Introduction
생체 광물 형성 작용 (biomineralization)은 정교하게 정렬 한 무기물의 제조 결과 세포 활성 모음 브릿지 복잡한 일련의 이벤트이다. 문제는 동적 세포 프로세스 및 광학 및 전자 현미경 방법의 조합을 이용하여 복잡한 구조를 모두 무기물을 특성화한다. 세포 내 pH를 상승, 따라서, 증가 된 pH를 갖는 생활 단계를 식별하는 석회화 2, 3이 발생 될 가능성이있는 시간을 계시, CaCO3를 결정의 형성을 선호한다.
가족 Serpulidae에서 tubeworms 바다 4 공통 calcifiers 있습니다. 그것은 특히의 생물 연료 5, 6, 또한 해양 연구를위한 인기있는 무척추 동물 모델이다. 본 연구에서는, 무기질 구획 석회화 과정 두리NG의 생체 광물 형성 작용 (biomineralization)이 관찰된다. 변형의 빠른 처리 탄산 칼슘 구조물 (7, 8)의 출현을 포함한다.
우리는 tubeworm 인에서 수행 할 수있는 방법을 내부 pH를 측정 보여, 삶의 단계 및 석회화에 대한 중요한 조직은 어떻게 선별 할 수있다. 관심의 수명 단계가 식별 된 후에, 석회화에 대한 책임이있는 조직을 전자 현미경 법을 사용하여 더 높은 해상도로 특징 지어 질 수있다. 형광 현미경을 사용하여, 우리는 변성 유도 후 나타나는 탄산 칼슘에 필요한 시간을 결정한다. 삶의 유사한 단계 이후 원소 조성 분포에 대한 SEM-EDS 가시화하고, 증착 된 무기물 개의 상이한 전자 현미경 방법, 구체적으로는 SEM-EBSD 및 FIB-TEM을 사용하여 분석 하였다.
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Protocol
1. 라이프 스테이지 검사 및 라이브 영상과 관심의 조직
- 이전에보고 된 방법 6, 7, 9에 따른 역량 배양 해양 유충. 10 μM SNARF-1 오전 하룻밤에 여과 해수와 mL의 밀도 당 5 유충에 tubeworm 인 애벌레를 품어. 광 표백제에서 형광 프로브를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮고 용기.
- 해부 현미경을 사용하여 유충을 관찰한다. 변형에 대한 준비가 관할 tubeworm 인 유충은 순방향 대신에 원을 그리 수영됩니다.
- 60 μm의 메쉬에 관할 유충을 전송합니다. 액체를 유지하기 위해 좋은 밀봉을 제공하는 페트리 접시에 메쉬를 누릅니다. 빠르게 유충을 유지, 해제 및 형광 염료를 포함하는 해수를 폐기 할 수있는 봉인을 해제.
- 복용, 두 번 여과 인공 해수 (FASW)와 유충을 씻으십시오그 과정에서 애벌레를 건조하지 않도록주의.
- 변태 과정의 관찰 10-4 M의 이소 부틸 (IBMX)를 포함 FASW의 5 mL의 10 얇은 유리 바닥 요리 유충 (20)에 배치합니다.
- 그리고 애벌레의 DIC 이미지 :; SNARF-1 신호를 검출하기 위해 (예 25분의 510 엠 35분의 640 채널 2 예 25분의 510 엠 30분의 580 채널 1) 필터 큐브를 삽입합니다.
- 살아있는 동물의 명확한 이미지가 캡처되어 있는지 확인하기 위해 셔터 시간 (100-300 밀리 초)만큼 빠르게 최적화, 다음의 20 배 목표 아래 metamorphosing 애벌레를 놓습니다.
- 세 채널 Z 스택 캡처 1 ㎛의 거리를 설정하고, 채널들 간의 더 나은 상관을 가능하게 할 Z- 방향의 다음 층으로 이동하기 전에 세 가지 채널에 대한 각각의 층을 묘화하는 살아있는 동물을 묘화 할 때.
- 현미경 소프트웨어에서 TIF 파일로 모든 채널 및 레이어 내보내기 그레이 스케일 이미지 : 파일 | 수출 | 파일 형식 TIF | 스타트.
- ImageJ에 사용 메신저포트 채널마다 화상 서열 파일 | 가져 오기 | 이미지 시퀀스.
- 채널 1 λ 1 안에 가져 오려면, 이미지 3 증가를 시작 입력 : 4.
- 채널 2 λ 2 그들을 가져 오려면, 이미지 (4) 증가를 시작 입력 : 4.
- 픽셀 각 층 픽셀 λ 1 그들에 의해 λ 2 그들을 나누어 합성 이미지를 생성 (공정 | 이미지 계산기 ... | 이미지 파일 640 nm의 "분할"이미지 파일 580 ㎚), 즉 580분의 640 nm의 비율.
- 선택 이미지 | 조회 테이블 | 16 색.
- 분석 선택 | 도구 | 교정 바.
- 가장 이질성을 함유하는 층을 식별, 다른 레이어를 검사합니다. 이것은 내부의 pH 분포에 대한 가장 유용한 정보를 제공합니다.
- 580분의 640 nm의 비율과의 pH 사이의 관계를 이용하여, 내부의 pH의 분포를 시각화하는 플롯 프로파일을 구성.
- 10 μM SNARF-오전 1시 약 20 애벌레의 하룻밤 염색 한 후, 50 μM의 nigericin 및 교정 150 밀리미터의 KCl을 만들기 위해 nigericin과의 KCl의 재고 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
- 5.9 주변의 pH가 달성 될 때까지 묽은 수산화 나트륨 또는 HCl로 교정 AFSW의 pH를 조정합니다. 정확한 pH 값을합니다. 해수 기초하여 보정 된 유리 전극 pH 미터로 측정 산도 2- 아미노 -2- 히드 록시 메틸 -1,3- 프로판 디올 (트리스) 및 2- 아미노 피리딘 (9).
- 640 nm의 580 nm에서 신호 강도의 측정을 위해 건조하고 깨끗한 접시에 알려진 산도와 액체와 함께 하나의 스테인드 tubeworm 인 유충을 전송합니다.
- 반복 2.2과 5.9에서 9.9에 이르기까지 네 더 산도 점 2.3 단계를 반복합니다. 이들은 생리 관련 값들의 범위를 나타낸다.
- 신호가 동물의 몸 전체에 균일 한 표시하기 위해 확인합니다. 이 세포 내 pH가 전자했음을 나타냅니다환경 해수 quilibrated.
- 이미지 다섯 가지 해수의 pH 환경에서 tubeworm 인 유충, 즉, λ 2 EXC 및 λ 1 EXC, 640 nm에서 "회색 값"으로 580 nm에서 나타난 강도를 기록한다.
비례 영상 데이터의 3. 분석
- 오 임의의 위치에서 또는 스프레드 시트에 대한 관심의 영역에서 측정 된 회색 값을 입력합니다.
- 다섯 점 교정이 세포 내 산도를 나타내는 선형 관계를 보여 주었다 확인 (예를 들어, Y = 0.30x 같은 식 - 1.47, Y = 회색 값, X = 산도, R² = 0.934).
- 단계 1.13의 측정 580분의 640 nm의 강도 비를 이용하여 식 세포 내 pH 값을 계산한다.
4. 샘플 보존, 탈수 및 전자 현미경을 위해 설치
- 4 % 파라 포름 알데히드와 관심의 삶의 단계를 유지. 본 연구에서는,, 부착 후 tubeworms 2-4 일 해결 분석까지 정착액에 동물을 유지합니다.
- 흄 후드에서 작업하는 탈수 과정에서의 조직의 수축을 최소화하기 위해 30 분 동안 1 % 오스뮴 테트 록 사이드 수용액 시험편 후 고정한다.
- 5 분, 5 분, 95 % 에탄올을 5 분간, 85 % 에탄올을 5 분간, 70 % 에탄올, 50 % 에탄올을, 회 5 분간 마지막 무수 에탄올 : 채점 에탄올 시리즈 시험편 탈수.
- 액체가 완전히 증발 할 수 있도록 시편에 에탄올과 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS)의 1 용액 : 흄 후드에서 작업, 1을 추가합니다.
- 흄 후드에서, 액체가 완전히 증발 할 수 있도록 표본 100 % HMDS를 추가한다.
- 다이아몬드 나이프를 사용하여, 몇 tubeworms 주변 배양 접시 몇 컷 소개한다. 에 뚜껑, 접시를 깰 알루미늄 그루터기에 접시 바닥을 잡으십시오.
- 해부 현미경, 손상되지 tubeworm 인을 포함하는 골절 조각을 찾아.
- 알루미늄 그루터기에 실버 페인트를 적용하고 조심스럽게 그루터기에 조각을 고정합니다. 대전 줄일 플라스틱 조각의 에지 주위 페인트.
5. SEM-EDS를 사용하여 칼슘 풍부한 지역 찾기
- 샘플 홀더에 시편 스텁을 고정합니다.
- 현미경 구비 게이지에 대해 전체 조립체의 높이를 측정 시료가 기준 높이에있을 때까지 로킹 와셔를 풀고 소식을 회전시켜 높이를 조정하거나, 기록 된 높이를 입력한다.
- 현미경 교환 챔버로 공기를 인정 오픈 챔버 도어를 스윙. 교환로드의 끝에 샘플 홀더를 밀어 넣습니다. 그리고 가까이 챔버 대피.
- 게이트 밸브를 열고 현미경 실으로의 교환로드를 밀어 넣습니다. 완전히 현미경 단계에 샘플 홀더를 장착 할 때의 교환로드를 끝까지 밀어 넣습니다. 교환 막대를 제거하고 게이트 밸브를 닫습니다.
- 입력 t그는 치수를 샘플링하고 전자 칼럼 아래에 샘플을 배치하는 홈 위치로 무대를 보냅니다.
- 부사장-SEM 모드에서 20 ~ 30 파에 챔버 진공 레벨을 설정합니다. 20 kV의에 전자 가속 전압을 설정하고에 높은 전압을 설정합니다.
- 10mm의 샘플 작동 거리 스테이지 상향한다. 라이브 피드를 획득하고 표본을 찾습니다. 점수차를 조정하여 이미지를 최적화하고 필요에 초점을 맞 춥니 다.
- SEM을-EDS 프로그램을 열고 EDS-SEM 모드 옵션을 선택합니다. EDS가 맵을 실행할 수있는 메뉴 옵션을 선택합니다.
- SEM-EDS 프로그램 속도 측정기를 통해 모니터로 변경 집광 렌즈와 조리개 설정 (3)의 프로세스시 ~ 30 %의 데드 타임을 달성했다. 빔 설정을 변경 한 후 빔과 조리개 정렬 절차를 실행합니다.
- 하나의 유기체가보기의 전체 필드를 채우도록 배율을 선택합니다. 드리프트 보정 옵션을 활성화하고 SEM-EDS 프로그램에서 이미지를 캡처합니다.
- 엄마 획득유기체가 50 ~ 100 ms의 체류 시간을 사용하여,보기의 전체 필드를 채우는 페이지의 데이터입니다. 데이터가 유기체 (약 15 분) 내에서 칼슘의 독특한 현지화가 표시 될 때까지지도를 실행합니다.
- 포인트 - 정량화 된 데이터를 얻기 위해, 6 행의 처리 시간을 변경하고 ~ 30 %의 불감 시간을 취득하는 전자 프로브를 조정한다. 정렬 단계를 실행하고 필요에 따라 이미지를 최적화 할 수 있습니다.
- SEM을-EDS 프로그램의 포인트와 ID 옵션을 선택하고 다른 이미지를 획득. 단일 포인트 도구를 사용하여 비교를 위해 EDS지도에 풍부한 칼슘뿐만 아니라 칼슘 결핍 영역 등장 영역을 클릭합니다. 30 s의 라이브 시간 동안 각 지점을 스캔합니다.
6. 사용 칼슘 풍부한 지역의 결정학 정보를 확인 SEM을-EBSD
- 플랫 표본 스텁에서 관심의 플라스틱 조각 함유 시료를 제거하고 실버 전도성 접착제를 사용하여 45 ° 사전 기울어 진 그루터기의 경 사진면에 부착합니다.
- 샘플 시간에 스텁 스크류나이 샘플 홀더의 앞쪽으로 위치 (표본)와 스텁의 각진 얼굴. 교환 챔버를 사용하여 현미경의 챔버에 샘플 홀더를 삽입한다.
- 20 kV의 전압을 가속 챔버 (30) 아빠에 진공 전자를 설정합니다. 전자 칼럼 아래에 샘플을 보내 전자빔을 시료 표면을 정상으로부터 약 70 °를 배치하도록 스테이지 25 ° 기울. 에 높은 전압을 설정합니다.
- ~ 18mm의 작업 거리를 무대에 올립니다. 무대를 이동하고 표본을 찾기 위해 트랙볼을 사용합니다. 관심의 특정 기능을 프레임에 배율을 높일 수 있습니다. 빔을 정렬하고 필요에 따라 이미지를 최적화 할 수 있습니다.
- EBSD 모드에서 SEM-EDS 프로그램을 엽니 다. 관심의 단계로 선택 방해석과 아라고 나이트. 154mm의 거리에서 EBSD 카메라를 삽입합니다. 1 × 1 비닝 (binning)와 100 밀리 프레임 시간으로 카메라 조건을 설정합니다. 고속 빔 래스터를 사용하여 배경을 취득.
참고 : 다른 프레임 속도전자 프로브에 따라 요구 될 수있다; 약 90 %의 신호를 달성하기위한 프로브 나 카메라의 프레임 레이트를 조정한다. - SEM을-EDS 프로그램에서 이미지를 캡처합니다. 현장 분석 도구를 사용하여 그 시점에 빔을 스캔 할 이미지 곳을 클릭합니다. 어떤 키쿠치 패턴이 발견 될 경우 확인하기 위해 카메라 창을 준수하십시오.
- 키쿠치 밴드가 존재하는지 확인하기 위해 각 지점에서 카메라 창을 관찰하고, 잠재적 인 석회화 사이트를 스캔 할 이미지의 다른 영역을 클릭합니다. 패턴이 존재하는 데이터베이스에서 선택된 위상과 일치하는 경우, 그들은 자동적으로 인덱싱된다.
7. TEM 샘플 준비 FIB-SEM을 사용하여
- 도전 층을 만드는 코팅을 백금 또는 유사한 재료로 제조 된 SEM 시료 스퍼터.
- 스퍼터 코터의 하우징으로 이전, 고정, 탈수 및 장착 된 표본을 놓고 아래로 챔버를 펌핑 시작 전원을 켭니다.
- 진공 챔버가 40 mTorr로 이하를 판독하면에 가스 스위치를 켜는 200 mTorr 이하의 챔버 압력에 도달하는 아르곤 가스의 유량을 증가시킨다. 80 mTorr 이하의 최종 챔버 압력을 달성하기 위해 가스 유량을 조정한다.
- 상기 전압 스위치를 켜고, 15 mA의 전류에 도달하는 전압을 증가시킨다. 이온 조사 손상으로부터 시료 표면을 보호하는 두꺼운 층 (~ 60 nm의)를 만들 수있는 확장 된 시간 (~ 10 분)의 타이머와 코트를 설정합니다. 안정한 15mA 전류를 유지하는 전압을 조절한다.
- 일단 파워 다운 진공을 해제하고 샘플을 제거하는 코터를 마쳤다.
- 악기 샘플 홀더의 M4 나사 포스트에 코팅 샘플을 스퍼터, 제조의 기반을 조입니다. 꽉 손까지 조여 잠금 너트를 푼 다음, 어셈블리의 높이를 변경하려면 샘플 홀더 게시물을 돌립니다. 레이저 높이 게이지를 사용하여 표준 supplie 제공의 (비디오에 표시된 = 0.04 인치) 1mm 내에 있도록 높이 조절악기와 D.
- FIB-SEM 모든 건 밸브를 닫은 다음 eucentric 무대 에어 록에 공기를 인정한다. 압력이 환경과 등화되면, 공기가 열려 잠 밀어 교환로드의 접지 단자에 샘플 홀더를 부착합니다. "잠금"위치로 교환로드의 끝 부분에있는 손잡이를 돌립니다. 공기 잠금 장치를 닫고 공기 락 챔버 대피.
- eucentric 스테이지 에어 록은 진공 압력이 FIB-SEM 챔버의 일치 된 후, 게이트 밸브를 개방하여 교환로드에 밀어 샘플을 삽입한다. 악기 eucentric 단계에서 샘플 홀더를 장착 할 때의 교환로드를 끝까지 밀어 후 "잠금 해제"위치로 교환 막대를 회전합니다. 다시 밖으로 교환 막대 슬라이드 게이트 밸브를 닫습니다.
- 이온 빔 열 아래 샘플의 위치를 무대로 이동합니다. 게이트 밸브를 열고 FIB의 라이브 이온에 의한 이차 전자 이미지를 획득. 저배율과를 사용하여빠른 래스터 스캔은 이온의 손상을 최소화합니다. 정상 관찰 빔의 초점을 재설정하고 샘플의 초점이 될 때까지 단계의 Z 높이를 올립니다. 이때 시료는 이온 및 전자 모두에 빔이 동일한 위치에 집중된다 크로스 점 위치에있다.
- 주사 전자 현미경으로부터 이차 전자 이미지를 사용하여, 주변의 시험편을 이동 트랙볼을 이용하여 시편에서 관심 영역을 찾아. 관심 분야는 이전에 EDS 매핑에 의해 결정 칼슘이 풍부한 영역입니다. 윈도우의 프레임 라인에 대한 관심의 기능을 얻을 필요에 따라 단계를 돌립니다.
- FIB 창 인터페이스에서 추가로 2 배 디지털 줌 배율 1000 배 시편의 빠른 스냅 샷을 캡처하고 관심 영역에 걸쳐 ~ 8 μm의 × 2 μm의 증착 템플릿을 그립니다. 성막 상자의 배율 크기는 다양한 크기의 기능을 수용하기 위하여 조절 될 수있다. 40 kV로를 이용하여 탄소를 증착하는 스퍼터 조건을 설정5 분 동안 0.5 μS의 체류 시간을 사용하여, 0.09 nA의 빔.
- 탄소 증착 후에, ~ 2-3 ㎛의 텅스텐 캡을 생성하기 위해 5 분 동안 40 kV로, 0.7 nA의 빔 및 입금하여 텅스텐을 증착하기 위해 증착 조건을 변경.
- 관찰 빔을 사용하여 FIB 스냅 샷을 캡처 텅스텐 캡 주위에 네 개의 상자의 패턴을 그립니다 microsampling 스퍼터 도구를 사용합니다. 약 15 ㎛의 수 상하 박스 집합 X는 8㎛; 우측 박스 (10) ㎛의 X는 5㎛ 및 좌측 박스는 6㎛ × 5 ㎛의 또는 충분히 큰 관심의 영역을 둘러싸고있다.
- 40 kV로, 19 nA의 빔 50 μS 각 상자 3-4 스캔 프레임들의 지속 시간을 이용하여 절단하는 제조 조건을 수정한다. 이어서, 패턴을 제조. 보호 C 및 W 층으로 제조, 관심 영역, 후 상부, 하부 및 우측에 인접한 물질을 제거하여, 섬과 유사한 것이다.
- SAMP를 넣어 58 ° 무대를 기울제작 : 전자 칼럼 및 이온 열을 가파른 각도로 정상 표면. FIB를 사용하여 샘플 "섬"의 뒷면을 찾아 1000 배의 배율 2-4X 디지털 줌에서 스냅 샷을 캡처합니다.
- 그것이 눈에 보이는 곳의 맨 끝에 "섬"샘플의 뒷면의 하단에 걸쳐 ~ 15 μm의 × 2 μm의 스퍼터 패턴을 그립니다. 빔이 샘플의 하단을 절단했다 3 분 또는까지 4 nA의 빔을 이용하여 상자를 제조 "섬."
- eucentric 단계를 (다시 제로) 현재 위치에서 -58 °를 기울이십시오. FIB 인터페이스에서 "프로브에서"링크를 클릭 텅스텐 microsampling 프로브를 삽입합니다. 무대 제어판에 "MS"를 선택하고 시편의 맨 위에 프로브를 이동하려면 트랙볼을 사용합니다.
- 1 KX의 배율에서 FIB의 생중계를 획득 팁 직접 microsample의 텅스텐 캡의 오른쪽 위가되도록 프로브를 위치. 라이브를 관찰하면서전자 현미경에서 SE의 이미지, 접촉 텅스텐 캡까지 탐침을 낮출 스테이지 패널의 Z 조절 노브를 사용한다. 접촉이 이루어진 후에 부저가 울립니다.
- 1000 배 및 2 배 디지털 줌 배율 : 40 kV의 0.01 nA의 빔을 사용하여 FIB를 이용하여 스냅 샷을 캡처. 그것은 microsample의 텅스텐 캡을 접촉 한 프로브의 팁을 통해 2 μm의 × 2 μm의 상자를 그립니다 증착 도구를 사용합니다.
- 2 분 0.5 μS의 드웰 시간, 40 kV로, 0.09 nA의 빔을 이용하여 텅스텐을 증착 조건을 설정한다. 이어서, 패턴을 제조.
- (그것이 여전히 샘플의 부피에 연결된다) "팔"는 microsample의 좌단에 걸쳐, 2㎛ ~ × 5 ㎛의 스퍼터 패턴을 그린다. 40 kV의를 사용하여 패턴을 제작, 0.7 nA의 빔, 신호음이 microsample가 대량 샘플에서 분리되었음을 나타냅니다 2 분, 또는 때까지.
- 첨부 microsample까지로 프로브를 마련하기 위해 Z 컨트롤 노브를 사용하여그 다음 프로브를 철회, 벌크 샘플을 지 웁니다. 홈 또는 Exchange 위치 중 하나에 eucentric 단계를 보냅니다.
- 측면 입구 홀더에 구리 반 그리드 놓고 사이드 입구 스테이지 퍼지 챔버 내로로드 홀더. 챔버 대피 측면 항목 홀더를 삽입합니다. FIB 위치로 홀더를 설정합니다.
- 를 눌러 스테이지 제어 패널의 측면과 FIB 모니터보기에 반 그리드를 가지고 트랙볼을 사용합니다. 반 그리드의 영역을 청소하고 초점 표면을 가져 오기 위하여 Z 노브를 사용하여 이동합니다.
- 를 눌러 프로브에서 무대 제어판에 프로브를 눌러 MS를 삽입하고 반 그리드를 통해 microsample의 위치를 트랙볼 및 Z 노브를 사용합니다. microsample 접촉 그리드 때까지 프로브를 낮 춥니 다.
- 1000 배 확대 (2 배 줌)의 FIB에 이미지를 캡처합니다. 증착 도구를 사용하고 microsample의 하부에 걸쳐 ~ 10 μm의 × 3 μm의 패턴을 그립니다. 40 kV의 0.7 nA의 빔 예금 텅스텐, 드웰 t 사용3 분 동안 0.5 μS의 IME.
- 스퍼터 도구를 사용하여 프로브의 팁을 통해 작은 1 ㎛ × 3 μm의 패턴을 그립니다. 거리 microsample로부터 프로브 잘라 3 ms의 체류 시간에서 40 kV의 0.7 nA의 빔을 이용하여 패턴을 제조. 한 번 무료로 프로브를 후퇴.
- 상자 사이의 ~ 1 μm의 간격을두고, 5000 배 배율에서의 FIB 이미지를 캡처하고 microsample의 상단과 하단에 두 개의 스퍼터 패턴 7 μm의 × 4 μm의를 그립니다. microsample의 좌우 측면을 절단하지 않도록 패턴 중심. microsample의 중심을 향해 래스터 방향 설정, 2 분 동안 40 kV로, 4 나트륨 빔 3 μS의 전환 시간을 이용하여 두 패턴을 제조.
- 5000 배의 FIB 관찰 빔을 이용하여 다른 화상을 촬영할. ~ 6.5 μm의이 × 1 μm의, ~의 간격을두고 서로 가까워 이동 이전 스퍼터 상자의 크기를 조정 0.5 μm의 및 40 kV의 0.7 nA의 빔을 사용하여 제작.
- 사이드 진입 단계 0.5 °와 모자를 기울다른 FIB 이미지를 진짜야. 6 ㎛ 폭의 스퍼터 상자의 크기를 조정합니다. microsample의 상단 측을 통해 정상 패턴을 놓고 40 kV의 0.7 nA의 빔을 사용하여 제작. -0.5 °를 기울와 microsample의 하부 스퍼터 패턴과 바닥면 반복합니다.
- 또 ~ 0.5 ㎛의 패턴에 의해 폭을 감소시킨다. 0.5 °를 기울여 40 kV로, 0.09 nA의 빔을 사용하여 microsample의 상단면을 스퍼터. -0.5 ° 경사에서 아래쪽으로 반복합니다.
- 무대 2.2 °를 기울여 10000에 FIB 이미지를 획득. 5 μm의 폭에 스퍼터 패턴의 크기를 조정하고 5 kV로, 0.03 nA의에 빔 조건을 변경합니다. 오른쪽 상단 모서리까지의 microsample의 상부를 통해 상부 패턴을 배치하고, 제조. -2.2 °를 기울여 아래쪽과 바닥 패턴으로 반복합니다.
- microsample는 전자 투명 (~ 100 nm의 두께)이 될 때까지 5 kV의 밀링 단계를 반복합니다. 일단, 가까운 gunvalves 완료 및 측면 항목 홀더를 제거합니다.
8. O투과 전자 현미경에 선정 된 지역 회절 패턴을 btaining
- 분석을위한 장비를 준비하려면 채우기 모두 듀어는 액체 질소로 플라스크 300 kV의에 가속 전압을 설정합니다.
- FIB를 이용하여 시료 준비 후에, FIB-SEM의 사이드 입구 홀더를 분리하고 홀더의 길이가 300 kV의 TEM의 일치하도록 핀의 위치를 조정한다. 정확한 관측 위치로 상기 홀더의 팁을 회전시켜 다시 표준 TEM 홀더에 비교하여 정확한 샘플 배향을 보장한다.
- 또한, 표준 TEM 홀더에 FIB-SEM 홀더와 장소에서 부착 된 박편으로 반 그리드를 제거합니다.
- TEM에의 교환 챔버로 샘플 홀더를 넣고 챔버 대피. 공기가 교환 챔버로 인정 될 때마다 악기 총 밸브가 닫혀 있는지 확인합니다. 교환 챔버가 아래로 펌핑되면 경보 음이 울립니다. 샘플 홀더 시계 방향으로 회전하고 VACU을 허용음 최초의 정지 위치에있는 샘플 홀더를 당겨.
- 악기 진공 복구 할 수 있도록 허용하고 총 밸브를 엽니 다. 초점을 다시 약 10000의 배율로 확대합니다.
- 형광면의 중심으로 빔을 이동하도록 정렬 노브를 사용. 계약 및 빔을 확장하여 모든 빔 운동이 동심 있는지 확인하십시오. 필요에 따라 콘덴서 비점 수차에 대한 조정합니다.
- 시계 반대 방향으로 샘플 홀더를 회전 진공 완전히 컬럼에 홀더를 당겨 할 수 있습니다. 탐색 및 샘플을 찾을 스테이지 이동 손잡이를 사용합니다.
- 샘플에 배율을 증가 샘플의 초점이 될 때까지 Z-높이를 조정합니다. 필요에 따라 광학 접안 렌즈를 사용합니다.
- 카메라를 삽입하고 형광체 화면을 제거합니다. 카메라를 oversaturating 방지하기 위해 필요에 따라 빔을 확장합니다. 초점과 카메라 매개 변수를 조정 한 후 이미지를 캡처 수집을 시작합니다.
- 회절 패턴은 제 1 중심 취득관심있는 기능입니다. 목적 조리개를 제거하고 회절 조리개를 삽입합니다.
- 조작부에서 DIFF 버튼으로 회절 렌즈 모드로 변경하고, 빔을 축소 할 DIFF 조절 노브를 사용한다.
- 카메라 또는 레코딩 형광체 스크린에서 회절 패턴의 중심을 방지하기 위해 필요에 감쇠기를 삽입한다. 패턴의 이미지를 캡쳐하는 카메라의 획득을 시작한다.
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Representative Results
다음은 tubeworm 인의 변형시의 석회화 과정의 일부 관측은 다음과 같습니다. 도 1은 칼라 영역 근처의 pH 값은 변형 후 다른 조직에 비해 높다는 것을 보여준다. 그림 2I는 칼슘의 균일 한 분포, 더 큰 석회화 이벤트가 시작되지 않은 제안과 tubeworm 인을 보여줍니다; 도 2ii 관심 시점 초월 석회화 시사 장기간 석회화 한 tubeworm 인을 나타내고; 그림 2iii는 광물에 대한 책임이있는 조직을 이해하기 위해 추가 분석을 위해 선택한 관심의 석회화 단계와 tubeworm 인을 보여줍니다. 도 3은 높은 pH 값 칼 세인 염색 및 SEM-EDX 매핑 모두에서 높은 칼슘 이온 신호와 상관 관계를 나타낸다. 이러한 관찰로부터, 주목 수명 단계에서 조직을 하이에서 조사한더 현지화 된 기술, SEM-EBSD를 사용하여 gher 해상도입니다. 광물 상 발견되면,도 4는 무기의 결정 성을 확인하기 위해 TEM에 대한 관심 및 선택 영역 회절 분석 자료를 꺼낸다 집속 이온 빔의 적용을 도시한다.
그림 1 : tubeworm 인의 세포 내 pH를 매핑 (찬 등의 알에서 2015.). IBMX 처리 후 71 시간에서 변태의 느린 속도를 나타내는 tubeworm 인, Hydroides 엘레은 세포 내 pH가 분포에 큰 이질성을 보여줍니다. DIC 이미지 (왼쪽) 및 580 nm에서 회색 값으로 나눈 640 nm에서 회색 값으로부터 생성 된 합성 이미지를 pseudocolorized은 (맨 오른쪽) 표시됩니다. 580분의 640 nm의 비율로부터 계산 된 그레이 값은 세포의 pH에 비례한다. PROFI합성 이미지에서 그레이 값 레는 tubeworm 인 (아래 패널)의 본체 길이 축 방향의 거리에 따라 세포 내 pH 값으로 변환 하였다. 방출의 세포 내 pH와 580분의 640 nm의 비율 사이의 관계는 (= Y 0.30x - 1.47을, R 2 = 0.934, Y, 회색 값, X, 세포 내 pH가) 시험 관내 교정에 의해 설립되었습니다. (빨간색) pH가 8.5 이상 세포 내 pH가 지역 석회화 구조가 발견 된 지역에 해당된다. 스케일 바는 100 μm의 =; C, 칼라; B, 아가미 로브; 개미, anteior; 포스트, 후방. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : SEM-EDS를 사용하여 관심있는 삶의 단계를 확인.
다른에서 Tubeworms변태의 시점 (ii)는 빠른 성장 2 일 후 변성 tubeworm 인이 칼슘 신호의 짧은 고리를 표시 한 후 변성 tubeworm 인이 칼슘 신호의 균일 한 분포를 보여줍니다 추가 분석 (I) 하루 동안 새로 석회화 단계를 캡처 상영되었다 (ⅲ) 느린 성장 2 일 후 변성 tubeworm 인은 칼슘 신호의 관광 명소를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : (. 찬 외 2015) 라이브 현미경을 사용하여 칼슘 신호의 특성. (I-IV), SEM-EDS (V-VII) 및 SEM-EBSD (VIII-X). 31 시간 및 Hydroides 간스의 변성 후 53 시간 째에 칼 세인 신호 상관 칼슘 이온의 분포. DIC 이미지 (왼쪽 패널, 3I 및 ⅲ) 및 t그는 신호 칼 세인 (왼쪽 패널, 2ii 및 IV)가 표시됩니다. 날이 후 변성 Hydroides 엘레에 상호 전자 현미경은 낮은 전압 (5 kV의) SEM 이미지에서와 같이, 석회화 구조의 관광 명소를 감지 (가운데 패널, 3V). 20 kV의 수행 SEM-EDS 분석 매핑, 칼슘의 이기종 분포 표시 (가운데 패널, 3vi, 칼슘을, 노란색). 칼슘의 내용이 tubeworm 인의 이미지를 낮은 전압 (5 kV로)의 큰 표면 세부를 오버레이 숫자로 제시, 칼슘 함량 (몰 중량 %가, 소수점이 지점의 위치를 표시하기 위해 정렬 분석) (스팟 정량화에서 얻은 SEM-EDS 20 kV의에서) (중간 패널, 3vii). Ca를 콘텐츠 이상 15 몰 중량 %와 영역은 석회화 된 구조가 될 가능성이 높다. 칼슘이 풍부한 지역의 SEM-EBSD 분석 2viii-x의 오른쪽 패널에 illuastrated된다. SEM-EDS 결과에서 발견 칼슘이 풍부한 지역 (화이트 박스)을 추가 EBSD 분석 하였다 (오른쪽 패널, 3viii) (ii)에 원 (오른쪽 패널;3iX와)은 EBSD 분석 사이트를 나타내고; 키쿠치 패턴 (오른쪽 패널, 2 배) 사이트가 EDS / EBSD 미량 소프트웨어의 인터페이스에서 aragonitic입니다 제안합니다. C, 칼라; B, 아가미 로브; 개미, 전방; 포스트, 후방. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 결정 구조의 특성은 (. 찬 외 2015) FIB-TEM을 사용. EBSD에서 키쿠치 패턴을 나타내는 영역은 TEM 시료를 준비 적출 (I), (II) 집속 이온빔 (FIB) 기술 (평면도)에 의해 절제 제거 주변 재료, (ⅲ) 물질을을 사용하여 상승 된 텅스텐 프로브 (측면도), 낮은 전압에서 얻었다 ~ 200 나노 미터의 최종 두께 (IV) 샘플. (V)이었다에서 원 영역아라고의 단결정 패턴을 도시하는 TEM (VI)의 선택 영역 회절 패턴의 존재에 대해 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
라이브 광학 영상은 다세포 생물의 세포 이벤트를 관찰하는데 유용한 방법이다. 여기서, 내부 pH 및 칼슘 이온 지표 광물 부위에서의 이온 플럭스를 측정하기 위해 사용되었다. 이 지역에서는 활성 이온 펌프는 석회화 2, 3을 사용하도록 pH와 칼슘 농도를 상승시킬 필요합니다. 유기체 공부 형광 분자를 도포 할 때 사용되는 농도는 무시할만한 독성을 가지며, 생리적으로 적절한 방식으로 수행 유기체있게 보장하는 것이 중요하다. 하부 염색 농도를 독성이 적은 것, 통상보다 긴 시간 염색 (10)에 결합된다. 이 염색 기간 산소 결핍 및 폐기물의 축적을 최소화 배양 시간 동안 유충의 저농도를 유지하는 것이 중요하다.
이전 지역화를 포함하는의 FIB / TEM 방법을 추구하는관심 지역, 삶의 무대와 SEM-EDS와 SEM-EBSD와 같은 낮은 해상도의 방법을 사용하여 관심의 조직을 통해 화면에 매우 중요합니다. 후방 산란 모드에서 시료를 관찰하는 것은 가벼운 대비 무거운 원자량 (11)에 상관 관계가 상대적으로 원소 조성의 시각화를 가능하게한다. 따라서, SEM-BSE 이미지는 칼슘 이온과 오스뮴 염색 지질 구체와 같은 무거운 원소의 위치의 추정을 제공한다. SEM-EDS 분석은 샘플에 칼슘 이온의 구체적인 맵핑을 허용한다. 그러나, 결정의 CaCO3의 존재를 확인하지 않습니다. 기존의 EBSD 방법은 광택 표면 (12)을 필요로하지만, SEM-EBSD는 결정 구조를 검출 할 수있다. 이 연구는 닦지 샘플의 SEM-EBSD 유용한 정보를 제공 할 수있는 방법을 보여줍니다. 20 kV의 빔 전류는 샘플 표면에서의 분석을 더 깊게 할 수있다. 따라서, EBSD를 검출하는 바람직한 방법은특히 해양 애벌레 같은 작은 그대로 생물학적 시료에 biomineral의 존재. 미네랄은 키쿠치 패턴이 관심 (13)의 영역에서 미네랄 단계의 명백한 증거로 간주됩니다보고, 약 70 °의 검출기에 직면하지 않을 때 닦지 샘플은 거짓 부정을 줄 것입니다 있지만.
투과 전자 현미경 (TEM)을 물질 (14)의 넓은 범위의 구조적인 특성을 허용한다. 집속 이온빔 (FIB)의 부위 특이 적 추출 및 TEM 분석 (15)의 일반적인 치수의 시료를 제조 가능하다. 따라서, FIB / TEM 기술은 국부 화 된 영역에 새로 증착 된 바이오 물질을 분석하기위한 적절한 방법이다. 결합 FIB-SEM 장비는 통합 된 전자 빔 칼럼의 사용을 통해 시료의 손상없이 관찰 할 수 있습니다. 시험편의 텅스텐 스퍼터 코팅은 전도도를 증가 제가 제한을 이온샘플 (16)의 mplantation 및 조사 손상. 낮은 지속 시간을 가진 미세하게 집속 이온 빔의 사용은 유기 물질의 밀링을 가능하게한다. FIB-SEM 내에서 관심있는 특정한 특징은 벌크 표본 추출 및 TEM 분석 (17)의 투명성을 위해 전자 박형화 할 수있다. 인하여 이온 빔의 높은 에너지로, 결정질 재료, 비정질 렌더링 될 수있다. 이것은 TEM 분석을위한 얇은 박편을 제조하고 비정질 층을 제거하기 위해 낮은 가속 전압, 이온 빔을 사용하여 완화 될 수있을 때 발생할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexamethyldisilazane | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
| Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
| IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
| Nigericin, Free Acid | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
| 35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
| BDH Potassium Chloride, ACS Grade | VWR | BDH0258-500G | |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline |
Sigma | P6148 | |
| 1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
| 0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
| Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
| ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
| Artificial seawater for buffers | by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
| Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
| Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
| Calcium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
| Sodium Sulfate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
| Hydrochloric Acid | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
| 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
| 2-aminopyridine | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
| Orion 5-star Plus pH meter | Thermo Scientific | ||
| PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
| Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| HRTEM H500 | Hitachi | ||
| SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
| NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system | Hitachi |
References
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