Tandem Affinity Rensing av protein komplekser fra eukaryote celler
Summary
We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.
Abstract
Rensingen av aktivt protein-protein og protein-nukleinsyre-komplekser er avgjørende for karakteriseringen av enzymatiske aktiviteter og de novo identifisering av nye underenheter og post-translasjonelle modifikasjoner. Bakterielle systemer tillater for ekspresjon og rensing av en rekke forskjellige enkle polypeptider og proteinkomplekser. Men dette systemet ikke aktivere rensing av protein subenheter som inneholder posttranslasjonelle modifikasjoner (f.eks fosforylering og acetylering), og identifisering av nye regulatoriske subenheter som bare er til stede / uttrykt i eukaryote system. Her gir vi en detaljert beskrivelse av en roman, robust og effektiv tandem affinitet rensing (TAP) metode med bruk STREP- og flagg-merkede proteiner som forenkler rensing av protein komplekser med forbigående eller stabilt uttrykt epitop-merket proteiner fra eukaryote celler. Denne protokollen kan brukes til å karakterisere protein kompleks funksjonalitet, for å oppdage posttranslasjonelle modifikasjoner på komplekse subenheter, og å identifisere nye regulatoriske komplekse komponenter ved massespektrometri. Spesielt, kan denne TAP metoden anvendes til å studere proteinkomplekser dannet av eukaryote eller sykdomsfremkallende (viral og bakteriell) komponentene, for således å gi et bredt spekter av eksperimentelle nedstrøms muligheter. Vi foreslår at forskere som arbeider med protein komplekser kan utnytte denne tilnærmingen på mange forskjellige måter.
Introduction
Protein-protein interaksjoner (PPI) er kritisk for nøyaktig regulering av biologiske prosesser 1, og videre studier på disse PPIer kan informere om deres funksjon 2. Flere metoder har blitt utviklet for å studere og karakteriseringen av PPIer så vel som for de novo identifisering av nye regulatoriske proteinkomponenter. I 1989 Stanley Fields og kolleger rapporterte gjær to-hybrid (Y2H) assay tre. Denne tilnærmingen gjør det mulig for objektiv og helhetlig identifisering av interactors (byttedyr) for en definert protein av interesse (agn) i Saccharomyces cerevisiae. I tillegg til den bemerkelsesverdige verktøy for å oppdage PPIer, kan Y2H analysen anvendes for å karakterisere protein parene i gjærceller, som avgrenser minimal samvirkende domener, og å identifisere mutasjoner som avskaffe slike interaksjoner. Ved å endre Y2H analysen, kan PPIs også bli studert i pattedyrcellerclass = "xref"> 4. Variasjoner av Y2H analysen (f.eks gjær tre-hybrid systemet) kan også brukes til å studere protein-RNA og protein liten organisk ligand interaksjoner på celler.
En annen mye brukt verktøy for å studere PPIs i en homolog system er co-immunoprecipitation (co-IP) assay 5. Ved å bruke et antistoff mot immunutfelle et protein av interesse, kan det ko-IP-analysen forskere til å overvåke PPIer i celler for forskjellige miljøforhold og eksperimentelle situasjoner. Bruken av epitop-merket proteiner (f.eks FLAG, Myc, STREP, og HA, blant andre) i affinitet rensing (AP) metoder har muliggjort isolering av proteiner fra komplekse proteinblandinger for flere nedstrøms analyser, blant annet western blot, sølvfarge og enzymatisk analyse. Imidlertid har ingen av disse tidligere fremgangsmåter muliggjøre isolering av store mengder av proteinkomplekser for ytterligere karakterisering inkludert in vitro enssays, oppdagelsen av regulatoriske subenheter av massespektrometri, og identifisering av posttranslasjonelle modifikasjoner. En forbedret versjon av AP metoden kalles tandem AP (TAP), som er en renseteknikk for å studere PPIer ved å lage et fusjonsprotein med to epitoper som er renset gjennom to påfølgende aksesspunkter 6, 7. I denne artikkelen presenterer vi en variasjon av den TAP metode for rensing av protein komplekser hvor to subenheter er merket med forskjellige epitoper og deretter renset gjennom to sekvensielle aksesspunkter (AP STREP fulgt av FLAG IP). Vi gir først en minimalistisk oversikt over TAP (figur 1), og deretter en detaljert beskrivelse av alle de eksperimentelle trinn (figur 2), slik at forskere kan bruke dem til deres protein kompleks av interesse.
For å demonstrere anvendeligheten av den TAP-metoden, valgte vi et godt karakterisert cyklin-CDK-kompleks (kalt PTEFB kinase), som består av regulerings subenheten cyclin T1 (CycT1) og en kinase (CDK9), og er involvert i regulering av transkripsjon av RNA polymerase II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforylerer det C-terminale domene av Pol II og de tilhørende negative forlengelsesfaktorer, som avlaster transkripsjonen midlertidig stopping ved promotoren og derved letter transkripsjon forlengelse 11, 12, 13. Med dette kjent interaksjon i tankene, STREP-merket CycT1 og FLAG-merket CDK9 var over uttrykt i HEK293T celler. En gjensidig TAP eksperiment ble utført med STREP-merket CDK9 og FLAG-merket CycT1 å ytterligere bekrefte at proteinet interaksjonen er uavhengig av epitoper utnyttet. Celler ble oppsamlet og lysert 48 timer etter transfeksjon. Det oppløselige lysat ble renset ved TAP (STREP AP etterfulgt av FLAGIP). Inngangs- og rensede proteiner ble analysert ved hjelp av western blot og sølvfarging (fig 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen er beskrevet her for ekspresjon og isolering av proteinkomplekser fra eukaryote celler er ikke begrenset til den biokjemiske karakteriseringen av slike molekylære sammenstillinger, men kan også benyttes for identifisering av nye interactors og post-translasjonelle modifikasjoner som kunne regulere deres funksjon. Utnyttelsen av tilhørighet koder er ikke begrenset til det som er nevnt i denne protokollen; men vår erfaring tyder på at bruk STREP som den første AP trinnet forbedrer utbyttet av det endelig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D’Orso.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30022FS | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher Scientific | MP091670049 | |
| PolyJet | Fisher Scientific | 50-478-8 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | SLBQ1981V | |
| Corning 100mm × 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Fisher Scientific | 13-698-794 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
- Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
- Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
- Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
- McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D’Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
- D’Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
- McNamara, R. P., Bacon, C. W., D’Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
- Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
- McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
- Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
- Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).
