. पिक्सेल द्वारा प्रत्येक परत पिक्सेल के लिए λ 1 उन्हें द्वारा λ 2 उन्हें विभाजित करके एक समग्र छवि उत्पन्न (प्रक्रिया | छवि कैलक्यूलेटर ... | छवि फ़ाइल 640 एनएम "विभाजन" छवि फ़ाइल 580 एनएम), यानी 640/580 एनएम अनुपात।
  12. छवि का चयन करें | देखने सारणी | 16 रंग।
  13. विश्लेषण का चयन करें | उपकरण | कैलिब्रेशन बार।
  14. विभिन्न परतों का निरीक्षण किया, परत सबसे विविधता युक्त पहचान। यह आंतरिक पीएच वितरण के बारे में सबसे उपयोगी जानकारी प्रदान करता है।
  15. 640/580 एनएम अनुपात और पीएच के बीच संबंध का उपयोग करना, आंतरिक पीएच का वितरण कल्पना करने के लिए एक साजिश प्रोफ़ाइल का निर्माण।

  1. के साथ 10 माइक्रोन के Snarf -1 हूँ के बारे में 20 लार्वा की रात भर धुंधला के बाद, nigericin और KCl के शेयर समाधान में जोड़ने के लिए 50 माइक्रोन के nigericin और जांच के लिए 150 मिमी KCl को बनाने के लिए।
  2. जब तक 5.9 चारों ओर एक पीएच हासिल की है, पतला NaOH या एचसीएल के साथ अंशांकन AFSW का पीएच को समायोजित करें। नोट सटीक पीएच मान। कि आधारित समुद्री जल से calibrated किया गया है एक ग्लास इलेक्ट्रोड के साथ एक पीएच मीटर के साथ उपाय पीएच 2 अमीनो-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (Tris) और 2-aminopyridine 9।
  3. एक दाग tubeworm लार्वा को एक साथ एक तरल के साथ एक ज्ञात पीएच के साथ एक सूखी और साफ डिश के लिए संकेतों की तीव्रता का मापन के लिए 640 एनएम और 580 एनएम पर स्थानांतरण।
  4. दोहराएँ 2.2 और चार और पीएच 5.9 से 9.9 से लेकर 2.3 अंक के लिए कदम। वे physiologically प्रासंगिक मूल्यों की एक श्रृंखला का प्रतिनिधित्व करते हैं।
  5. संकेतों पशु पूरे शरीर में समरूप दिखाई सुनिश्चित करने के लिए जाँच करें। यह इंगित करता है कि intracellular पीएच ई कर दिया गया हैपर्यावरण समुद्री जल के साथ quilibrated।
  6. छवि पाँच अलग अलग समुद्री जल पीएच वातावरण में tubeworm लार्वा, तीव्रता 640 एनएम पर 'ग्रे मूल्यों "के रूप में और 580 एनएम पर, यानी, λ 2 exc और λ 1 exc दिखाए रिकॉर्ड है।

3. ratiometric इमेजिंग डेटा का विश्लेषण

  1. के रूप में पांच यादृच्छिक स्थानों से या एक फैल शीट पर ब्याज की एक क्षेत्र से मापा ग्रे मूल्यों दर्ज करें।
  2. देखने के लिए पांच अंक अंशांकन एक रैखिक संबंध intracellular पीएच इंगित करने के लिए दिखाया चेक (जैसे, y = 0.30x तरह समीकरण - 1.47; y = ग्रे मूल्य, एक्स = पीएच; R² = .934)।
  3. समीकरण कदम 1.13 पर मापा 640/580 एनएम तीव्रता के अनुपात का उपयोग करने से intracellular पीएच मान की गणना करें।

4. नमूना संरक्षण, निर्जलीकरण और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ते

  1. 4% paraformaldehyde के साथ ब्याज की जीवन स्तर को बचाना। इस अध्ययन में, Tubeworms, लगाव के बाद 2-4 दिन ठीक विश्लेषण जब तक लगानेवाला में जानवरों को रखने के लिए।
  2. एक धूआं हुड में काम करते हुए, 1% आज़मियम tetroxide जलीय समाधान के साथ नमूना 30 मिनट के लिए निर्जलीकरण की प्रक्रिया के दौरान ऊतक संकोचन कम से कम करने के बाद तय कर लो।
  3. 5 मिनट के लिए 5 मिनट, 95% इथेनॉल के लिए 5 मिनट, 85% इथेनॉल के लिए 5 मिनट, 70% इथेनॉल के लिए 50% इथेनॉल, और दो बार 5 मिनट के लिए अंत में पूर्ण इथेनॉल: एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला के साथ नमूना निर्जलीकरण।
  4. तरल पूरी तरह से लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति देता है, नमूना के लिए इथेनॉल और hexamethyldisilazane (HMDS) के 1 समाधान: एक धूआं हुड में काम करते हुए, एक 1 जोड़ें।
  5. धूआं हुड में, नमूना के लिए 100% HMDS जोड़ने के लिए, तरल पूरी तरह से लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति देता है।
  6. एक हीरे की चाकू का प्रयोग, संस्कृति डिश के लिए कुछ कटौती लागू करने, कुछ tubeworms आसपास। पर ढक्कन के साथ, पकवान तोड़ने के लिए एक एल्यूमीनियम ठूंठ के खिलाफ पकवान नीचे पकड़ो।
  7. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक खंडित एक अक्षुण्ण tubeworm युक्त टुकड़ा मिल।
  8. एक एल्यूमीनियम ठूंठ को चांदी के रंग लागू करें और ध्यान से ठूंठ को टुकड़ा सुरक्षित। प्लास्टिक टुकड़ा के किनारों के आसपास पेंट चार्ज कम करने के लिए।

5. एक कैल्शियम से भरपूर क्षेत्र SEM-ईडीएस का प्रयोग लगाने

  1. नमूना धारक पर नमूना ठूंठ सुरक्षित।
  2. माइक्रोस्कोप के साथ प्रदान की गेज के खिलाफ पूरे विधानसभा की ऊंचाई मापने, ताला वॉशर ढीला और पोस्ट घूर्णन द्वारा ऊंचाई का समायोजन जब तक नमूना मानक ऊंचाई पर है, या के रूप में दर्ज ऊंचाई दर्ज करें।
  3. माइक्रोस्कोप एक्सचेंज के चेंबर में हवा में स्वीकार और कक्ष के दरवाजे खुले झूले। विनिमय रॉड के अंत पर नमूना धारक स्लाइड। उसके बाद बंद और चैम्बर खाली।
  4. गेट वाल्व खोलने और माइक्रोस्कोप चैम्बर की ओर में विनिमय रॉड स्लाइड। में स्लाइड विनिमय रॉड सभी तरह से पूरी तरह से माइक्रोस्कोप चरण में नमूना धारक सीट के लिए। विनिमय रॉड निकालें और गेट वाल्व बंद कर दें।
  5. इनपुट टीवह आयामों का नमूना है और घर की स्थिति के लिए मंच भेजने इलेक्ट्रॉन स्तंभ के नीचे नमूना जगह है।
  6. VP-SEM मोड में 20-30 पा के लिए कक्ष वैक्यूम स्तर सेट करें। 20 केवी इलेक्ट्रॉन को तेज वोल्टेज सेट और उच्च वोल्टेज की बारी है।
  7. 10 मिमी का एक नमूना काम दूरी के लिए मंच उठाएँ। एक लाइव फीड मोल और नमूना का पता लगाने। छवि की दृष्टिवैषम्य को एडजस्ट करने के अनुकूलन और आवश्यक के रूप में ध्यान केंद्रित।
  8. SEM-ईडीएस कार्यक्रम खोलें और ईडीएस-SEM मोड विकल्प का चयन करें। एक ईडीएस नक्शे को चलाने के लिए मेनू विकल्प का चयन करें।
  9. के रूप में SEM-ईडीएस कार्यक्रम में दर मीटर के माध्यम से नजर रखी बदलें कंडेनसर लेंस और एपर्चर सेटिंग्स 3 की एक प्रक्रिया के समय में ~ का 30% एक मरे हुए समय को प्राप्त करने के लिए। किरण सेटिंग्स के लिए किसी भी परिवर्तन करने के बाद किरण और एपर्चर संरेखण प्रक्रियाओं चलाएँ।
  10. एक बढ़ाई ऐसी है कि एक भी जीव देखने के पूरे क्षेत्र भर जाता है का चयन करें। बहाव सुधार विकल्प को सक्रिय और SEM-ईडीएस कार्यक्रम में एक छवि पर कब्जा।
  11. एमए मोलजीव देखने के पूरे क्षेत्र को भरने, 50-100 एमएस के एक ध्यान केन्द्रित करना समय का उपयोग कर के साथ पी डेटा। नक्शा चलाने के लिए जब तक डेटा जीव (लगभग 15 मिनट) के भीतर सीए के अलग स्थानीयकरण से पता चलता है।
  12. बिंदु मात्रा का ठहराव डेटा प्राप्त करने के लिए, 6 के लिए प्रक्रिया में समय बदलने के लिए और ~ का 30% एक मरे हुए समय के अधिग्रहण के लिए इलेक्ट्रॉन जांच समायोजित करें। संरेखण कदम चलाने के लिए और आवश्यक के रूप में छवि का अनुकूलन।
  13. प्वाइंट और SEM-ईडीएस कार्यक्रम में आईडी विकल्प का चयन करें और एक और छवि के अधिग्रहण। एकल बिंदु उपकरण का उपयोग, क्षेत्रों है कि सीए ईडीएस नक्शे में अमीर, साथ ही सीए की कमी क्षेत्रों की तुलना के लिए दिखाई दिया पर क्लिक करें। 30 एस का जीना समय के लिए प्रत्येक बिंदु स्कैन करें।

6. कैल्शियम से भरपूर क्षेत्र के क्रिस्टेलोग्राफिक जानकारी की पहचान का उपयोग करना SEM-EBSD

  1. फ्लैट नमूना ठूंठ से ब्याज की प्लास्टिक टुकड़ा युक्त नमूना निकालें और एक 45 डिग्री पूर्व झुका ठूंठ चांदी प्रवाहकीय चिपकने का उपयोग करने का sloped सामना करने के लिए प्रत्यय।
  2. नमूना ज पर ठूंठ पेंचपुराने और नमूना धारक के सामने की ओर स्थिति ठूंठ की कोणीय चेहरा (नमूना) के साथ। माइक्रोस्कोप एक्सचेंज कक्ष का उपयोग कर के चेंबर में नमूना धारक डालें।
  3. 30 Pa करने के लिए कक्ष वैक्यूम और इलेक्ट्रॉन 20 केवी वोल्टेज में तेजी सेट करें। इलेक्ट्रॉन स्तंभ के नीचे नमूना भेजें और चरण 25 डिग्री झुकाव इलेक्ट्रॉन बीम के लिए नमूना की सतह सामान्य से लगभग 70 डिग्री जगह है। पर उच्च वोल्टेज मुड़ें।
  4. ~ 18 मिमी की दूरी काम करने के लिए मंच उठाएँ। मंच कदम है और एक नमूना पता लगाने के लिए ट्रैकबॉल का प्रयोग करें। हित के विशिष्ट सुविधाओं फ्रेम करने के लिए बढ़ाई बढ़ाएँ। बीम संरेखित और आवश्यक के रूप में छवि का अनुकूलन।
  5. EBSD मोड में SEM-ईडीएस प्रोग्राम खोलें। केल्साइट और ब्याज के चरणों के रूप में एंरेगोनाइट का चयन करें। 154 मिमी की दूरी पर EBSD कैमरा डालें। 1 एक्स 1 binning और एक 100 एमएस फ्रेम समय के लिए कैमरे की स्थिति निर्धारित करें। एक तेज किरण रेखापुंज का प्रयोग, एक पृष्ठभूमि के अधिग्रहण।
    नोट: एक अलग फ्रेम दरइलेक्ट्रॉन जांच के आधार पर आवश्यक हो सकता है; के बारे में 90% की एक संकेत प्राप्त करने के लिए जांच या कैमरे के फ्रेम दर को समायोजित।
  6. SEM-ईडीएस कार्यक्रम में एक छवि पर कब्जा है। मौके विश्लेषण उपकरण का उपयोग करें और उस बिंदु पर किरण को स्कैन करने के लिए छवि पर कहीं पर क्लिक करें। कैमरा खिड़की का निरीक्षण करें देखने के लिए किसी भी किकुची पैटर्न पता चला रहे हैं।
  7. छवि के विभिन्न क्षेत्रों पर क्लिक संभावित कड़ा हो जाना साइटों को स्कैन करने के लिए, प्रत्येक बिंदु पर कैमरा खिड़की से देख यदि किकुची बैंड मौजूद हैं देखने के लिए। पैटर्न मौजूद हैं और डेटाबेस में चुने गए चरणों के किसी भी मैच के हैं, वे स्वतः अनुक्रमित किया जाएगा।

7. मंदिर नमूना तैयारी का उपयोग मिथ्या-SEM

  1. कोट धूम प्लैटिनम या इसी तरह की सामग्री के साथ तैयार SEM नमूना एक प्रवाहकीय परत बनाने के लिए।
    1. इससे पहले, तय निर्जलित, और घुड़सवार नमूनों धूम coater के आवास में रखें और चैम्बर नीचे पम्पिंग शुरू करने पर बिजली की बारी है।
    2. एक बार कक्ष वैक्यूम पढ़ता 40 mTorr कम या ज्यादा, पर गैस स्विच कर देते हैं और 200 mTorr के एक कक्ष तक पहुंचने के लिए दबाव आर्गन गैस के प्रवाह में वृद्धि। 80 mTorr के अंतिम चैम्बर दबाव को प्राप्त करने के लिए गैस के प्रवाह को समायोजित करें।
    3. पर वोल्टेज स्विच मुड़ें और वोल्टेज में वृद्धि 15 मा के एक वर्तमान तक पहुँचने के लिए। एक विस्तारित समय (~ 10 मिनट) एक मोटी परत (~ 60 एनएम) कि आयन विकिरण नुकसान से नमूना सतह की रक्षा बनाने के लिए टाइमर और कोट सेट करें। वोल्टेज एक स्थिर 15 मा वर्तमान बनाए रखने के लिए विनियमित।
    4. समाप्त होने पर, सत्ता नीचे coater वैक्यूम जारी है और नमूना हटा दें।
  2. तैयार के आधार भाड़ में, साधन नमूना धारक के एम 4 पेंच पद पर लेपित नमूना धूम। हाथ तक कस तंग, ताला अखरोट ढीला है, और फिर नमूना धारक पद बारी बारी से विधानसभा की ऊंचाई बदलने के लिए। लेजर ऊंचाई नापने का यंत्र का प्रयोग करें और मानक supplie के रूप में (वीडियो में दिखाया गया 0.04 इंच =) ऊँचाई को समायोजित 1 मिमी के भीतर होयंत्र के साथ घ।
  3. मिथ्या-SEM में सभी बंदूक वाल्व बंद करें, और उसके बाद eucentric चरण airlock में हवा स्वीकार करते हैं। एक बार जब दबाव पर्यावरण के साथ बराबरी की है, हवा खुला ताला स्लाइड और विनिमय रॉड के कोणों पर नमूना धारक प्रत्यय। "ताला" स्थिति के लिए Exchange छड़ी के अंत पर घुंडी बारी। हवा ताला बंद करो और हवा ताला चैम्बर खाली।
  4. एक बार जब eucentric चरण हवा ताला खाली करा लिया गया है और दबाव मिथ्या-SEM कक्ष की कि मैच, गेट वाल्व खोलने और विनिमय रॉड में धकेलने के द्वारा नमूना डालें। स्लाइड विनिमय रॉड से सभी तरह के साधन eucentric चरण में नमूना धारक सीट के लिए है, तो "अनलॉक" स्थिति के लिए Exchange रॉड घुमाएगी। विनिमय छड़ी वापस स्लाइड बाहर और गेट वाल्व बंद कर दें।
  5. आयन बीम स्तंभ के अंतर्गत नमूना स्थिति के लिए मंच ले जाएँ। गेट वाल्व खुला और मिथ्या का जीना आयन प्रेरित माध्यमिक इलेक्ट्रॉन छवि अधिग्रहण। कम बढ़ाई और एक का प्रयोग करेंतेजी से रेखापुंज स्कैन आयन नुकसान को कम करने के लिए। सामान्य अवलोकन बीम का फोकस रीसेट और जब तक नमूना ध्यान में है चरण के Z ऊंचाई बढ़ा। इस बिंदु पर नमूना जहां दोनों आयन और इलेक्ट्रॉन बीम एक ही स्थान पर ध्यान केंद्रित कर रहे पार बिंदु की स्थिति में है।
  6. SEM से माध्यमिक इलेक्ट्रॉन छवि का उपयोग करना, नमूना में रुचि के क्षेत्र का पता लगाने, ट्रैकबॉल उपयोग कर के आसपास नमूना स्थानांतरित करने के लिए। हित के क्षेत्रों सीए अमीर क्षेत्रों के रूप में पहले से ईडीएस मानचित्रण द्वारा निर्धारित कर रहे हैं। मंच खिड़की के फ्रेम के साथ लाइन में ब्याज की सुविधाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में घुमाएं।
  7. मिथ्या खिड़की अंतरफलक पर, एक अतिरिक्त 2 एक्स डिजिटल जूम के साथ 1,000X की एक बढ़ाई नमूना की एक त्वरित स्नैपशॉट पर कब्जा करने और ब्याज के क्षेत्र में एक ~ 8 माइक्रोन एक्स 2 माइक्रोन बयान टेम्पलेट आकर्षित। बयान बॉक्स के आकार बढ़ाई विभिन्न आकारों की सुविधाओं को समायोजित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। एक 40 केवी का उपयोग कर कार्बन जमा करने की स्थिति धूम सेट0.09 ना किरण, 5 मिनट के लिए 0.5 μs की एक ध्यान केन्द्रित करना समय का उपयोग।
  8. कार्बन के बयान के बाद, 5 मिनट के लिए एक 40 केवी, 0.7 ना बीम, और जमा का उपयोग कर एक ~ 2-3 माइक्रोन टंगस्टन टोपी उत्पन्न करने के लिए टंगस्टन जमा करने के लिए जमाव की स्थिति को संशोधित।
  9. अवलोकन बीम का उपयोग कर एक मिथ्या स्नैपशॉट पर कब्जा है और टंगस्टन टोपी के चारों ओर चार बक्से के एक पैटर्न आकर्षित करने के लिए microsampling धूम उपकरण का उपयोग करें। ऊपरी और निचले बॉक्स सेट के बारे में 15 माइक्रोन होना करने के लिए एक्स 8 माइक्रोन; सही बॉक्स 10 माइक्रोन एक्स 5 माइक्रोन, और बाएँ बॉक्स 6 माइक्रोन एक्स 5 माइक्रोन, या काफी बड़े हित के क्षेत्र को चारों ओर।
    1. निर्माण शर्तों को संशोधित एक 40 केवी, 19 ना बीम, और 50 μs, और प्रत्येक बॉक्स के लिए 3-4 फ्रेम स्कैन की एक ध्यान केन्द्रित करना समय का उपयोग कर कटौती के लिए। तो पैटर्न बनाना। निर्माण, ब्याज की क्षेत्र, सुरक्षात्मक सी और डब्ल्यू परतों के साथ के बाद, सभी आसन्न ऊपर, नीचे, और सही पक्ष पर हटाया सामग्री के साथ एक द्वीप के समान होगा।
  10. मंच झुकाव 58 डिग्री samp डाल करने के लिएLe इलेक्ट्रॉन स्तंभ के लिए और आयन स्तंभ के लिए एक तेजी से कोण पर सामान्य सतह। नमूना "द्वीप" मिथ्या का उपयोग करने की पीठ जानें और 1,000X बढ़ाई और 2-4x डिजिटल ज़ूम पर एक स्नैपशॉट पर कब्जा।
  11. जहां यह दिखाई दे रहा है के बहुत अंत में नमूना की पीठ के तल पर एक ~ 15 माइक्रोन एक्स 2 माइक्रोन धूम पैटर्न ड्रा "द्वीप"। एक 4 ना बीम का उपयोग बॉक्स बनाना 3 मिनट के लिए, या जब तक बीम नमूना के नीचे के माध्यम से कट गया है "द्वीप।"
  12. eucentric चरण झुकाव (वापस शून्य करने के लिए) वर्तमान स्थिति से -58 डिग्री। मिथ्या इंटरफ़ेस में "जांच में" पर क्लिक करके टंगस्टन microsampling जांच डालें। चरण नियंत्रण कक्ष पर चुनें "एमएस" और नमूना के शीर्ष पर जांच करने के लिए कदम ट्रैकबॉल का उपयोग करें।
  13. 1 KX की एक बढ़ाई मिथ्या से एक जीवित फ़ीड मोल और जांच की स्थिति ऐसी है कि टिप सीधे microsample की टंगस्टन टोपी के दाईं ओर से ऊपर है। जबकि एक लाइव अवलोकनSEM से एसई छवि, यह संपर्क टंगस्टन टोपी जब तक जांच कम करने के लिए मंच पैनल के Z नियंत्रण घुंडी का उपयोग करें। एक बार संपर्क किया गया है एक बजर ध्वनि जाएगा।
  14. एक स्नैपशॉट मिथ्या का उपयोग कर एक 40 केवी, 0.01 ना बीम का उपयोग, 1,000X और 2 एक्स डिजिटल ज़ूम के एक बढ़ाई कब्जा। जांच के लिए जहां यह microsample की टंगस्टन टोपी संपर्क किया गया है की नोक पर एक 2 माइक्रोन एक्स 2 माइक्रोन बॉक्स आकर्षित करने के लिए बयान उपकरण का उपयोग करें।
    1. एक 40 केवी, 0.09 ना बीम का उपयोग टंगस्टन जमा करने के लिए, 2 मिनट और 0.5 μs की एक समय ध्यान केन्द्रित करने के लिए शर्तों सेट करें। तो पैटर्न बनाना।
  15. microsample के बाएँ छोर "हाथ" (जहां यह अभी भी नमूना के थोक से जुड़ा है) पर एक ~ 2 माइक्रोन एक्स 5 माइक्रोन धूम पैटर्न ड्रा। एक 40 केवी का उपयोग कर पैटर्न निर्माण, 0.7 ना किरण, 2 मिनट के लिए, या जब तक बीप इंगित करता है कि microsample थोक नमूना से अलग कर दिया गया है।
  16. संलग्न microsample तक साथ जांच जुटाने के लिए जेड नियंत्रण घुंडी का प्रयोग करेंयह थोक नमूना साफ करता है, तो जांच वापस लेना। करने के लिए या तो घर या Exchange स्थिति eucentric चरण भेजें।
  17. एक तांबे आधा ग्रिड एक साइड एंट्री धारक में रखें और साइड एंट्री चरण शुद्ध कक्ष में धारक लोड। कक्ष खाली और साइड एंट्री धारक डालें। मिथ्या स्थिति के लिए धारक सेट करें।
  18. चरण नियंत्रण कक्ष पर प्रेस साइड और ट्रैकबॉल का उपयोग मिथ्या मॉनीटर पर देखने में आधा ग्रिड लाने के लिए। आधा ग्रिड के क्षेत्र को साफ और ध्यान में लाने के लिए सतह जेड घुंडी का उपयोग करने के लिए ले जाएँ।
  19. प्रेस जांच में मंच नियंत्रण कक्ष पर जांच, प्रेस एमएस डालें, और आधा ग्रिड पर microsample की स्थिति के लिए ट्रैकबॉल और जेड घुंडी का उपयोग करने के लिए। microsample संपर्कों ग्रिड तक जांच के निचले हिस्से।
  20. 1,000X बढ़ाई (2 एक्स जूम) पर मिथ्या पर एक छवि पर कब्जा है। बयान उपकरण का उपयोग करें और microsample के निचले किनारे पर एक ~ 10 माइक्रोन एक्स 3 माइक्रोन पैटर्न आकर्षित। एक 40 केवी, 0.7 ना किरण के साथ जमा टंगस्टन, एक वास टी का उपयोग कर3 मिनट के लिए 0.5 μs की IME।
  21. धूम उपकरण का उपयोग करें और जांच की नोक पर एक छोटे से 1 माइक्रोन एक्स 3 माइक्रोन पैटर्न आकर्षित। 3 एमएस के एक ध्यान केन्द्रित करना समय में एक 40 केवी, 0.7 ना बीम का उपयोग जांच microsample से दूर कटौती करने के लिए पैटर्न बनाना। जांच वापस लेना एक बार मुक्त।
  22. 5,000X बढ़ाई पर एक मिथ्या छवि पर कब्जा है और ऊपर और microsample के तल पर दो धूम पैटर्न आकर्षित 7 माइक्रोन x 4 माइक्रोन, बक्से के बीच एक ~ 1 माइक्रोन अंतराल छोड़ने। पैटर्न केंद्र के रूप में तो microsample के बाएँ और दाएँ पक्ष में कटौती नहीं करने के लिए। एक 40 केवी, 4 ना बीम, और 3 μs की एक समय ध्यान केन्द्रित करना, दोनों का उपयोग कर पैटर्न बनाना 2 मिनट के लिए, microsample के केंद्र की ओर रेखापुंज दिशा तय करने।
  23. 5,000X पर मिथ्या अवलोकन बीम का उपयोग कर एक और छवि पर कब्जा है। पिछले धूम बक्से आकार बदलने के लिए ~ 6.5 माइक्रोन एक्स 1 माइक्रोन, करीब एक साथ ~ के अंतराल छोड़ने के लिए ले जाने के लिए 0.5 माइक्रोन, और एक 40 केवी, 0.7 ना बीम का उपयोग बनाना।
  24. साइड एंट्री चरण झुकाव 0.5 डिग्री और टोपीएक और मिथ्या छवि की संरचना। 6 माइक्रोन चौड़ा करने के लिए धूम बक्से का आकार बदलें। microsample के ऊपर की ओर से अधिक शीर्ष पैटर्न स्थिति और एक 40 केवी, 0.7 ना बीम का उपयोग बनाना। -0.5 ° झुकाव और निचले धूम पैटर्न और microsample के नीचे की ओर से दोहराएँ।
  25. इसके अलावा ~ 0.5 माइक्रोन से पैटर्न चौड़ाई कम होती है। 0.5 ° झुकाव और एक 40 केवी, 0.09 ना बीम का उपयोग microsample के ऊपर की ओर धूम। -0.5 डिग्री के झुकाव पर नीचे की ओर से दोहराएँ।
  26. मंच 2.2 ° झुकाव और 10,000 पर एक मिथ्या छवि अधिग्रहण। 5 माइक्रोन चौड़ा करने के लिए धूम पैटर्न आकार और 5 केवी, 0.03 ना करने के लिए बीम की स्थिति बदल जाते हैं। microsample के ऊपरी किनारे पर ऊपरी पैटर्न स्थिति, सही शीर्ष बढ़त के ऊपर, और बनाना। -2.2 ° झुकाव और नीचे की ओर और नीचे पैटर्न के साथ दोहराएँ।
  27. 5 केवी मिलिंग चरणों को दोहराएँ जब तक microsample इलेक्ट्रॉन पारदर्शी (~ 100 एनएम मोटाई) हो जाता है। समाप्त होने पर, बंद gunvalves और साइड एंट्री धारक को हटा दें।

8. हेएक मंदिर पर चयनित क्षेत्र विवर्तन पैटर्न btaining

  1. विश्लेषण के लिए साधन तैयार करने के लिए, को भरने के दोनों देवर तरल नाइट्रोजन के साथ बोतल और 300 केवी को तेज वोल्टेज की स्थापना की।
  2. मिथ्या का उपयोग नमूना तैयार करने के बाद, मिथ्या-SEM से साइड एंट्री धारक को हटाने और धारक लंबाई 300 केवी मंदिर की कि मैच ऐसी है कि पिन स्थिति को समायोजित। सही अवलोकन करने की स्थिति में धारक की नोक बारी बारी से, सही नमूना उन्मुखीकरण सुनिश्चित करने के लिए एक बार फिर से मानक मंदिर धारक के लिए यह तुलना।
    1. वैकल्पिक रूप से, मिथ्या-SEM धारक और मानक मंदिर धारक में जगह से जुड़ी lamellae के साथ आधा ग्रिड को हटा दें।
  3. मंदिर के आदान-प्रदान के चेंबर में नमूना धारक लोड और चैम्बर खाली। सुनिश्चित करें कि साधन बंदूक वाल्व जब भी हवा विनिमय कक्ष में भर्ती कराया गया है बंद कर दिया है। एक बार जब विनिमय चैम्बर नीचे पंप है, एक श्रव्य अलार्म ध्वनि जाएगा। नमूना धारक दक्षिणावर्त बारी बारी से और VACU की अनुमति देते हैंउम पहला पड़ाव स्थिति के लिए नमूना धारक खींचने के लिए।
  4. साधन वैक्यूम ठीक करने के लिए अनुमति दें, और फिर बंदूक वाल्व खुला। फोकस रीसेट और 10,000 के बारे में एक बढ़ाई ज़ूम।
  5. भास्वर स्क्रीन के बीच करने के लिए बीम को शिफ्ट करने के संरेखण knobs का प्रयोग करें। अनुबंध और किरण का विस्तार करने और सुनिश्चित करें कि सभी बीम आंदोलन गाढ़ा है। आवश्यक के रूप में कंडेनसर stigmatism लिए समायोजित करें।
  6. नमूना धारक वामावर्त बारी बारी से और वैक्यूम पूरी तरह से कॉलम में धारक खींचने के लिए अनुमति देते हैं। नेविगेट और नमूना का पता लगाने के लिए मंच आंदोलन knobs का प्रयोग करें।
  7. नमूना पर बढ़ाई बढ़ाने के लिए और जब तक नमूना ध्यान में है जेड ऊंचाई समायोजित करें। आवश्यक के रूप में ऑप्टिकल आईपीस का प्रयोग करें।
  8. कैमरा डालें और भास्वर स्क्रीन को हटा दें। किरण के रूप में आवश्यक विस्तृत कैमरा oversaturating से बचने के लिए। ध्यान और कैमरे के मापदंडों को समायोजित करें, तो एक छवि पर कब्जा करने के लिए अधिग्रहण शुरू।
  9. एक विवर्तन पैटर्न, पहले केंद्र प्राप्त करने के लिएब्याज की सुविधा। उद्देश्य एपर्चर निकालें और विवर्तन एपर्चर डालें।
  10. नियंत्रण कक्ष पर अन्तर बटन दबाकर विवर्तन लेंस मोड को बदलने के लिए और बीम हटना करने के अन्तर नियंत्रण घुंडी का उपयोग करें।
  11. कैमरा या भास्वर स्क्रीन जलने से विवर्तन पैटर्न के केंद्र को रोकने के लिए आवश्यक के रूप में blanker डालें। कैमरे के अधिग्रहण शुरू पैटर्न की एक छवि पर कब्जा करने के लिए।

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Representative Results

निम्नलिखित tubeworm की कायापलट के दौरान कड़ा हो जाना प्रक्रिया के कुछ टिप्पणियों रहे हैं। चित्रा 1 से पता चलता है कि कॉलर क्षेत्र के पास पीएच मान कायापलट के बाद अन्य ऊतकों की तुलना में अधिक है। चित्रा 2i सीए के सजातीय वितरण, सुझाव है कोई बड़ा कड़ा हो जाना घटनाओं शुरू कर दिया है के साथ एक tubeworm पता चलता है; चित्रा 2ii, एक tubeworm है कि लंबी अवधि के लिए किया गया है केल्सीकृत चलता कड़ा हो जाना सुझाव हित के समय बिंदु से परे चला गया है; चित्रा 2iii ब्याज की हड्डी बन जाना मंच है, जो ऊतकों को खनिज के लिए जिम्मेदार समझने के लिए आगे के विश्लेषण के लिए चुना गया था के साथ एक tubeworm पता चलता है। चित्रा 3 से पता चलता उच्च पीएच मान दोनों calcein धुंधला और SEM-EDX मानचित्रण से अधिक सीए आयन संकेतों के साथ सहसंबद्ध होते हैं। इन टिप्पणियों से, ब्याज के जीवन स्तर से ऊतक एक उच्च पर जांच की गई थीgher संकल्प एक अधिक स्थानीय तकनीक, SEM-EBSD का उपयोग कर। खनिज चरण की खोज करने पर, चित्रा 4 मंदिर के लिए ब्याज और चयनित क्षेत्र विवर्तन विश्लेषण की सामग्री लिफ्ट से बाहर करने के लिए खनिज की स्फटिकता पुष्टि करने के लिए ध्यान केंद्रित आयन बीम के आवेदन से पता चलता है।

आकृति 1
चित्रा 1: tubeworm के intracellular पीएच मानचित्रण (चान एट अल से 2015।)। 71 ज IBMX उपचार के बाद, एक tubeworm, Hydroides एलिगेंस, जो कायापलट की एक धीमी दर का प्रतिनिधित्व intracellular पीएच वितरण में एक महान विविधता को दर्शाता है। डीआईसी छवि (ऊपर बाएं) और 640 एनएम 580 एनएम पर ग्रे मूल्यों से विभाजित पर ग्रे मूल्यों से उत्पन्न समग्र चित्र pseudocolorized (शीर्ष सही) दिखाए जाते हैं। 640/580 एनएम अनुपात से गणना ग्रे मूल्यों intracellular पीएच के लिए आनुपातिक है। PROFIसमग्र चित्र से ग्रे मूल्यों की लेस, tubeworm (नीचे पैनल) के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ शरीर दूरी पर intracellular पीएच मान में परिवर्तित किया गया। उत्सर्जन में intracellular पीएच और 640/580 एनएम अनुपात के बीच संबंधों में इन विट्रो अंशांकन द्वारा स्थापित किया गया था (y = 0.30x - 1.47, आर 2 = 0.934, वाई, ग्रे मूल्य, एक्स, intracellular पीएच)। 8.5 पीएच (लाल रंग में) ऊपर intracellular पीएच के साथ क्षेत्र क्षेत्रों में जहां calcified संरचनाओं पाए गए करने के लिए इसी रहे हैं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन; सी, कॉलर; बी, ब्रान्चियल पालियों; चींटी, anteior; पद, पीछे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: SEM-ईडीएस का उपयोग ब्याज की जीवन स्तर की पहचान करना।
अलग से Tubewormsकायापलट की समय बिंदु नव calcifying चरण आगे के विश्लेषण (i) एक दिन के लिए 1 पद-रूपांतरित tubeworm सीए संकेत के सजातीय वितरण से पता चलता कब्जा करने के लिए (ii) एक तेजी से बढ़ रही है दिन 2 के बाद रूपांतरित tubeworm सीए संकेत की एक छोटी सी अंगूठी चलता जांच की गई (iii) एक धीमी बढ़ रही है दिन 2 पद रूपांतरित tubeworm सीए संकेत के धब्बे से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: (। चान एट अल 2015) लाइव माइक्रोस्कोपी का उपयोग सीए संकेतों की विशेषता। (मैं-चतुर्थ), SEM-ईडीएस (वि सात) और SEM-EBSD (आठ-एक्स)। कैल्शियम आयन के वितरण के रूप में 31 घंटे और 53 घंटे के Hydroides एलिगेंस की कायापलट के बाद कम से calcein संकेत करने के लिए सहसंबद्ध। डीआईसी छवियों (बाएं पैनल, 3 आई और तृतीय) और टीउन्होंने संकेत calcein (बाएं पैनल, 2ii और चतुर्थ) दिखाए जाते हैं। के रूप में एक कम वोल्टेज (5 केवी) SEM छवि में दिखाया गया दिन 2 के बाद रूपांतरित Hydroides एलिगेंस पर correlative इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, calcified संरचनाओं के धब्बे का पता चला (मध्यम पैनल, 3V)। SEM-ईडीएस विश्लेषण मानचित्रण, 20 केवी पर प्रदर्शन किया, कैल्शियम की एक विषम वितरण से पता चलता है (मध्य पैनल, 3vi, सीए, पीले रंग में)। सीए सामग्री कम वोल्टेज (5 केवी) का एक बड़ा सतह विस्तार overlaying tubeworm की छवि को संख्या के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, सीए सामग्री (मोल भार%, दशमलव अंक मौके के स्थान को दिखाने के लिए गठबंधन कर रहे हैं विश्लेषण) की मौके मात्रा का ठहराव से प्राप्त ( 20 केवी पर SEM-एड्स) (मध्यम पैनल के साथ; 3vii)। एक सीए सामग्री अधिक से अधिक 15% के साथ मोल गुम्मट क्षेत्र केल्सीकृत संरचनाओं होने की संभावना है। कैल्शियम समृद्ध क्षेत्रों के SEM-EBSD विश्लेषण के 2viii एक्स सही पैनल में illuastrated है। कैल्शियम समृद्ध क्षेत्रों (सफेद बॉक्स) SEM-ईडीएस परिणामों में पाया के रूप में आगे EBSD के साथ विश्लेषण किया गया (सही पैनल; 3viii) (ii) वृत्त (सही पैनल;3ix) EBSD विश्लेषण साइट इंगित करता है; एक किकुची पैटर्न (सही पैनल; 2x) से पता चलता साइट ईडीएस / EBSD microanalysis सॉफ्टवेयर का इंटरफ़ेस से aragonitic है। सी, कॉलर; बी, ब्रान्चियल पालियों; चींटी, पूर्वकाल; पद, पीछे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: क्रिस्टलीय संरचना की विशेषता मिथ्या-मंदिर का उपयोग (चान एट अल 2015 से।)। (I) क्षेत्र EBSD से एक किकुची पैटर्न का प्रदर्शन एक मंदिर का नमूना तैयार करने के लिए अलग किया गया, (ii) एक केंद्रित आयन बीम (मिथ्या) तकनीक (ऊपर देखें) द्वारा excised हटा आसपास सामग्री, (iii) सामग्री एक का उपयोग कर हटा लिया गया था टंगस्टन जांच (साइड देखें), (iv) ~ 200 एनएम, जो एक कम वोल्टेज पर प्राप्त किया गया था के अंतिम मोटाई के साथ नमूना। में (v) थे परिक्रमा क्षेत्रएक मंदिर (vi) में चयनित क्षेत्र विवर्तन पैटर्न की उपस्थिति के लिए विश्लेषण, एंरेगोनाइट की एक एकल क्रिस्टल पैटर्न दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

लाइव ऑप्टिकल इमेजिंग एक बहुकोशिकीय जीव में सेलुलर घटनाओं के अवलोकन के लिए एक उपयोगी तरीका है। इधर, आंतरिक पीएच और कैल्शियम आयन संकेतक खनिज स्थलों पर आयनों के प्रवाह को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया। इन क्षेत्रों में, सक्रिय आयन पंप कड़ा हो जाना 2, 3 सक्षम करने के लिए पीएच और सीए 2 एकाग्रता तरक्की के लिए आवश्यक है। जब एक जीव का अध्ययन करने के फ्लोरोसेंट अणु आवेदन, यह सुनिश्चित करने के लिए है कि इस्तेमाल किया एकाग्रता नगण्य विषाक्तता है और एक physiologically प्रासंगिक रास्ते में प्रदर्शन करने के लिए सक्षम बनाता है जीव महत्वपूर्ण है। एक कम धुंधला एकाग्रता कम विषाक्त हो सकता है और आम तौर पर एक लंबे समय तक धुंधला हो जाना समय 10 के साथ युग्मित है। यह ऊष्मायन समय के दौरान लार्वा के एक कम घनत्व रखने के लिए, धुंधला अवधि में ऑक्सीजन के अभाव और अपशिष्ट संचय को कम करने में महत्वपूर्ण है।

पहले मिथ्या / मंदिर तरीकों का पीछा है, जो एक स्थानीय शामिल करने के लिएब्याज के क्षेत्र में, यह जीवन स्तर और SEM-एड्स और SEM-EBSD की तरह कम संकल्प तरीकों का उपयोग कर ब्याज के ऊतकों के माध्यम से स्क्रीन के लिए महत्वपूर्ण है। Backscattered मोड के तहत नमूना अवलोकन रिश्तेदार मौलिक रचना जहां हल्का विपरीत भारी परमाणु वजन 11 करने के लिए संबद्ध के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है। इसलिए, SEM-बीएसई छवियों को भी जहां कैल्शियम आयनों और आज़मियम दाग लिपिड ग्लोबुलेस जैसे भारी तत्वों स्थित हैं के एक अनुमान प्रदान करते हैं। SEM-ईडीएस विश्लेषण नमूनों पर कैल्शियम आयनों की अधिक विशिष्ट मानचित्रण की अनुमति देता है। हालांकि, यह क्रिस्टलीय CaCO 3 की उपस्थिति की पुष्टि नहीं करता। SEM-EBSD क्रिस्टलीय संरचना का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, हालांकि पारंपरिक तरीकों EBSD एक पॉलिश सतह 12 की आवश्यकता है। यह अध्ययन दर्शाता है कि कैसे एक unpolished नमूना पर SEM-EBSD उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं। एक 20 केवी बीम वर्तमान नमूना की सतह पर विश्लेषण के अधिक से अधिक गहराई में सक्षम बनाता है। इसलिए, EBSD पता लगाने के लिए एक वांछनीय विधि हैbiomineral की उपस्थिति, विशेष रूप से समुद्री लार्वा की तरह छोटे, अक्षत जैविक नमूने पर। हालांकि unpolished नमूने नकारात्मक झूठी बाहर दे जब खनिजों के बारे में 70 डिग्री पर डिटेक्टर का सामना नहीं कर रहे हैं, एक किकुची पैटर्न ब्याज 13 के क्षेत्र में एक खनिज चरण के स्पष्ट सबूत माना जाता है देखकर होता।

संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) सामग्री 14 का एक व्यापक रेंज के संरचनात्मक लक्षण वर्णन अनुमति देता है। केंद्रित आयन बीम (मिथ्या) साइट विशेष निकासी और मंदिर विश्लेषण 15 के लिए विशिष्ट आयामों के साथ एक नमूना तैयार करने के लिए अनुमति देता है। इसलिए, मिथ्या / मंदिर तकनीक एक स्थानीय क्षेत्र में नव जमा biomaterials का विश्लेषण करने के लिए एक उपयुक्त तरीका है। संयुक्त मिथ्या-SEM के साधन भी एक एकीकृत इलेक्ट्रॉन बीम स्तंभ के उपयोग के माध्यम से एक नमूना के नुकसान मुक्त अवलोकन अनुमति देते हैं। नमूना के टंगस्टन धूम कोटिंग चालकता बढ़ जाती है और सीमा मैं ionनमूना 16 वर्ष की mplantation और विकिरण नुकसान। एक कम समय ध्यान केन्द्रित के साथ एक पतले ध्यान केंद्रित आयन बीम का उपयोग कार्बनिक पदार्थों की मिलिंग में सक्षम बनाता है। मिथ्या-SEM के अंदर, ब्याज की एक विशेष सुविधा एक थोक नमूना से निकाले और मंदिर विश्लेषण 17 के लिए पारदर्शिता इलेक्ट्रॉन को पतला किया जा सकता है। आयन बीम के उच्च ऊर्जा के कारण, क्रिस्टलीय सामग्री अनाकार गाया जा सकता है। यह जब मंदिर के विश्लेषण के लिए एक पतली लामेल्ला तैयारी और अनाकार परत को हटाने के लिए एक कम वोल्टेज को बढ़ाने आयन बीम का उपयोग कम किया जा सकता हो सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hexamethyldisilazane  Electron Microscopy Sciences 16700(EM)
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 19192
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine ThermoFisher Scientific PHZ1124
Nigericin, Free Acid ThermoFisher Scientific N7143-5MG
35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat ThermoFisher Scientific D110400
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate ThermoFisher Scientific C-1271
BDH Potassium Chloride, ACS Grade VWR BDH0258-500G
Paraformaldehyde
reagent grade, crystalline		 Sigma P6148
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis Wako Pure Chemical Industries, Ltd 083-01095
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis Wako Pure Chemical Industries, Ltd 199-02185
Calcein Sigma C0875
FASW Iwaki Co. Ltd. Rei-sea Marine
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm ADVANTEC A045A047A
ethanol Wako Pure Chemical Industries, Ltd 051-00476
Artificial seawater for buffers by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf
Sodium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 191-01665
Potassium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 163-03545
Magnesium Chloride Hexahydrate Wako Pure Chemical Industries, Ltd 135-00165
Calcium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 039-00475
Sodium Sulfate Wako Pure Chemical Industries, Ltd 197-03345
Hydrochloric Acid Wako Pure Chemical Industries, Ltd 089-08415
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) Wako Pure Chemical Industries, Ltd 207-06275
2-aminopyridine Wako Pure Chemical Industries, Ltd 011-02775
Orion 5-star Plus pH meter Thermo Scientific
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP Thermo Scientific
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 Zeiss
ImageJ NIH, Bethesda, MD, USA
HRTEM H500 Hitachi
SU6600 VPSEM Hitachi
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system Hitachi 

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References

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Chan, V. B. S., Toyofuku, T., Wetzel, G., Saraf, L., Thiyagarajan, V., Mount, A. S. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. J. Vis. Exp. (120), e55164, doi:10.3791/55164 (2017).

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