Her beskriver vi metoden for S- ækvurdering af P soralen tværbundet, L igateret og S valgte H ybrids (SPLASH), som muliggør genomgående kortlægning af intramolekylære og intermolekylære RNA-RNA-interaktioner in vivo . SPLASH kan anvendes til at studere RNA-interaktomer af organismer, herunder gær, bakterier og mennesker.
At vide, hvordan RNA'er interagerer med sig selv og med andre er nøglen til at forstå RNA-baseret genregulering i cellen. Mens eksempler på RNA-RNA-interaktioner, såsom mikroRNA-mRNA-interaktioner, har vist sig at regulere genekspression, er det fulde omfang, som RNA-interaktioner forekommer i cellen endnu ikke kendt. Tidligere metoder til undersøgelse af RNA-interaktioner har primært fokuseret på delsæt af RNA'er, der interagerer med et bestemt protein eller RNA-species. Her beskriver vi en metode, der hedder S- ækvurdering af P soralen tværbundet, L igated, og S valgte H ybrids (SPLASH), der tillader genomsøgning af RNA-interaktioner in vivo på en upartisk måde. SPLASH udnytter in vivo tværbinding, nærhedsligation og høj gennemstrømningssekvensering for at identificere intramolekylære og intermolekylære RNA baseparingspartnere globalt. SPLASH kan anvendes til forskellige organismer, herunder bakterier, gær og humane celler, samt aS forskellige cellulære betingelser for at lette forståelsen af dynamikken i RNA organisationen under forskellige cellulære sammenhænge. Hele den eksperimentelle SPLASH-protokol tager cirka 5 dage at fuldføre, og den beregningsmæssige arbejdsgang tager cirka 7 dage at fuldføre.
At studere, hvordan makromolekyler foldes og interagerer med hinanden er nøglen til at forstå genregulering i cellen. Medens en stor indsats har været fokuseret i det sidste årti om forståelse af, hvordan DNA og proteiner bidrager til genregulering, er relativt mindre kendt om post-transkriptionel regulering af genekspression. RNA bærer information i både sin lineære rækkefølge og i dens sekundære og tertiære struktur 1 . Dens evne til at basere par med sig selv og med andre er vigtigt for dets funktion in vivo . Nylige fremskridt i RNA sekundære strukturundersøgelser med høj gennemstrømning har givet værdifulde indblik i placeringen af dobbelt- og enkeltstrengede regioner i transkriptomet 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer information om parring samspillet partnere mangler stadig stort set. For at bestemme hvilken RNA-sekvens der interagerer med en anden RNA-region i transkriptomet, har vi brug for globale parvisoplysninger.
Kortlægning af parvise RNA-interaktioner på global, upartisk måde har traditionelt været en stor udfordring. Mens tidligere fremgangsmåder, såsom CLASH 9 , hiCLIP 10 og RAP 11 , anvendes til at identificere RNA-interaktioner på stor skala, kartlægger disse teknikker typisk RNA-baseparring for en delmængde af RNA'er, der enten interagerer med et bestemt protein eller RNA-species. Den seneste udvikling i undersøgelsen af globale RNA-interaktioner indbefatter metoden RPL 12 , som ikke stabiliserer RNA-interaktioner in vivo og derfor kun kan opfange en delmængde af in vivo interaktioner. For at overvinde disse udfordringer udviklede vi og andre genomgående, upartiske strategier til maP RNA-interaktomer in vivo ved anvendelse af modificerede versioner af tværbindingspsoralen 13 , 14 , 15 . I denne protokol beskriver vi detaljerne for udførelse af S- ækvurdering af P- sorbundet tværbundet, L igated og S valgte H ybrids (SPLASH), der anvender biotinyleret psoralen til tværbindingsbaseparations-RNA'er in vivo efterfulgt af nærhedsligation og høj gennemstrømningssekvensering til Identificere RNA baseparingspartnere genom-bred ( figur 1 ) 15 .
I dette manuskript beskriver vi trinene til udførelse af SPLASH ved hjælp af dyrkede adhærente celler, i dette tilfælde HeLa-celler. Den samme protokol kan let tilpasses til suspensionspattedyrceller og til gær- og bakterieceller. Kort sagt behandles HeLa-celler med biotinyleret psoralen og bestråles ved 365 nm for at krydsbinde interaktive RNA basepar in vivo.. RNA'erne ekstraheres derefter fra cellerne, fragmenteret og beriget for tværbindingsregioner under anvendelse af streptavidinperler. Interagerende RNA-fragmenter ligeres derefter sammen ved anvendelse af nærhedsligation og fremstilles i et cDNA-bibliotek til dyb sekventering. Efter sekventering kortlægges de kimære RNA'er på transcriptomet / genomet for at identificere de RNA-interagerende regioner, som er parret til hinanden. Vi har med succes udnyttet SPLASH til at identificere tusindvis af RNA-interaktioner in vivo i gær og forskellige humane celler, herunder intramolekylær og intermolekylær RNA-baseparring i forskellige klasser af RNA'er, såsom snoRNA'er, lncRNA'er og mRNA'er, for at se på strukturelle organisations- og interaktionsmønstre Af RNA'er i cellen.
Her beskriver vi i detaljer den eksperimentelle og beregningsmæssige arbejdsgang for SPLASH, en metode, der giver os mulighed for at identificere parvise RNA-interaktioner på en genomgående måde. Vi har med succes udnyttet SPLASH i bakterielle, gær- og menneskelige kulturer og forudser, at strategien kan anvendes bredt til forskellige organismer under forskellige cellulære tilstande. Et af de kritiske trin i protokollen er at starte med mindst 20 μg tværbundet RNA for at have tilstrækkeligt materiale til nedstr…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer af Wan lab og Nagarajan lab for informative diskussioner. N.Nagarajan understøttes af finansiering fra A * STAR. Y.Wan understøttes af finansiering fra A * STAR og Society i Science-Branco Weiss Fellowship.
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
20 % SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
List of software required | |||
FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
Buffer composition | |||
Elution buffer: | |||
0.3 M sodium acetate | |||
Lysis Buffer: | |||
50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
10 mM EDTA | |||
1% SDS | |||
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
Proteinase K Buffer | |||
100 mM NaCl | |||
10 mM TrisCl pH 7.0 | |||
1 mM EDTA | |||
0.5% SDS | |||
Hybridization Buffer | |||
750 mM NaCl | |||
1% SDS | |||
50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
1 mM EDTA | |||
15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
Always add Superase-in fresh before use | |||
2x SSC Wash Buffer | |||
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
0.5% SDS | |||
2X RNA fragmentation buffer | |||
18mM MgCl2 | |||
450mM KCl | |||
300mM Tris-CL pH 8.3 | |||
2x RNA loading Dye: | |||
95% Formamide | |||
0.02% SDS | |||
0.02% bromophenol blue | |||
0.01% Xylene Cyanol | |||
1mM EDTA | |||
3' RNA adapter sequence | 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC | ||
RT primer sequence | AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |