真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製
Summary
We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.
Abstract
活性なタンパク質-タンパク質およびタンパク質-核酸複合体の精製は、酵素活性および新規サブユニットおよび翻訳後修飾の新規同定の特徴付けのために重要です。細菌系は、単一のポリペプチドおよびタンパク質複合体の広範囲の発現および精製を可能にします。しかし、このシステムは、翻訳後修飾を含有タンパク質サブユニット（ 例えば 、リン酸化およびアセチル化）の精製、および唯一の存在である新規な調節サブユニットの識別を可能に/真核生物系で表現されません。ここでは、真核細胞から一過性または安定的に発現エピトープタグ付きタンパク質とタンパク質複合体の精製を容易に小説、堅牢、かつSTREP-を使用して効率的なタンデムアフィニティー精製（TAP）法およびFLAGタグ融合タンパク質の詳細な説明を提供します。このプロトコルはPROTを特徴付けるために適用することができますEIN複雑な機能、複雑なサブユニット上の翻訳後修飾を発見する、および質量分析によって新たな規制の複雑なコンポーネントを識別するために。特に、このTAP法は、このように下流の実験機会の広い配列を得、真核生物または病原性（ウイルス性および細菌性）成分により形成されるタンパク質複合体を研究するために適用することができます。我々は、タンパク質複合体を扱う研究者は、多くの異なる方法で、この方法を利用することができることを提案します。
Introduction
タンパク質間相互作用（PPIの）生物学的プロセス1の正確な調節のために重要であり、これらのPPIに関するさらなる研究は、それらの機能2をお知らせすることができます。いくつかのアプローチがのPPIの研究と特徴付けのためだけでなく、新たな規制のタンパク質成分のデノボ識別のために考案されています。 1989年、スタンリーフィールズらは、酵母ツーハイブリッド（Y2H）アッセイ3を報告しました 。このアプローチは、 サッカロマイセス・セレビシエの関心の定義されたタンパク質（ベイト）のための相互作用（獲物）の公正かつ包括的な同定を可能にします。 PPIを発見するために著しい有用性に加えて、Y2Hアッセイは、酵母細胞におけるタンパク質の組を特徴付ける最小相互作用ドメインを定義し、そのような相互作用を廃止突然変異を同定するために使用することができます。 Y2Hアッセイを改変することによって、のPPIはまた、哺乳動物細胞において研究することができますクラス= "外部参照"> 4。 Y2Hアッセイ（ 例えば 、酵母スリーハイブリッドシステム）の変動は、細胞内タンパク質、RNAおよびタンパク質-小有機リガンド相互作用を研究するために適用することができます。
相同システムでのPPIを研究するための別の一般的に使用されるツールは、共免疫沈降（共-IP）アッセイ5です。関心対象のタンパク質を免疫沈降するために抗体を使用することにより、共IPアッセイは、研究者が様々な環境条件および実験の状況のために細胞中でのPPIを監視することを可能にします。親和性精製（AP）メソッド内のエピトープタグ付きタンパク質の使用（ 例えば 、FLAG、Mycを、STREP、およびとりわけHAは、）、銀染色をウェスタンブロットを含むいくつかの下流のアッセイのための複雑なタンパク質混合物からのタンパク質の単離を容易にしました、および酵素的分析。しかしながら、これらの従来のアプローチのいずれも、in vitroでの Aを含む、さらなる特徴付けのためのタンパク質複合体の大量の単離を可能にしませんssays、質量分析による調節サブユニットの発見、および翻訳後修飾の同定。 AP法の改良版は、2後続のAP 6、7を通して精製された2つのエピトープとの融合タンパク質を作成することでのPPIを研究するための精製技術であるタンデムAP（TAP）と呼ばれています。この記事では、二つのサブユニットは、異なるエピトープでタグ付けした後、2回の連続のAP（STREP AP FLAG IPが続く）を通して精製された精製タンパク質複合体のためのTAP方法のバリエーションを提示します。研究者が興味のあるタンパク質複合体に適用できるように、我々はまず、TAPのミニマル概要（ 図1）と、すべての実験工程（ 図2）の詳細な説明を提供します。
TAP法の適用性を実証するために、我々は、PTと呼ばれる（複雑なよく特徴付けサイクリンCDKを選ん調節サブユニット、サイクリンT1（CycT1）及びキナーゼ（CDK9）から構成され、RNAポリメラーゼII（Pol II）8、9、10による転写の調節に関与するEFBキナーゼ）。 P-TEFbはポルIIプロモーターで転写休止を軽減それに関連する負の伸長因子のC末端ドメインをリン酸化し、それによって転写伸長11、12、13を容易にします 。このことを念頭に置い既知の相互作用により、STREPタグ付きCycT1およびFLAGタグCDK9はHEK293T細胞で過剰発現しました。逆数TAP実験をさらにタンパク質相互作用を利用するエピトープとは無関係であることを検証するためにSTREPタグ付きCDK9およびFLAGタグCycT1を用いて行きました。細胞を48時間トランスフェクション後に回収し、溶解しました。可溶性溶解物をTAPにより精製した（STREP APは、FLAGが続きますIP）。入力および精製されたタンパク質は、ウェスタンブロットおよび銀染色（ 図3）によって分析しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
真核細胞からのタンパク質複合体の発現および単離のためにここに記載したプロトコルは、このような分子集合体の生化学的特徴付けに限定されるものではなく、それらの機能を調節することができ、新規な相互作用および翻訳後修飾の同定に利用することができます。親和性タグの使用は、このプロトコルに記載されているものに限定されるものではありません。しかし、我々の経験は、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D’Orso.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30022FS | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher Scientific | MP091670049 | |
| PolyJet | Fisher Scientific | 50-478-8 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | SLBQ1981V | |
| Corning 100mm × 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Fisher Scientific | 13-698-794 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
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