Karakterisering av förkalkning händelser Använda Live Optiska och elektronmikroskopi tekniker i en marin Tubeworm

Introduction

Biomineralisering är en komplex serie av händelser, som överbryggar en svit av cellulära aktiviteter resulterar i produktionen av utsökt beställda mineraler ^1. Utmaningen är att karakterisera både dynamisk cellulär process och den sofistikerade mineral strukturer med hjälp av en kombination av optiska och elektronmikroskopi metoder. En förhöjning av intracellulärt pH gynnar bildningen av CaCO _{3-kristaller,} därav, att identifiera den livsstadium som har en ökad pH avslöjar den tid då förkalkning kommer sannolikt att förekomma ^{två, tre.}

De rörmaskar från familjen serpulidae är vanliga calcifiers i havet ^4. Det är också en populär ryggradslös modell för marin forskning, särskilt i påväxt ^{5, 6.} I denna studie, processen för förkalkning i mineraliserings fack During biomineralisering observeras. Den snabba processen med metamorfos inkluderar uppkomsten av kalciumkarbonatstrukturer ^{7, 8.}

Vi visar hur den interna pH mätningar kan utföras på tubeworm, och hur livsstadier och vävnader som är relevanta för förkalkning kan screenas. Efter stadiet av intresse identifieras, kan vävnaden ansvarig för förkalkning karakteriseras med en högre upplösning med hjälp av elektronmikroskopi metoder. Med hjälp av fluorescerande mikroskopi, vi bestämma den tid som krävs för kalciumkarbonat för att visas efter metamorf induktion. En liknande skede av livet därefter visualiseras med SEM-EDS för elementarkompositionsfördelning, och den avsatta mineral analyserades med hjälp av två olika elektronmikroskopi metoder, särskilt SEM-EBSD och FIB-TEM.

Protocol

1. Screening för levnadsstadier och vävnaden av intresse med Live Imaging

1. Kultur den marina larver till kompetens enligt tidigare rapporterade metoder ^{6, 7, 9.} Inkubera tubeworm larver vid 5 larver per ml densitet med filtrerat havsvatten med 10 iM Snarf-01:00 natten. Täck behållaren med aluminiumfolie för att skydda den fluorescerande sonden från fotoblekning.
2. Observera larver med hjälp av en dissektion mikroskop. Kompetent tubeworm larver redo för metamorfos kommer att simma i en riktning framåt i stället för en cirkulär rörelse.
3. Överför behöriga larver till en 60 um mesh. Tryck på nätet mot en petriskål, vilket ger en bra tätning för att behålla vätska. Snabbt på tätningen för att frigöra och kassera havsvatten innehållande fluorescerande färgämne, behålla larverna.
4. Tvätta larverna med filtrerat artificiellt havsvatten (FASW) två gånger, mednoga med att inte torka ut larverna i processen.
5. Placera 10-20 larver i tunna glas botten rätter med 5 ml FASW innehållande 10 ^-4 M isobutylmetylxantin (IBMX) för observation av metamorfos process.
6. Sätt filter kuberna för att detektera Snarf-1-signal (Kanal 1: Ex 510/25 Em 580/30, Kanal 2: Ex 510/25 Em 640/35), och DIC bild av larver.
7. Placera metamorphosing larver under 20X målet, då optimera slutartiden (100-300 ms) tillräckligt snabbt för att se till att en tydlig bild av levande djur fångas.
8. Ställa en xm avstånd för att fånga en Z-stapel av alla tre kanalerna, vid avbildning ett levande djur, imaging varje skikt för alla tre kanalerna innan vi går vidare till nästa lager av z-riktningen skulle möjliggöra en bättre korrelation mellan kanaler.
9. Export gråskalebilder för alla kanaler och lager som TIF-filer från mikroskopet programvara: Arkiv | export | Filtyp TIF | Start.
10. Med hjälp av ImageJ, import bildsekvensen för varje kanal: Arkiv | import | Bildsekvensen.
    1. Om du vill importera Kanal 1 λ ₁ ^em anger startbilden 3 och ökning: 4.
    2. Om du vill importera Kanal 2 λ ₂ ^em, anger startbilden 4 och ökning: 4.
11. Generera en sammansatt bild genom att dividera λ ₂ ^em av λ _en ^em för varje skikt pixel för pixel (Process | Bild Calculator ... | bildfil 640 nm "klyftan" bildfil 580 nm), dvs. 640/580 nm förhållande.
12. Välj bild | Uppslagstabeller | 16 färger.
13. Välj Analysera | Verktyg | Kalibreringsfältet.
14. Inspektera de olika skikten, som identifierar det skikt som innehåller den mest heterogenitet. Detta ger den mest användbara informationen om intern pH distribution.
15. Använda förhållandet mellan 640/580 nm förhållande och pH, ​​konstruera en kurva profil för att visualisera fördelningen av inre pH.

1. Efter natten färgning av cirka 20 larver med 10 iM Snarf-01:00, lägg i stamlösningar av nigericin och KCl för att kompensera 50 iM nigericin och 150 mM KCl för kalibrering.
2. Justera pH för kalibrerings AFSW med utspädd NaOH eller HCl, till dess att ett pH omkring 5,9 erhålls. Notera det exakta pH-värdet. Mätning av pH med en pH-mätare med en glaselektrod som har kalibrerats genom havsvatten baserad 2-amino-2-hydroximetyl-1,3-propandiol (Tris) och 2-aminopyridin ^9.
3. Överföra ett målat tubeworm larver tillsammans med en vätska med en känd pH till ett torrt och rent skålen för mätning av signaler intensitet vid 640 nm och 580 nm.
4. Upprepa steg 2,2 och 2,3 för fyra pH punkter som sträcker sig från 5,9 till 9,9. De representerar ett intervall av fysiologiskt relevanta värden.
5. Kontrollera att se signalerna uppträder homogent i hela djurkroppen. Detta tyder på att den intracellulära pH har equilibrated med miljö havsvatten.
6. Bild på tubeworm larver vid fem olika havsvatten pH miljöer, registrera intensitet visas som "gråvärden" vid 640 nm och vid 580 nm, dvs λ ₂ ^{ex moms} och λ _en ^exkl.

3. Analys av Propportionell bilddata

1. Ange de grå värden mätt från fem slumpmässiga platser eller från ett område av intresse på ett kalkylark.
2. Kontrollera att se fem punkter kalibrering visade ett linjärt förhållande för att indikera intracellulär pH (t.ex. ekvation som y = 0.30x - 1,47; y = grå värde, x = pH, R = 0,934).
3. Beräkna intracellulära pH-värden från ekvationen med hjälp av den uppmätta 640/580 nm intensitetsförhållandet i steg 1,13.

4. Prov Bevarande, uttorkning och Montering för elektronmikroskop

1. Bevara stadiet av intresse med 4% paraformaldehyd. i den här studienFastställa de rörmaskar 2-4 dagar efter fastsättning, hålla djuren i fixativ tills analys.
2. Att arbeta i ett dragskåp, post-fixa provet med 1% osmiumtetroxid vattenlösning under 30 min för att minimera vävnads krympning under dehydratiseringsprocessen.
3. Dehydratisera provet med en graderad etanolserie: 50% etanol under 5 min, 70% etanol under 5 min, 85% etanol under 5 min, 95% etanol under 5 min, och slutligen absolut etanol under 5 minuter två gånger.
4. Att arbeta i ett dragskåp, lägg till en 1: 1 lösning av etanol och hexametyldisilazan (HMDS) till provet, vilket gör att vätskan avdunstar helt.
5. I dragskåp, tillsätt 100% HMDS med förlagan, vilket gör att vätskan avdunstar helt.
6. Med hjälp av en diamantkniv, införa några nedskärningar odlingsskålen, som omger några rörmaskar. Med locket på, håller skålen botten mot en aluminium påbörjad att bryta skålen.
7. Enligt en dissektion mikroskop, hitta en bruten pjäs som innehåller en intakt tubeworm.
8. Applicera silverfärg till en aluminium stub och säkra fragmentet till stub noggrant. Måla runt kanterna på plast fragmentet för att reducera laddning.

5. Hitta en kalcium rika region med SEM-EDS

1. Säkra prov stöta på provhållaren.
2. Mät höjden på hela enheten mot mätaren försedd med mikroskopet, justera höjden genom att lossa låsbrickan och rotera posten tills provet är i standardhöjd eller ange höjden som registrerats.
3. Släppa in luft i mikroskop växlingskammaren och svänga kammardörren öppen. Skjut provhållaren på änden av utbytesstaven. Stäng sedan och evakuera kammaren.
4. Öppna avstängningsventilen och skjut utbytesstaven in mot mikroskopets kammaren. Skjut utbytesstaven hela vägen in till fullo sittplats provhållaren i mikroskop scenen. Ta bort utbytesstaven och stänga grinden ventilen.
5. input than prov dimensioner och skicka scenen till ursprungsläget att placera provet under elektron kolumnen.
6. Ställ kammaren vakuumnivån till 20-30 Pa i VP-SEM-läge. Ställa elektronaccelerationsspänning till 20 kV och vrid hög spänning på.
7. Höja bordet till en provarbetsavstånd av 10 mm. Skaffa en levande foder och leta reda på provet. Optimera bilden justerar astigmatism och fokus som behövs.
8. Öppna SEM-EDS-programmet och välj läge alternativet EDS-SEM. Välj menyalternativet för att köra en EDS karta.
9. Ändra samlingslins och bländare för att uppnå en dödtid på ~ 30% vid en processtid av tre som övervakas genom hastighetsmätare i SEM-EDS-programmet. Kör balk och bländare inriktningsförfaranden efter att göra några ändringar i balk inställningar.
10. Välj en förstoring så att en enda organism fyller hela synfältet. Aktivera korrigerings alternativ drift och fånga en bild i SEM-EDS-programmet.
11. förvärva map data med organismen fylla upp hela synfältet, med användning av en uppehållstid av 50-100 ms. Kör kartan tills data visar distinkta lokalisering av Ca i organismen (ca 15 min).
12. För att erhålla punkt kvantifiering data ändra processtiden till sex och justera elektronsonden att förvärva en dödtid på ~ 30%. Kör inriktnings steg och optimera bilden efter behov.
13. Välj punkt och ID alternativet i SEM-EDS-programmet och få en annan bild. Använda enda verktyget, klicka på områden som dök Ca rik på EDS kartan, liksom Ca bristfälliga områden för jämförelse. Scanna varje punkt för en levande tid av 30 s.

6. Identifiera Crystallographic Information kalcium rika regioner Använda SEM-EBSD

1. Ta bort plast fragment innehåller exemplar av intresse från platt prov påbörjad och fästa till den sluttande ytan av en 45 ° i förväg lutas stöta användning av silver ledande lim.
2. Skruva stubben på prov häldre och position den vinklade ytan på stubben (med prov) mot framsidan av provhållaren. Sätt provhållaren in i kammaren mikroskopets hjälp av växlingskammaren.
3. Ställa kammaren vakuum till 30 Pa och elektronaccelerationsspänning till 20 kV. Skicka provet under elektron kolonnen och luta stadium 25 ° för att placera provytan cirka 70 ° från normalen till elektronstrålen. Vrid hög spänning på.
4. Höj scenen till ett arbetsavstånd på ~ 18 mm. Använd styrkulan för att flytta scenen och hitta ett exemplar. Öka förstoringen att rama särdrag av intresse. Rikta strålen och optimera bilden efter behov.
5. Öppna SEM-EDS program i EBSD läget. Välj kalcit och aragonit som faser av intresse. Sätt i EBSD kameran på ett avstånd av 154 mm. Ställ kameraförhållanden till 1 x 1 binning och en 100 ms ramtid. Med hjälp av en snabb stråle raster, förvärva en bakgrund.
   ANMÄRKNING: En annorlunda bildhastighetkan krävas beroende på elektronsonden; justera sonden eller kamerabildhastighet för att uppnå en signal av omkring 90%.
6. Ta en bild i SEM-EDS-programmet. Använd plats analysverktyget och klicka någonstans på bilden för att skanna strålen på den punkten. Observera kameran fönstret för att se om några Kikuchi mönster upptäcks.
7. Klicka på olika delar av bilden som ska skannas potentiella förkalkning platser, observera kamera fönster vid varje punkt för att se om Kikuchi band är närvarande. Om mönster finns och matcha något av de utvalda faserna i databasen, kommer de automatiskt att indexeras.

7. TEM Provberedning Använda FIB-SEM

1. Sputter coat de preparerade SEM provet med platina eller liknande material för att skapa ett ledande lager.
   1. Placera tidigare fastställda, torkade och monterade prover in i huset av sputter beläggaren och slå på strömmen för att börja pumpa kammaren nedåt.
   2. När kammaren vakuum läser 40 mTorr eller mindre, vrid gasen slå på och öka argongasflödet för att nå en kammartryck på 200 mTorr. Justera gasflödet för att uppnå ett slutligt kammartryck på 80 mTorr.
   3. Vrid spänningsomkopplaren på och öka spänningen att nå en ström av 15 mA. Ställ in timern och päls under en längre tid (~ 10 min) för att skapa ett tjockt lager (~ 60 nm) som skyddar provytan från jon bestrålning skador. Reglera spänningen för att bibehålla en stabil 15 mA ström.
   4. När du är klar, avstängning beläggaren för att frigöra vakuumet och avlägsna provet.
2. Skruva basen av det beredda, spotta belagda provet på M4 skruven posten instrumentets provhållaren. Dra åt med handkraft, lossa låsmuttern och vrid sedan provhållaren efter att ändra höjden på enheten. Använd laserhöjdmätaren och justera höjden för att vara inom en mm (= 0,04 inches som visas i video) i standard supplied med instrumentet.
3. Stäng alla pistolventiler i FIB-SEM, och sedan släppa in luft i eucentric scenen luftslussen. När trycket har utjämnats med omgivningen, skjuter luftslussen öppen och anbringa provhållaren på stiften i utbytesstaven. Vrid ratten på slutet av utbytesstaven till "lock" -läget. Stäng luftslussen och evakuera luftslusskammaren.
4. När eucentric scenen luftslussen har evakuerats och trycket överensstämmer med den FIB-SEM kammare, öppna slussventilen och sätt i provet genom att trycka in utbytesstaven. Skjut utbytesstaven ända in för att ge plats provhållaren i instrumentet eucentric stadiet, vrid sedan utbytesstaven till "låsa upp" -läge. Skjut utbytesstaven tillbaka ut och stänga grinden ventilen.
5. Flytta scenen för att placera provet i jonstrålen kolumnen. Öppna avstängningsventiler och skaffa en levande jon-inducerad sekundär elektronbild av FIB. Använd låg förstoring och ensnabb rastersvep för att minimera jon skador. Återställ fokus för normal observation trålen och höja Z höjden på scenen tills provet är i fokus. Vid denna punkt provet är vid korspunktsläge där både jon- och elektronstrålarna är fokuserade på samma plats.
6. Använda den sekundära elektronbilden från SEM, lokalisera området av intresse i provet, med hjälp av styrkulan för att flytta provet runt. Områden av intresse är Ca rika områden som tidigare bestämts av EDS kartläggning. Rotera det stadium som nödvändigt för att få de funktioner av intresse i linje med ramen i fönstret.
7. På FIB fönster gränssnitt, fånga en snabb överblick av provet med en förstoring av 1,000X med ytterligare 2X digital zoom och dra en ~ 8 pm x 2 pm nedfall mall över området av intresse. Förstoringsgraden av deponeringslåda kan justeras för att rymma funktioner av olika storlekar. Ställ förstoftningskälloma villkor att avsätta kol med hjälp av en 40 kV, 0,09 nA balk, med användning av en uppehållstid av 0,5 | is i 5 min.
8. Efter avsättning av kol, modifiera beläggningsbetingelserna för att avsätta volfram med användning av en 40 kV, 0,7 nA balk, och insättning i 5 min för att generera en ~ 2-3 | im volfram cap.
9. Fånga en FIB bild med observationstrålen och använda microsampling sputter verktyget för att rita ett mönster av fyra rutor runt volframlocket. Ställ in övre och nedre rutor till ca 15 um x 8 pm; den högra rutan 10 um x 5 um, och den vänstra rutan 6 pm x 5 pm, eller tillräckligt stor för att omge området av intresse.
   1. Modifiera tillverkningsbetingelser för att skära med användning av en 40 kV, 19 nA balk, och en uppehållstid av 50 ^ s, och 3-4 scan ramar för varje låda. fabricera sedan mönstret. Efter tillverkning, intresseområdet, med skydds C och W skikt, kommer att likna en ö, med alla intilliggande material avlägsnas på toppen, botten och höger sida.
10. Luta steget 58 ° för att sätta sample ytnormalen till elektron kolonnen och vid en brant vinkel i förhållande till jon-kolonn. Leta reda på baksidan av provet "ö" med FIB och fånga en ögonblicksbild på 1,000X förstoring och 2-4X digital zoom.
11. Rita en ~ 15 pm x 2 pm sputter mönster över botten baksidan av provet "ö" i slutet av där det är synligt. Tillverka lådan med hjälp av en 4 nA stråle för 3 minuter, eller tills strålen har skurit genom botten av provet "ö".
12. Luta eucentric steget -58 ° från den aktuella positionen (tillbaka till noll). Sätt volfram microsampling sonden genom att klicka på "Probe In" i FIB-gränssnittet. Välj "MS" på scenen kontrollpanelen och använd styrkulan för att flytta sonden över toppen av provet.
13. Förvärva en levande foder från FIB vid en förstoring av 1 kx och placera proben så att spetsen är direkt ovanför den högra sidan av volfram locket på mikroprov. Under iakttagande en levandeSE bild från SEM, använda Z reglaget på scenen panelen för att sänka sonden tills den kommer i kontakt med volfram cap. En summer ljuder när kontakt har tagits.
14. Fånga en stillbild av FIB med hjälp av en 40 kV, 0,01 nA balk, vid en förstoring av 1,000X och 2X digital zoom. Använda deponeringsverktyget för att rita ett 2 | j, m x 2 | im rutan över spetsen av sonden när den har kontaktat den volfram locket på mikroprov.
    1. Fastställa villkoren för att avsätta volfram med hjälp av en 40 kV, 0,09 nA balk, i 2 min och en uppehållstid av 0,5 ps. fabricera sedan mönstret.
15. Dra en ~ 2 ^ m x 5 | am sputter mönster över den vänstra änden av mikroprov "arm" (där den fortfarande är ansluten till huvuddelen av provet). Tillverka mönstret med hjälp av en 40 kV, 0,7 nA stråle, under 2 minuter, eller tills pip indikerar att mikroprov har lossnat från samlingsprovet.
16. Använd Z kontrollratten för att höja proben med tillhörande mikroprov tillsDet rensar samlingsprovet, sedan dra tillbaka sonden. Skicka eucentric stadiet till antingen hem eller Exchange position.
17. Placera en koppar halv-grid i en sidoöppning hållare och ladda hållaren i sidoöppning stadiet reningskammaren. Evakuera kammaren och sätt sidoingångshållaren. Ställ hållaren till FIB läge.
18. Tryck Side på scenen kontrollpanelen och använd styrkulan för att få halv-grid i sikte på FIB-skärmen. Flytta för att rengöra området av halv nätet och använda Z ratten för att bringa ytan i fokus.
19. Tryck Probe in för att sätta sonden trycker MS på scenen kontrollpanelen och använd styrkulan och Z ratten för att placera mikroprov över halv nätet. Sänk sonden tills mikroprov kontakt med rutnät.
20. Ta en bild på FIB vid 1,000X förstoring (2X zoom). Använda deponerings verktyget och dra en ~ 10 | im x 3 um mönster över den nedre sidan av den mikroprov. Insättning volfram med en 40 kV, 0,7 nA balk, med hjälp av en uppehållstid time av 0,5 ^ s för 3 min.
21. Använda sputter verktyget och rita en liten ett xm x 3 ^ m mönster över sondens spets. Fabricera mönstret med användning av en 40 kV, 0,7 nA stråle vid en uppehållstid av 3 ms för att klippa sonden bort från mikroprov. Dra tillbaka sonden en gång gratis.
22. Fånga en FIB bild på 5,000X förstoring och dra två sputter mönster 7 pm x 4 pm på toppen och botten av mikroprov, lämnar en ~ 1 pm gap mellan rutorna. Centrera mönster för att inte klippa vänster och höger sida av mikroprov. Fabricera båda mönstren med hjälp av en 40 kV, 4 nA stråle, och en uppehållstid av 3 | is, under 2 minuter, inställning av raster riktning mot mitten av mikroprov.
23. Fånga en annan bild med hjälp av FIB observationstrålen mot 5,000X. Ändra storlek på tidigare sputter rutorna till ~ 6,5 pm x 1 pm, närma sig varandra för att lämna en spalt på ~ 0,5 um, och tillverka med hjälp av en 40 kV, 0,7 nA balk.
24. Luta sidoöppning steget 0,5 ° och mössature annan FIB bild. Ändra storlek förstoftningskälloma rutorna till 6 um bred. Positionera den övre mönster över den övre sidan av den mikroprov och fabricera med användning av en 40 kV, 0,7 nA stråle. Luta -0,5 ° och upprepa med den nedre sputter mönstret och bottensidan av mikroprov.
25. Ytterligare minska bredden mönstret genom ~ 0,5 pm. Luta 0,5 ° och förstofta den övre sidan av den mikroprov med användning av en 40 kV, 0,09 nA stråle. Upprepa med undersidan vid -0,5 ° lutning.
26. Luta scenen 2,2 ° och skaffa en FIB bild på 10000. Ändra storlek sputter mönster till 5 um breda och ändra balkförhållanden till 5 kV, 0,03 nA. Placera den övre mönster över den övre sidan av mikroprov, rätt upp den övre kanten, och tillverka. Luta -2,2 ° och upprepa med den nedre sidan och botten mönster.
27. Upprepa 5 kV fräs steg tills mikroprov blir elektron transparent (~ 100 nm tjocklek). När sökningen är klar, nära gunvalves och ta bort sidoöppning hållare.

8. Obtaining Selected Area Diffraction Pattern på en TEM

1. För att förbereda ett instrument för analys, fylla båda Dewar kolvar med flytande kväve och ställa den accelererande spänningen till 300 kV.
2. Efter provberedning med hjälp av FIB, ta bort sido posten hållaren från FIB-SEM och justera stiftposition så att innehavaren längden överensstämmer med den 300 kV TEM. Vrid spetsen på hållaren till rätt observations position för att återigen jämföra det med standard TEM hållaren korrekt prov orientering.
   1. Alternativt, ta bort halv-grid med bifogade lameller från FIB-SEM hållare och plats i standard TEM hållaren.
3. Ladda provhållaren i utbyte kammare TEM och evakuera kammaren. Se till att instrumentet pistolventilen är stängd när luft släpps in i växlingskammaren. När växlingskammaren har pumpats ner, kommer ett alarm att ljuda. Rotera provhållaren medurs och låta Vacuum att dra provhållaren in till första stoppläget.
4. Låt instrumentet vakuum att återhämta sig, och sedan öppna pistolen ventilen. Återställ fokus och zooma till en förstoring av ca 10000.
5. Använd inriktnings vreden för att förskjuta strålen till mitten av fosforskärmen. Kontrakt och expandera balken och se till att alla strålrörelse är koncentriska. Justera för kondensor stigmatism behov.
6. Rotera provhållaren motsols och tillåter vakuumet att dra hållaren fullständigt in i kolonnen. Använd scenen rörelse rattar för att navigera och hitta provet.
7. Öka förstoringen på provet och justera Z-höjd tills provet är i fokus. Använd de optiska okular som behövs.
8. Sätt kameran och ta bort fosforskärmen. Expandera balken som behövs för att undvika oversaturating kameran. Justera parametrar fokus och kamera, sedan börja förvärv för att ta en bild.
9. Att förvärva ett diffraktionsmönster, första centrerakännetecknet av intresse. Ta bort målet öppningen och sätt i diffraktion öppningen.
10. Byt till brytningslinsläget genom att trycka på DIFF-knappen på kontrollpanelen och använd DIFF kontrollratten för att krympa strålen.
11. Sätt i blanker som krävs för att förhindra centrum av diffraktionsmönstret från brinnande kameran eller fosforskärm. Starta förvärv av kameran för att ta en bild av mönstret.

Representative Results

Följande är några observationer av förkalkning processen under metamorfos av tubeworm. Figur 1 visar att de pH-värden i närheten av kragen regionen är högre än de andra vävnader efter metamorfos. Figur 2i visar en tubeworm med homogen fördelning av Ca, vilket tyder på några större förkalkning händelser har börjat; Figur 2ii visar en tubeworm som har förkalkade under en längre period, vilket tyder på förkalkning har gått bortom tidpunkten av intresse; Figur 2iii visar en tubeworm med förkalkning skede av intresse, som valdes för ytterligare analys för att förstå vävnaden ansvarig för mineralisering. Figur 3 visar de högre pH-värden är korrelerade med de högre Ca ion signaler från både calcein färgning och SEM-EDX kartläggning. Från dessa observationer var vävnad från stadiet av intresse undersöktes vid en hiGher upplösning med en mer lokal teknik, SEM-EBSD. På upptäckten av mineralfasen, Figur 4 visar tillämpningen av fokuserad jonstråle för att lyfta ut materialet av intresse för TEM och valt område diffraktion analys för att bekräfta kristalliniteten av mineralet.

Figur 1: Intracellulär pH kartläggning av tubeworm (från Chan et al 2015).. Vid 71 h efter IBMX behandling, en tubeworm, Hydroides elegans, vilket motsvarar en långsammare metamorfos visar en stor heterogenitet i den intracellulära pH fördelningen. DIC bild (överst till vänster) och pseudocolorized sammansatta bilder som genereras från de grå värden vid 640 nm dividerat med gråvärden vid 580 nm (överst till höger) visas. De beräknade gråvärden från 640/580 nm kvoten är proportionell mot den intracellulära pH. Profiles av de grå värden från sammansatta bilder, omvandlades till intracellulära pH-värden över avståndet utmed de längsgående kroppsaxel tubeworm (nedre panelen). Förhållandet mellan intracellulära pH och 640/580 nm förhållandet i emission upprättades in vitro kalibrering (y = 0.30x - 1,47; ^R2 = 0,934; y, grå värde, x, intracellulär pH). Regioner med intracellulära pH över pH 8,5 (i rött) är motsvarande de regioner där förkalkade strukturer hittades. Skalstrecken = 100 pm; c, krage; b, branchial lober; myra, anteior; post, bakre. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Identifiera stadiet av intresse med användning SEM-EDS.
Rörmaskar vid olikatidpunkten för metamorfos screenades för att fånga den nyligen kalciumbeläggning skede för vidare analys (i) En dag ett efter-metamorphic tubeworm visar homogen fördelning av Ca-signal (ii) En snabbare växer dag 2 efter metamorf tubeworm visar en kort ring av Ca-signal (iii) En långsammare växer dag två efter metamorf tubeworm visar fläckar av Ca signal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Karakterisering av Ca signaler med användning av levande mikroskopi (från Chan et al 2015.). (I-iv), SEM-EDS (v-vii) och SEM-EBSD (viii-x). Fördelningen av kalciumjoner som korrelerad till kalcein signal vid 31 h och 53 h efter metamorfos av Hydroides elegans. DIC bilder (vänstra panelen, 3i och III) och than Calcein signal (vänster fält, 2ii och iv) visas. Korrelativ elektronmikroskopi på dag 2 efter metamorphic Hydroides elegans detekterade fläckar av förkalkade strukturer, såsom visas i en lägre-spänning (5 kV) SEM-bild (mellersta panelen, 3v). SEM-EDS analys kartläggning, vid 20 kV, visar en ojämn fördelning av kalcium (mitten panel, 3vi, Ca, i gult). Ca Innehållet presenteras som siffror liggande större yta detalj med lägre spänning (5 kV) bild av tubeworm, Ca innehåll (mol vikt%, är decimaler i linje för att visa placeringen av platsen analyser) som erhållits från plats kvantifiering ( med SEM-EDS vid 20 kV) (mitten panel, 3vii). Regioner med en Ca innehåller mer än 15 mol vikt% kommer sannolikt att vara förkalkade strukturer. SEM-EBSD analys av kalcium rika regioner är illuastrated i den högra panelen av 2viii-x. Kalcium rika regioner (vit ruta) som återfinns i SEM-EDS resultat analyserades vidare med EBSD (högra panelen, 3viii) (ii) Cirkeln (högra panelen;3ix) indikerar EBSD analysstället; en Kikuchi mönster (högra panelen, 2x) föreslår platsen är aragonitiskt från gränssnittet för EDS / EBSD mikroanalys programvara. c, krage; b, branchial lober; myra, anterior; post, bakre. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Karakterisering av kristallstruktur med hjälp av FIB-TEM (från Chan et al 2015).. (I) Det område som uppvisar en Kikuchi mönster från EBSD skars för framställning av en TEM prov, (ii) avlägsnas omgivande materialet ut genom en fokuserad jonstråle (FIB) teknik (uppifrån), (iii) material lyftes med hjälp av en volfram sond (från sidan), (iv) provet med en slutlig tjocklek av ~ 200 nm, som erhölls vid en lägre spänning. Inringade området i (v) varanalyserades för närvaro av selected area diffraktionsmönster i en TEM (vi), som visar en enda kristall mönster av aragonit. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Levande optisk avbildning är en användbar metod för att observation cellulära händelser i en multicellulär organism. Här har den interna pH och kalcium jon indikatorer används för att mäta flödet av joner vid de mineraliseringssajter. I dessa regioner är aktiv jon pumpning krävs för att höja pH och Ca ^{2 +} koncentration för att möjliggöra förkalkning ^{2, 3.} Vid tillämpning fluorescerande molekyler för att studera en organism, är det viktigt att se till att den använda koncentrationen har försumbar toxicitet och möjliggör organismen att utföra på ett fysiologiskt relevant sätt. En lägre färgning koncentrationen skulle vara mindre giftiga och oftast i kombination med en längre färgning tid ^10. Det är viktigt att hålla en låg densitet av larver under inkubationstiden, vilket minimerar syrebrist och ansamling av avfall i färgning perioden.

Före fullfölja FIB / TEM metoder, vilket innebär en lokalregionen av intresse, är det viktigt att screena genom stadiet och vävnad av intresse genom att använda lägre upplösning metoder som SEM-EDS och SEM-EBSD. Observation provet i bakåtspridda läge möjliggör visualisering av relativ grundämnessammansättningen där ljusare kontrast korrelerar till tyngre atomvikt ^11. Därför SEM-BSE bilder ger också en uppskattning av var tyngre element som kalciumjoner och osmium färgade lipid kulor är belägna. SEM-EDS-analys ger mer specifik kartläggning av kalciumjoner på proverna. Men det inte bekräfta närvaron av kristallint CaCO _3. SEM-EBSD möjliggör detektion av kristallina strukturer, även om konventionella EBSD metoder kräver en polerad yta ^12. Denna studie visar hur SEM-EBSD på en opolerad prov kan ge värdefull information. En 20 kV strålströmmen möjliggör större djup analys på provytan. Därför är EBSD en önskvärd metod för att upptäckaförekomsten av biomineral, i synnerhet små, intakta biologiska prover som marina larver. Även om opolerade proverna skulle ge ut falska negativa när mineraler inte står inför detektorn vid ca 70 °, se en Kikuchi mönster anses vara entydiga belägg för en mineral fas i regionen av intresse ^13.

Transmissionselektronmikroskop (TEM) tillåter strukturell karakterisering av ett bredare spektrum av material ^14. Den fokuserade jonstrålar (FIB) möjliggör platsspecifik utvinning och bearbetning av ett prov med typiska dimensioner för TEM-analys ^15. Därför är FIB / TEM tekniken en lämplig metod för att analysera nyligen deponerade biomaterial vid ett lokaliserat område. Kombinerade FIB-SEM instrument tillåter också utan skador observation av ett prov genom användning av en integrerad elektronstrålekolumn. Volfram sputterbeläggning av provet ökar ledningsförmåga och gränser jon jagmplantation och bestrålning skador på provet ^16. Användningen av en fint fokuserad jonstråle med en låg uppehållstid möjliggör fräsning av organiska material. Inne i FIB-SEM, kan en speciell egenskap av intresse extraheras från ett bulk prov och tunnas till elektron insyn TEM-analys ^17. Grund av den höga energin hos jonstrålen, kan kristallina material göras amorf. Detta kan inträffa vid framställning av en tunn lamell för TEM-analys och kan mildras genom att använda en låg accelerationsspänning jonstråle för att ta bort det amorfa skiktet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hexamethyldisilazane	Electron Microscopy Sciences	16700(EM)
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19192
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine	ThermoFisher Scientific	PHZ1124
Nigericin, Free Acid	ThermoFisher Scientific	N7143-5MG
35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat	ThermoFisher Scientific	D110400
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate	ThermoFisher Scientific	C-1271
BDH Potassium Chloride, ACS Grade	VWR	BDH0258-500G
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline	Sigma	P6148
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	083-01095
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	199-02185
Calcein	Sigma	C0875
FASW	Iwaki Co. Ltd.	Rei-sea Marine
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm	ADVANTEC	A045A047A
ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	051-00476
Artificial seawater for buffers			by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf
Sodium Chloride	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	191-01665
Potassium Chloride	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	163-03545
Magnesium Chloride Hexahydrate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	135-00165
Calcium Chloride	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	039-00475
Sodium Sulfate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	197-03345
Hydrochloric Acid	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	089-08415
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	207-06275
2-aminopyridine	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	011-02775
Orion 5-star Plus pH meter	Thermo Scientific
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP	Thermo Scientific
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1	Zeiss
ImageJ	NIH, Bethesda, MD, USA
HRTEM H500	Hitachi
SU6600 VPSEM	Hitachi
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system	Hitachi