رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز
Summary
هنا، ونحن بالتفصيل طريقة S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجينة (سبلاش)، والتي تمكن رسم الخرائط على نطاق الجينوم التفاعلات داخل الجزيئات وبين الجزيئات رنا-رنا في الجسم الحي . سبلاش يمكن تطبيقها لدراسة رنا تفاعلات الكائنات الحية بما في ذلك الخميرة والبكتيريا والبشر.
Abstract
معرفة كيفية تفاعل الحمض النووي الريبي مع أنفسهم ومع الآخرين هو المفتاح لفهم تنظيم الجينات رنا على أساس في الخلية. في حين أظهرت أمثلة على التفاعلات الحمض النووي الريبي رنا مثل التفاعلات الرنا الميكروي-مرنا لتنظيم التعبير الجيني، والمدى الكامل لتفاعلات الحمض النووي الريبي تحدث في الخلية لا يزال مجهولا. الأساليب السابقة لدراسة التفاعلات الحمض النووي الريبي ركزت في المقام الأول على مجموعات فرعية من الحمض النووي الريبي التي تتفاعل مع بروتين معين أو أنواع الحمض النووي الريبي. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة اسمها S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجين (سبلاش) التي تسمح التقاط الجينوم واسعة من التفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي بطريقة غير منحازة. سبلاش يستخدم في الجسم الحي كروسلينكينغ، ربط القرب، وارتفاع تسلسل الإنتاجية لتحديد الجزيئات داخل الجزيئات و بين الجزيئات شركاء الاقتران على الصعيد العالمي. سبلاش يمكن تطبيقها على الكائنات الحية المختلفة بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا البشرية، وكذلكs الظروف الخلوية المتنوعة لتسهيل فهم ديناميات منظمة رنا تحت السياقات الخلوية المتنوعة. كامل بروتوكول سبلاش التجريبية يستغرق حوالي 5 أيام لإكمال وسير العمل الحسابي يستغرق حوالي 7 أيام لإكمال.
Introduction
دراسة كيفية جزيئات أضعاف وتفاعل مع بعضها البعض هو المفتاح لفهم تنظيم الجينات في الخلية. في حين تم تركيز الكثير من الجهد في العقد الماضي على فهم كيفية مساهمة الحمض النووي والبروتينات في تنظيم الجينات، أقل نسبيا هو معروف عن تنظيم ما بعد النسخي التعبير الجيني. الحمض النووي الريبي يحمل المعلومات في كل من تسلسلها الخطي وفي هيكلها الثانوي والثالث 1 . قدرتها على قاعدة الزوج مع نفسها ومع الآخرين مهم لوظيفتها في الجسم الحي . وقد وفرت التطورات الأخيرة في إنتاجية عالية رنا التحقيق هيكل الثانوي رؤى قيمة في مواقع المناطق مزدوجة ومفردة الذين تقطعت بهم السبل في ترانسكريبتوم 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، هاولا تزال المعلومات المتعلقة بشركاء التفاعل المقترن مفقودة إلى حد كبير. لتحديد تسلسل الحمض النووي الريبي الذي يتفاعل مع منطقة رنا أخرى في ترانسكريبتوم، نحن بحاجة إلى المعلومات العالمية الحكمة.
إن رسم خرائط تفاعلات الحمض الريبي النووي (رنا) بين الزوجين بطريقة عالمية وغير منحازة كان تقليديا تحديا كبيرا. في حين أن النهج السابقة، مثل كلاش 9 ، هيكليب 10 و راب 11 ، وتستخدم لتحديد تفاعلات الحمض النووي الريبي على نطاق واسع، وهذه التقنيات عادة رسم الاقتران قاعدة الحمض النووي الريبي لمجموعة فرعية من الحمض النووي الريبي التي تتفاعل مع بروتين معين أو أنواع الحمض النووي الريبي. وتشمل التطورات الأخيرة في دراسة التفاعلات رنا العالمية طريقة ربل 12 ، والتي لا استقرار التفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي ، وبالتالي قد التقاط فقط مجموعة فرعية من التفاعلات في الجسم الحي . وللتغلب على هذه التحديات، طورنا نحن وغيرهم استراتيجيات غير متحيزة على نطاق الجينومp رنا إنتيراكتوميس في الجسم الحي ، وذلك باستخدام إصدارات معدلة من سبورالين كروسلينكر 13 ، 14 ، 15 . في هذا البروتوكول، ونحن تصف تفاصيل لأداء S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجين (سبلاش)، والذي يستخدم السورالين البيروكسيديز لربط كروتينك قاعدة رنا في الجسم الحي ، تليها ربط القرب وارتفاع تسلسل الإنتاجية إلى تحديد الحمض النووي الريبي قاعدة الاقتران الشركاء الجينوم واسعة ( الشكل 1 ) 15 .
في هذه المخطوطة، ونحن تصف الخطوات لأداء سبلاش باستخدام الخلايا الملتصقة مثقف، في هذه الحالة خلايا هيلا. نفس البروتوكول يمكن أن تتكيف بسهولة لخلايا الثدييات تعليق والخميرة والبكتيريا الخلايا. لفترة وجيزة، يتم معالجة الخلايا هيلا مع السورالين البيروكسيديز والأشعة في 365 نانومتر إلى كروسلينك التفاعل أزواج قاعدة الحمض النووي الريبي في الجسم الحي. ثم يتم استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا، مجزأة وإثراء لمناطق تشابك الارتباط باستخدام الخرز ستريبتافيدين. ثم يتم ربط ليغاتد شظايا التفاعل الحمض النووي الريبي معا باستخدام ربط القرب وجعلها إلى مكتبة [كدنا] لتسلسل عميق. عند التسلسل، يتم تعيين رنا الخيميري على ترانسكريبتوم / الجينوم لتحديد المناطق التفاعلية رنا التي يتم إقرانها مع بعضها البعض. لقد استخدمت بنجاح سبلاش لتحديد الآلاف من التفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي في الخميرة والخلايا البشرية المختلفة، بما في ذلك الجزيئات داخل الجزيئات و بينا الجزيئات الاقتران في فئات متنوعة من الحمض النووي الريبي، مثل سنورناس، لكرناس و مرناس، لمحة عن التنظيم الهيكلي وأنماط التفاعل من رنا في الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف بالتفصيل سير العمل التجريبي والحسابي ل سبلاش، وهي الطريقة التي تسمح لنا لتحديد التفاعلات الحمض النووي الريبي الزوجين الحكمة في طريقة الجينوم واسعة. لقد استخدمنا بنجاح سبلاش في الثقافات البكتيرية والخميرة والثقافات البشرية، وتوقع أن الاستراتيجية يمكن …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر وان ومختبر ناغاراجان للمناقشات بالمعلومات. ويدعم N.Nagarajan بتمويل من A * ستار. يتم دعم Y.Wan بتمويل من A * ستار والمجتمع في العلوم-برانكو فايس الزمالة.
Materials
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
| 10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
| 20 % SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
| 20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
| 3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
| 40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
| Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
| Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
| Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
| Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
| D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
| Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
| Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
| Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
| F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
| Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
| G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
| Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
| Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
| Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
| High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
| Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
| DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
| Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
| Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
| Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
| T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
| Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
| UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
| UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
| List of software required | |||
| FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
| BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
| SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
| PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
| STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
| rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| Buffer composition | |||
| Elution buffer: | |||
| 0.3 M sodium acetate | |||
| Lysis Buffer: | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| 1% SDS | |||
| Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
| Proteinase K Buffer | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 10 mM TrisCl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 0.5% SDS | |||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl | |||
| 1% SDS | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
| Always add Superase-in fresh before use | |||
| 2x SSC Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
| 0.5% SDS | |||
| 2X RNA fragmentation buffer | |||
| 18mM MgCl2 | |||
| 450mM KCl | |||
| 300mM Tris-CL pH 8.3 | |||
| 2x RNA loading Dye: | |||
| 95% Formamide | |||
| 0.02% SDS | |||
| 0.02% bromophenol blue | |||
| 0.01% Xylene Cyanol | |||
| 1mM EDTA | |||
| 3' RNA adapter sequence | 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC | ||
| RT primer sequence | AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |
References
- Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
- Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
- Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
- Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
- Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
- Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
- Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
- Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
- Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O’Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
- Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).
