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Biology

Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/55164
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biological Sciences, Clemson University, 2Department of Marine Biodiversity Research (BioDive), Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Advanced Material Research Laboratory (AMRL), Clemson University, 4Swire Institute of Marine Sciences and School of Biological Sciences, The University of Hong Kong

Introduction

Biomineralização é uma complexa série de eventos, que liga um conjunto de actividades celulares, resultando na produção de minerais primorosamente pedidos 1. O desafio é caracterizar tanto o processo celular dinâmica e as estruturas minerais sofisticados usando uma combinação de métodos de microscopia óptica e eletrônica. Uma elevação do pH intracelular favorece a formação de cristais de CaCO3, por isso, identificando o estágio de vida, que tem um aumento de pH revela o tempo quando calcificação é susceptível de ser de ocorrência 2, 3.

Os vermes tubulares da família Serpulidae são calcificadores comuns no oceano 4. É também um modelo de invertebrado marinho popular para investigação, especialmente na bio-incrustação 5, 6. Neste estudo, o processo de calcificação nos compartimentos mineralizantes during biomineralização é observado. O rápido processo de metamorfose inclui o aparecimento de estruturas de carbonato de cálcio 7, 8.

Demonstramos como medições de pH interno pode ser realizada na tubeworm, e como fases da vida e tecidos relevantes para a calcificação pode ser rastreada. Após a fase de vida de interesse é identificado, o tecido responsável pela calcificação pode ser caracterizado em uma resolução maior utilização de métodos de microscopia eletrônica. Utilizando microscopia de fluorescência, determina-se o tempo necessário para o carbonato de cálcio a aparecer após a indução metamórfica. Um estágio de vida semelhante foi posteriormente visualizados com SEM-EDS para distribuição composição elementar, eo mineral depositado foi analisada utilizando dois métodos de microscopia eletrônica diferentes, especificamente SEM-EBSD e FIB-TEM.

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Protocol

1. Screening for Life Stage e tecido de interesse, com imagens ao vivo

  1. Cultura as larvas marinhas à competência de acordo com métodos previamente relatados 6, 7, 9. Incubar as larvas tubeworm em 5 larvas por ml densidade com água do mar filtrada com 10 uM SNARF-01:00 durante a noite. Cubra o recipiente com papel alumínio para proteger a sonda fluorescente de foto-branqueamento.
  2. Observar as larvas usando um microscópio de dissecção. larvas tubeworm competente pronto para a metamorfose vai nadar para a frente em vez de um movimento circular.
  3. Transferir as larvas competente para uma malha de 60 um. Pressione a malha de encontro a uma placa de Petri, proporcionando uma boa vedação para reter líquido. liberte rapidamente o selo para liberar e descartar a água do mar contendo corante fluorescente, retendo as larvas.
  4. Lavar as larvas com água do mar artificial filtrada (FASW) duas vezes, tendocuidado para não secar as larvas no processo.
  5. Coloque 10 a 20 larvas em vidro fino pratos de fundo com 5 mL de FASW contendo 10 -4 M isobutilmetilxantina (IBMX) para observação de processo de metamorfose.
  6. Insira os cubos de filtros para detectar o sinal SNARF-1 (Canal 1: Ex 510/25 Em 580/30; Channel 2: Ex 510/25 Em 640/35) imagem DIC das larvas, e.
  7. Posicione as larvas metamorphosing no âmbito do objectivo 20X, em seguida, otimizar o tempo do obturador (100-300 ms) rápido o suficiente para garantir que uma imagem clara dos animais vivos é capturado.
  8. Conjunto 1 mm distância para capturar uma Z-stack de todos os três canais, quando a imagem de um animal vivo, imaginando cada camada para todos os três canais antes de passar para a próxima camada de direção z permitiria uma melhor correlação entre os canais.
  9. Exportar imagens cinzentas escala para todos os canais e camadas como arquivos TIF do software microscópio: Arquivo | Export | tipo de arquivo TIF | Começar.
  10. Usando ImageJ, importa a sequência de imagens para cada canal: Arquivo | importação | sequência de imagens.
    1. Para importar Canal 1 λ 1 em, digite a partir de imagem 3 e incremento: 4.
    2. Para importar Canal 2 λ 2 em, digite a partir de imagem 4 e incremento: 4.
  11. Gerar uma imagem composta pela divisão λ 2 em pelo λ 1 em para cada pixel camada por pixel (Processo | Image Calculator ... | arquivo de imagem 640 nm "dividir" arquivo de imagem 580 nm), ou seja, 640/580 nm ratio.
  12. Selecionar Imagem | Tabelas de Pesquisa | 16 cores.
  13. Selecione Analisar | ferramentas | barra de calibração.
  14. Inspeccionar as diferentes camadas, identificando a camada que contém a maior heterogeneidade. Isto fornece as informações mais úteis a respeito de distribuição de pH interno.
  15. Usando a relação entre a razão de 640/580 nm e de pH, construir um perfil de trama para visualizar a distribuição de pH interno.

  1. Após a coloração durante a noite de cerca de 20 larvas com 10 mM SNARF-1 AM, adicionar em soluções estoque de nigericina e KCl para compensar 50 mM nigericina e KCl 150 mM para a calibração.
  2. Ajustar o pH da AFSW calibração com NaOH ou HCl diluído, até um pH de cerca de 5,9 seja alcançado. Observe o valor de pH exato. Medição de pH com um medidor de pH com um eléctrodo de vidro que foi calibrado com base de água do mar por 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol (Tris) e 2-aminopiridina 9.
  3. Transferir um larvas tubeworm manchado juntamente com um líquido com pH conhecido por um prato limpo e seco para a medição da intensidade de sinais em 640 nm e 580 nm.
  4. Repita os passos 2.2 e 2.3 para quatro pontos a mais de pH variando 5,9-9,9. Eles representam um intervalo de valores fisiologicamente relevantes.
  5. Verifique para garantir que os sinais aparecem homogénea em todo o corpo do animal. Isto indica que o pH intracelular tem sido equilibrated com a água do mar ambiente.
  6. Imagem as larvas tubeworm nos cinco ambientes de água salgada de pH diferentes, gravar as intensidades mostrado como "valores de cinza" em 640 nm e 580 nm, ou seja, λ 2 exc e λ 1 exc.

3. Análise da Ratiometric imagem Dados

  1. Insira os valores de cinza, medida a partir de cinco locais aleatórios ou a partir de uma área de interesse em uma planilha.
  2. Verifique a calibragem cinco pontos mostrou uma relação linear para indicar pH intracelular (por exemplo, a equação como y = 0.30x - 1,47; y = valor de cinza; x = pH; R = 0,934).
  3. Calcular os valores de pH intracelular a partir da equação utilizando o rácio nm medido 640/580 intensidade no passo 1.13.

4. A preservação de amostras, desidratação e montagem para microscopia eletrônica

  1. Preservar o estágio de vida de interesses com paraformaldeído a 4%. neste estudo, Corrigir os vermes tubulares de 2-4 dias após a fixação, manter os animais em fixador até a análise.
  2. Trabalhando em um exaustor, pós-fixar a amostra com solução aquosa de tetróxido de ósmio 1% por 30 min para minimizar o encolhimento do tecido durante o processo de desidratação.
  3. Desidratar a amostra com uma série de etanol graduada: etanol a 50% durante 5 min, 70% de etanol durante 5 minutos, 85% de etanol durante 5 minutos, 95% de etanol durante 5 min, e finalmente etanol absoluto, durante 5 min, duas vezes.
  4. Trabalhando numa hotte, adicionar uma solução 1: 1 de etanol e hexametildisilazano (HMDS) para a amostra, permitindo que o líquido se evapore completamente.
  5. Na hotte, adicionar 100% HMDS para a amostra, permitindo que o líquido se evapore completamente.
  6. Usando uma faca de diamante, introduzir alguns cortes no prato de cultura, em torno de alguns vermes tubulares. Com a tampa, segure a parte inferior prato contra um stub de alumínio para quebrar o prato.
  7. Sob um microscópio de dissecação, encontrar um pedaço fraturado contendo um tubeworm intacta.
  8. Aplicar a tinta de prata para um stub de alumínio e garantir o fragmento para o stub com cuidado. Tinta em torno das bordas do fragmento de plástico para reduzir a carga.

5. Localizar um rica em cálcio Região Usando SEM-EDS

  1. Fixe o topo da amostra no suporte da amostra.
  2. Medir a altura de todo o conjunto contra o medidor fornecido com o microscópio, ajustando a altura soltando a anilha de bloqueio e rodando o cargo até que a amostra está na altura padrão, ou digite a altura como registrado.
  3. Admita ar na câmara de câmbio microscópio e balançar a porta da câmara aberta. Deslize o suporte da amostra na extremidade da haste de troca. Em seguida, fechar e evacuar a câmara.
  4. Abra a válvula de gaveta e deslize a haste de câmbio em direcção à câmara de microscópio. Deslize a haste de câmbio em todo o caminho para encaixar o suporte de amostra para o palco microscópio. Retirar a vareta de troca e fechar a válvula de porta.
  5. entrada de tele provar dimensões e enviar o palco para a posição inicial para colocar a amostra abaixo da coluna de elétrons.
  6. Defina o nível de vácuo da câmara de 20-30 Pa no modo VP-SEM. Defina a tensão de aceleração de elétrons para 20 kV e virar a alta tensão diante.
  7. Elevar a mesa a uma distância da amostra de trabalho de 10 mm. Adquirir uma transmissão ao vivo e localize o espécime. Otimizar a imagem ajustando o astigmatismo e foco, se necessário.
  8. Abra o programa SEM-EDS e selecione a opção de modo EDS-SEM. Selecione a opção de menu para executar um mapa EDS.
  9. Mudança lente condensadora e de abertura para alcançar um tempo morto de ~ 30% em um tempo de processo de 3 como monitorado através do medidor de taxa no programa SEM-EDS. Executar procedimentos de feixe e alinhamento de abertura depois de fazer quaisquer alterações nas configurações de feixe.
  10. Seleccionar uma ampliação tal que um único organismo preenche todo o campo de vista. Habilite a opção de correção de desvio e capturar uma imagem no programa SEM-EDS.
  11. adquirir maP de dados com o organismo encher todo o campo de visão, usando um tempo de permanência de 50-100 ms. Executar o mapa até que os dados mostram a localização distinta de Ca no interior do organismo (aproximadamente 15 min).
  12. Para obter dados ponto-a quantificação, alterar o tempo de processo para 6 e ajustar a sonda de electrões para adquirir um tempo morto de ~ 30%. Executar etapas de alinhamento e otimizar a imagem como necessário.
  13. Selecione o ponto e opção de ID no programa SEM-EDS e adquirir outra imagem. Usando a ferramenta de ponto único, clique em áreas que apareceram Ca rico no mapa EDS, bem como áreas com deficiência de Ca para comparação. Digitalizar cada ponto de uma vez ao vivo de 30 s.

6. Identificar cristalográfica Informação de cálcio regiões ricas Usando SEM-EBSD

  1. Remover fragmento contendo amostras de plástico de interesse de stub espécime plano e apor à face inclinada de um topo de 45 ° pré-inclinado usando prata adesivo condutor.
  2. Dane-se o esboço sobre a amostra hmais velhos e a posição angular da face do topo (com amostra) para a frente do suporte da amostra. Insira o suporte de amostras para a câmara do microscópio utilizando a câmara de câmbio.
  3. Definir a câmara de vácuo a 30 Pa e tensão de aceleração de electrões a 20 kV. Enviar a amostra abaixo da coluna de elétrons e incline o estágio de 25 ° para colocar a superfície da amostra de aproximadamente 70 ° do normal para o feixe de elétrons. Vire a alta tensão diante.
  4. Elevar o palco para uma distância de trabalho de ~ 18 mm. Use a trackball para mover o palco e localizar um espécime. Aumentar a ampliação para enquadrar características específicas de interesse. Alinhar o feixe e otimizar a imagem como necessário.
  5. Abra o programa SEM-EDS no modo EBSD. Select calcita e aragonita como fases de interesse. Inserir a câmara EBSD a uma distância de 154 mm. Definir condições de câmera para 1 x 1 binning e um tempo de quadro de 100 ms. Usando uma varredura de feixe rápido, adquirir um fundo.
    NOTA: A taxa de quadros diferentepode ser necessária, dependendo da sonda de electrões; ajustar a taxa de quadros sonda ou câmera para conseguir um sinal de cerca de 90%.
  6. Capturar uma imagem no programa SEM-EDS. Use a ferramenta de análise de ponto e clique em algum lugar na imagem para digitalizar o feixe sobre esse ponto. Observe a janela da câmera para ver se forem detectados quaisquer padrões de Kikuchi.
  7. Clique em diferentes áreas da imagem para digitalizar locais de calcificação potenciais, observando janela da câmara em cada ponto para ver se bandas Kikuchi estão presentes. Se os padrões estão presentes e corresponde a nenhuma das fases selecionadas no banco de dados, eles serão automaticamente indexados.

7. TEM Preparação de amostras Usando FIB-SEM

  1. Por pulverização catódica, revestimento a amostra SEM preparados com platina ou material semelhante para criar uma camada condutora.
    1. Coloque as amostras previamente fixados, desidratados e montados na carcaça do revestidor por crepitação e ligar a energia para começar o bombeamento da câmara para baixo.
    2. Uma vez que a câmara de vácuo lê 40 mTorr ou menos, desligue o interruptor de gás no e aumentar o fluxo de gás argônio para chegar a uma pressão de câmara de 200 mTorr. Ajustar o fluxo de gás para atingir uma pressão de câmara de final de 80 mTorr.
    3. Ligue o interruptor de tensão no e aumentar a tensão para chegar a uma corrente de 15 mA. Definir o temporizador e um casaco por um tempo prolongado (~ 10 min) para criar uma camada de espessura (~ 60 nm), que protege a superfície da amostra de danos de irradiação de íons. Regular a tensão para manter um estável 15 mA de corrente.
    4. Uma vez terminado, desligue o coater para libertar o vácuo e retirar a amostra.
  2. Parafuso na base do preparado, por pulverização catódica amostra revestida sobre o post de parafuso M4 do suporte de amostras instrumento. Aperte até que a mão apertada, soltar a porca de travamento e gire o cargo suporte de amostras para alterar a altura da montagem. Use o medidor de altura a laser e ajustar a altura para ser menos de 1 mm (= 0,04 polegadas como mostrado no vídeo) do supplie padrãod, com o instrumento.
  3. Feche todas as válvulas de armas na FIB-SEM, em seguida, admitir ar para dentro da câmara estágio eucentric. Uma vez que a pressão tenha igualado com o meio ambiente, o cursor de fecho aberto ar e fixar o suporte da amostra sobre os dentes da haste de troca. Rodar o botão na extremidade da haste de troca para a posição de "bloqueio". Fechar o bloqueio aéreo e evacuar a câmara de bloqueio de ar.
  4. Uma vez que o bloqueio de fase de ar eucentric foi evacuado e a pressão que corresponde ao da câmara de FIB-SEM, abrir a válvula de porta e inserir a amostra, empurrando a haste de troca. Deslize a haste de câmbio em todo o caminho para acomodar o suporte de amostras na fase instrumento eucentric, em seguida, gire a haste de câmbio para a posição de "desbloqueio". Deslize a haste de câmbio de volta para fora e fechar a válvula de porta.
  5. Mova o palco para posicionar a amostra na coluna feixe de íons. Abra as válvulas de gaveta e adquirir uma imagem electrónica secundária induzida-ion ao vivo da FIB. Use baixa ampliação e umaraster scan rápido para minimizar os danos ion. Redefinir o foco do feixe de observação normal e aumentar a altura da fase Z até que a amostra está em foco. Neste ponto, a amostra está na posição de ponto cruz onde feixes tanto o ião e electrão são focadas no mesmo local.
  6. Usando a imagem de electrões secundários a partir do SEM, localizar a área de interesse na amostra, utilizando-se a bola de navegação para movimentar o espécime em torno. Áreas de interesse são áreas ricas Ca como previamente determinados pelo mapeamento de EDS. Girar a fase conforme necessário para obter as características de interesse de acordo com a moldura da janela.
  7. Na interface janela FIB, capturar uma visão rápida da amostra com uma ampliação de 1000X com um zoom digital de 2X adicional e desenhar um modelo de deposição ~ 8 mm x 2 mm sobre a área de interesse. O tamanho ampliação da caixa de deposição podem ser ajustadas para acomodar características de tamanhos diferentes. Defina as condições de descarga eléctrica para depositar carbono, usando uma kV 40, 0,09 nA feixe, usando um tempo de permanência de 0,5 mS durante 5 min.
  8. Após a deposição do carbono, modificar as condições de deposição para depositar tungsténio usando um 40 kV, 0,7 feixe nA, e depósito durante 5 min para gerar uma tampa uM tungsténio ~ 2-3.
  9. Capturar um instantâneo FIB usando o feixe de observação e usar a ferramenta microamostragem sputter para desenhar um padrão de quatro caixas em volta da tampa de tungstênio. Definir as caixas superiores e inferiores para ser de cerca de 15 um x 8 uM; o direito a caixa 10 um x 5 mm, e deixado a caixa de 6 ^ M x 5 mm, ou grande o suficiente para cercar a área de interesse.
    1. Modificar as condições de fabricação para cortar usando uma kV 40, 19 feixe nA, e um tempo de espera de 50 mS e 3-4 quadros de digitalização para cada caixa. Então fabricar o padrão. Após a fabricação, a área de interesse, com camadas de proteção C e W, será semelhante uma ilha, com todo o material adjacente removido na parte superior, inferior e lados direito.
  10. Incline a fase de 58 ° para colocar o SAMPle superfície normal à coluna de electrões e a um ângulo agudo para a coluna de iões. Localize a parte traseira da amostra "ilha" usando o FIB e capturar um instantâneo de 1000X ampliação e zoom digital 2-4X.
  11. Desenhar um padrão de descarga eléctrica ~ 15 mm x 2 mm sobre a parte inferior da parte traseira da amostra "ilha", no final de onde é visível. Fabricar a caixa utilizando um feixe de quatro nA durante 3 minutos, ou até que o feixe tem a atravessar o fundo da amostra "ilha."
  12. Incline o estágio eucentric -58 ° a partir da posição actual (de volta para zero). Inserir a sonda microamostragem tungsténio, clicando em "Probe Em" na interface do FIB. Selecione "MS" no painel de controle do estágio e use o trackball para mover a sonda por cima do espécime.
  13. Adquirir uma transmissão ao vivo da FIB com uma ampliação de 1 kx e posicionar a sonda de modo que a ponta está diretamente acima do lado direito da tampa de tungstênio do microsample. Ao observar um ao vivoimagem SE do SEM, use o botão do painel de controle de fase Z para baixar a sonda até tocar no tampão tungstênio. A campainha soará uma vez contato foi feito.
  14. Capturar um instantâneo usando o FIB utilizando a 40 kV, 0,01 feixe nA, com uma ampliação de zoom digital 1000X e 2X. Use a ferramenta de deposição para desenhar uma caixa x 2 m 2 m sobre a ponta da sonda onde entrou em contato com a tampa de tungstênio do microsample.
    1. Definir as condições para depositar tungsténio usando um 40 kV, 0,09 nA feixe, durante 2 min e um tempo de permanência de 0,5 mS. Então fabricar o padrão.
  15. Desenhar um padrão de pulverização catódica ~ 2 m x 5 mm sobre a extremidade esquerda da microsample "armar" (em que ainda está ligado ao volume da amostra). Fabricar o padrão utilizando uma kV 40, 0,7 feixe nA, durante 2 minutos, ou até que o sinal sonoro indica que o microsample foi separado da amostra global.
  16. Use o botão de controle Z para elevar a sonda com microsample anexado atéele limpa da amostra global, em seguida, retirar a sonda. Enviar o palco eucentric a Página inicial ou posição Exchange.
  17. Coloque um cobre meia-grade em um suporte de entrada lateral e carregar o suporte para a câmara de estágio de purga de entrada lateral. Evacuar a câmara e insira o suporte da entrada lateral. Defina o suporte para a posição FIB.
  18. Imprensa Side no painel de controle do estágio e use o trackball para trazer o meio-grade em exibição no monitor FIB. Mover para limpar a área da metade grade e usar o botão Z para trazer a superfície em foco.
  19. Imprensa Probe para inserir a sonda, pressione MS no painel de controle do estágio, e use o botão de trackball e Z para posicionar o microsample sobre a metade grid. Abaixe a sonda até que os contatos microsample grade.
  20. Capturar uma imagem na FIB de 1000X ampliação (zoom 2X). Use a ferramenta da deposição e desenhar um padrão ~ 10 mm x 3 mm sobre o lado inferior da microsample. tungstênio depósito com 40 kV, 0,7 feixe nA, usando uma temporização time de 0,5 mS para 3 min.
  21. Use a ferramenta de descarga eléctrica e desenhar um 1 um padrão x 3 mm pequeno sobre a ponta da sonda. Fabricar o padrão usando a 40 kV, 0,7 feixe nA em um tempo de permanência de 3 ms para cortar a sonda longe do microsample. Retrair a sonda uma vez livre.
  22. Capturar uma imagem FIB no 5,000X ampliação e desenhar dois padrões de pulverização 7 uM x 4 mm na parte superior e na parte inferior da microsample, deixando um intervalo uM ~ 1 entre as caixas. Centrar os padrões de modo a não cortar os lados esquerdo e direito do microsample. Fabricar ambos os padrões usando uma kV 40, 4 feixe nA, e um tempo de permanência de 3 mS, durante 2 min, definindo a direcção de varredura em direcção ao centro da microsample.
  23. Capturar outra imagem usando o feixe de observação FIB na 5,000X. Redimensionar as caixas de descarga eléctrica anteriores para ~ 6,5 uM X 1 um, mover-se mais perto em conjunto para manter uma distância de ~ 0,5 | iM, e fabricar utilizando um 40 kV, 0,7 feixe nA.
  24. Incline o estágio de entrada lateral 0.5 ° e bonéture outra imagem FIB. Redimensionar as caixas de descarga eléctrica a 6 m de largura. Posicione o padrão superior sobre o lado superior da microsample e fabricar usando a 40 kV, 0,7 feixe nA. Incline -0,5 ° e repita com o padrão de pulverização catódica inferior e lado inferior da microsample.
  25. Além disso diminuir a largura do padrão por ~ 0,5 m. Inclinação 0,5 ° e por pulverização catódica do lado de cima do microsample usando a 40 kV, 0,09 feixe nA. Repita com o lado inferior a -0,5 ° de inclinação.
  26. Incline o ° estágio 2.2 e adquirir uma imagem de FIB em 10.000 vezes. Redimensionar os padrões de descarga eléctrica a 5 m de largura e mudar as condições de feixe de 5 kV, 0,03 nA. Posicione o padrão superior sobre o lado superior da microsample, até a borda superior, e fabricar. Incline -2,2 ° e repita com o lado inferior e padrão de fundo.
  27. Repita 5 passos kV moagem até o microsample torna-se elétrons transparente (~ 100 nm de espessura). Uma vez terminado, gunvalves perto e remova o suporte de entrada lateral.

8. Obtaining Selecionado Padrão Área Difração em um TEM

  1. Para preparar o instrumento para análise, preencher ambos Dewar frascos com azoto líquido e definir a tensão de aceleração de 300 kV.
  2. Após a preparação das amostras utilizando o FIB, remover o suporte do lado de entrada do FIB-SEM e ajustar a posição do pino de tal forma que o comprimento de suporte que corresponde ao do de 300 kV MET. Gire a ponta do titular para a posição de observação correta, uma vez mais, comparando-a com o suporte do TEM padrão para garantir a orientação da amostra correta.
    1. Como alternativa, remova o meio-grade com lamelas em anexo do titular da FIB-SEM e coloque no porta-TEM padrão.
  3. Carregar o suporte de amostra para a câmara de câmbio do TEM e evacuar a câmara. Certifique-se de que a válvula de arma instrumento está fechada sempre que o ar é admitido na câmara de câmbio. Uma vez que a câmara de câmbio tem bombeado para baixo, um alarme sonoro soará. Girar a porta-amostras e permitir que o VacuUM para puxar o suporte de amostras para a primeira posição de paragem.
  4. Permitir que o vácuo instrumento para se recuperar, e em seguida, abra a válvula de arma. Redefinir o foco e zoom para uma ampliação de cerca de 10.000 vezes.
  5. Use os botões de alinhamento a deslocar o feixe para o centro da tela de fósforo. Contrato e expandir o feixe e garantir que todo o movimento do feixe é concêntrica. Ajustar para stigmatism condensador conforme necessário.
  6. Rodar o suporte da amostra sentido anti-horário e permitir que o vácuo para puxar o suporte totalmente para a coluna. Use o movimento botões palco para navegar e localizar a amostra.
  7. Aumentar a ampliação da amostra e ajustar o Z-altura até que a amostra está em foco. Use as oculares ópticos, conforme necessário.
  8. Insira a câmera e remover a tela de fósforo. Expandir o feixe, conforme necessário, para evitar supersaturação da câmara. Ajustar os parâmetros de foco e da câmera, em seguida, iniciar a aquisição para capturar uma imagem.
  9. Para adquirir um padrão de difracção, o primeiro centrocaracterística de interesse. Remover o objectivo de abertura e inserir a abertura de difracção.
  10. Mudar para o modo de lente de difração, premindo o botão DIFF no painel de controle e use o botão de controle DIFF para encolher o feixe.
  11. Inserir o redutor como necessário para evitar que o centro do padrão de difracção a partir da queima do ecrã da câmara ou de fósforo. Comece aquisição da câmera para capturar uma imagem do padrão.

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Representative Results

A seguir estão algumas observações do processo de calcificação durante a metamorfose da tubeworm. A Figura 1 mostra que os valores de pH perto da região de gola é mais elevado do que os outros tecidos após a metamorfose. Figura 2i mostra uma tubeworm com distribuição homogénea do Ca, sugerindo sem grandes eventos de calcificação começaram; Figura 2ii mostra uma tubeworm que calcificada por um longo período, o que sugere a calcificação foi além do ponto de tempo de interesse; Figura 2iii mostra uma tubeworm com a fase de calcificação de interesse, que foi selecionado para uma análise mais aprofundada para entender o tecido responsável pela mineralização. A Figura 3 mostra os valores de pH mais elevados estão correlacionados com os sinais de iões Ca mais elevados de ambos coloração calceína e mapeamento SEM-EDX. A partir destas observações, o tecido a partir da fase de vida de interesse foi examinada numa oigher resolução usando uma técnica mais localizada, SEM-EBSD. Após a descoberta da fase mineral, A Figura 4 mostra a aplicação do feixe de iões focado para levantar o material de interesse para análise de TEM e área de difracção seleccionados para confirmar a cristalinidade do mineral.

figura 1
Figura 1: Mapeamento de pH intracelular do tubeworm (a partir de Chan et ai 2015.). Em 71 h após o tratamento IBMX, um tubeworm, elegans hydroides, o que representa uma taxa mais lenta de metamorfose demonstra uma grande heterogeneidade na distribuição pH intracelular. imagem DIC (canto superior esquerdo) e pseudocolorized imagens compostas gerados a partir dos valores de cinza em 640 nm dividido por valores de cinza em 580 nm (canto superior direito) são mostrados. Os valores de cinzento calculados a partir da relação de 640/580 nm é proporcional ao pH intracelular. a profiles dos valores cinza das imagens compostas, foram convertidos em valores de pH intracelular através da distância ao longo do eixo do corpo longitudinal do tubeworm (painel inferior). A relação entre o pH intracelular e a proporção 640/580 nm de emissão foi estabelecida in vitro por calibração (y = 0.30x - 1,47; R2 = 0.934; y, valor de cinzento; x, pH intracelular). Regiões com pH acima de pH 8,5 intracelular (a vermelho) são correspondentes às regiões onde as estruturas calcificadas foram encontrados. Barras de escala = 100 pm; c, colarinho; b, lobos branquiais; formiga, anteior; post, posterior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Identificar o estágio de vida de interesse usando SEM-EDS.
Vermes tubulares em diferentesponto de tempo de metamorfose foram rastreados para capturar a fase de recém-calcifying para posterior análise (i) Um dia 1 pós-metamórfica tubeworm mostra a distribuição homogênea do sinal de Ca (ii) Um dia de crescimento mais rápido tubeworm 2 pós-metamórfica mostra um pequeno anel de sinal de Ca (iii) A mais lento dia crescendo 2 pós metamórfica tubeworm mostra os pontos de sinal de Ca. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Caracterização de sinais AC utilizando microscopia ao vivo (de Chan et al 2015).. (I-IV), a SEM-EDS (V-VII) e SEM-EBSD (viii-x). A distribuição do ião cálcio como sinal correlacionado com calceína em 31 h e 53 h após a metamorfose das hydroides elegans. As imagens DIC (painel esquerdo, 3i e iii) e tele calceína sinal (painel esquerdo, 2ii e iv) são mostrados. Microscopia eletrônica correlativa no dia elegans hydroides 2 pós-metamórficos detectadas manchas de estruturas calcificadas, como mostra a imagem SEM uma menor tensão (5 kV) (painel do meio, 3v). mapeamento análise SEM-EDS, realizada a 20 kV, mostra uma distribuição heterogênea de cálcio (painel do meio, 3vi, Ca; em amarelo). Os teores de Ca são apresentados como números de sobrepondo um detalhe de superfície maior de baixa voltagem (5 kV) imagem da tubeworm, o Ca conteúdo (peso mol%, pontos decimais estão alinhadas para mostrar a localização da mancha análises) obtido a partir de quantificação local ( com SEM-EDS a 20 kV) (painel do meio; 3vii). Regiões com um teor de Ca maior do que 15 mol% em peso tendem a ser estruturas calcificados. análise SEM-EBSD das regiões ricas em cálcio é illuastrated no painel direito da 2viii-x. As regiões ricas de cálcio (caixa branca) como encontradas nos resultados SEM-EDS foram ainda analisados ​​com EBSD (painel direito; 3viii) (ii) O círculo (painel da direita;3iX) indica o site análise EBSD; um padrão de Kikuchi (painel direito; 2x) sugere o site é aragonite a partir da interface de software / EBSD microanálise EDS. c, colarinho; b, lobos branquiais; formiga, anterior; post, posterior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Caracterização da estrutura cristalina usando FIB-MET (a partir de Chan et ai 2015.). (I) A região que apresenta um padrão de Kikuchi de EBSD foi excisado para preparar uma amostra de MET, (ii) o material circundante removido excisado por um feixe de iões focado técnica (FIB) (vista de topo), (iii) o material foi suspenso por meio de um sonda de tungsténio (vista lateral), (iv) a amostra com uma espessura final de ~ 200 nm, a qual foi obtida a uma tensão mais baixa. área circulada em (v) foramanalisada para a presença do padrão de difracção-área seleccionada de uma MET (VI), que mostra um padrão de um único cristal de aragonite. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

imagiologia óptica vivo é um método útil para a observação de eventos celulares em um organismo multicelular. Aqui, os indicadores de pH e de iões de cálcio internos foram usados ​​para medir o fluxo de iões nos locais de mineralização. Nestas regiões, bombeamento ião activo é necessário para elevar o pH e a concentração de Ca2 + para permitir a calcificação 2, 3. Ao aplicar moléculas fluorescentes para estudar um organismo, que é crítico para assegurar que a concentração utilizada tem toxicidade desprezável e permite que o organismo para realizar de um modo fisiologicamente relevante. Uma concentração mais baixa coloração seria menos tóxico e está geralmente associada a um tempo mais longo de coloração 10. É importante manter uma baixa densidade de larvas durante o período de incubação, a minimização da privação de oxigénio e a acumulação de resíduos no período de coloração.

Antes de prosseguir os métodos FIB / TEM, que envolve uma localizadaregião de interesse, é crucial para a tela através do estágio de vida e tecido de interesse utilizando métodos de resolução mais baixas, como SEM-EDS e SEM-EBSD. Observando o espécime sob a modalidade retroespalhada permite a visualização da composição elementar relativa onde contraste mais claro se correlaciona com maior peso atômico 11. Assim, as imagens SEM-BSE igualmente fornecer uma estimativa de onde os elementos mais pesados, como os íons de cálcio e ósmio glóbulos lipídicos corados estão localizados. MEV-EDS permite o mapeamento mais específica de íons de cálcio nas amostras. No entanto, não se confirmar a presença de CaCO 3 cristalina. SEM-EBSD permite a detecção de estruturas cristalinas, embora os métodos convencionais requerem EBSD uma superfície polida 12. Este estudo demonstra como SEM-EBSD em uma amostra unpolished pode fornecer informações úteis. Uma corrente de feixe de 20 kV permite uma maior profundidade da análise na superfície da amostra. Portanto, EBSD é um método conveniente para detectara presença de biomineral, especialmente em amostras biológicas pequenas intactas, como larvas marinhas. Embora as amostras não polidos iria dar falsos negativos quando minerais não são de frente para o detector a cerca de 70 °, vendo um padrão Kikuchi é considerado evidência inequívoca de uma fase mineral na região de interesse 13.

A microscopia electrónica de transmissão (TEM) permite a caracterização estrutural de uma gama mais ampla de materiais 14. O feixe de íons focalizados (FIB) permite local de extracção e preparação de uma amostra com dimensões típicas para a análise TEM 15 específico. Por conseguinte, a técnica de FIB / MET é um método adequado para analisar biomateriais recentemente depositadas numa área localizada. instrumentos FIB-SEM combinadas também permitir a observação livre de danos de um espécime através do uso de uma coluna de feixe de elétrons integrado. revestimento por pulverização catódica Tungsten da amostra aumenta a condutividade e limites íon implantation e danos de irradiação da amostra 16. O uso de um feixe de iões finamente focado com um baixo tempo de permanência permite moagem de materiais orgânicos. Dentro da FIB-SEM, uma característica particular de interesse pode ser extraído de uma amostra a granel e diluído a elétron transparência para análise TEM 17. Devido à alta energia do feixe de iões, materiais cristalinos pode ser tornada amorfa. Isto pode ocorrer quando se prepara uma lamela fino para análise de TEM e pode ser mitigado utilizando um feixe de baixa tensão de aceleração de iões para remover a camada amorfa.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hexamethyldisilazane  Electron Microscopy Sciences 16700(EM)
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 19192
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine ThermoFisher Scientific PHZ1124
Nigericin, Free Acid ThermoFisher Scientific N7143-5MG
35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat ThermoFisher Scientific D110400
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate ThermoFisher Scientific C-1271
BDH Potassium Chloride, ACS Grade VWR BDH0258-500G
Paraformaldehyde
reagent grade, crystalline		 Sigma P6148
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis Wako Pure Chemical Industries, Ltd 083-01095
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis Wako Pure Chemical Industries, Ltd 199-02185
Calcein Sigma C0875
FASW Iwaki Co. Ltd. Rei-sea Marine
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm ADVANTEC A045A047A
ethanol Wako Pure Chemical Industries, Ltd 051-00476
Artificial seawater for buffers by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf
Sodium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 191-01665
Potassium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 163-03545
Magnesium Chloride Hexahydrate Wako Pure Chemical Industries, Ltd 135-00165
Calcium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 039-00475
Sodium Sulfate Wako Pure Chemical Industries, Ltd 197-03345
Hydrochloric Acid Wako Pure Chemical Industries, Ltd 089-08415
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) Wako Pure Chemical Industries, Ltd 207-06275
2-aminopyridine Wako Pure Chemical Industries, Ltd 011-02775
Orion 5-star Plus pH meter Thermo Scientific
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP Thermo Scientific
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 Zeiss
ImageJ NIH, Bethesda, MD, USA
HRTEM H500 Hitachi
SU6600 VPSEM Hitachi
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system Hitachi 

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References

  1. Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
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Microbiologia Edição 120 medição de pH Ratiometric EDS EBSD Focused Ion Beam (FIB) TEM microscopia eletrônica ciências biológicas (Geral)
Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha
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Chan, V. B. S., Toyofuku, T.,… More

Chan, V. B. S., Toyofuku, T., Wetzel, G., Saraf, L., Thiyagarajan, V., Mount, A. S. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. J. Vis. Exp. (120), e55164, doi:10.3791/55164 (2017).

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