Summary

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Published: May 24, 2017
doi:

Summary

כאן, אנו מפרטים את השיטה של S equen של P סורלן crosslinked, L igated, ו S נבחר H ybrids (SPLASH), אשר מאפשר מיפוי גנום רחב של interramolecular ו intermolecular RNA-RNA אינטראקציות in vivo . SPLASH ניתן ליישם את המחקר RNA אינטראקציות של אורגניזמים כולל שמרים, חיידקים ובני אדם.

Abstract

לדעת איך RNAs אינטראקציה עם עצמם ועם אחרים היא המפתח להבנת RNA הרגולציה הגן בתא. בעוד דוגמאות של אינטראקציות RNA-RNA כגון אינטראקציות microRNA-mRNA הוכחו כדי להסדיר ביטוי גנים, את מלוא היקף שבו אינטראקציות RNA להתרחש בתא עדיין לא ידוע. שיטות קודמות כדי לחקור אינטראקציות RNA התמקדו בעיקר על תת קבוצות של RNAs כי הם אינטראקציה עם חלבון מסוים או מינים RNA. כאן, אנו מפרטים שיטה בשם S equencing של P סורלן crosslinked, L igated, ו S נבחר H ybrids (SPLASH) המאפשר לכידת גנום רחב של אינטראקציות רנ"א in vivo בצורה משוחדת. SPLASH מנצל ב crosslinking vivo , קשירת הקרבה, רצף התפוקה גבוהה לזהות intramolecular ו intermolecular RNA בסיס זוגות שותפים ברחבי העולם. SPLASH ניתן ליישם אורגניזמים שונים, כולל חיידקים, שמרים ותאי אדם, כמו גםS תנאים מגוונים הסלולר כדי להקל על ההבנה של הדינמיקה של ארגון רנ"א תחת הקשרים הסלולר מגוונים. כל פרוטוקול SPLASH ניסיוני לוקח בערך 5 ימים כדי להשלים את העבודה חישובית לוקח בערך 7 ימים כדי להשלים.

Introduction

ללמוד כיצד מקרומולקולות לקפל וליצור אינטראקציה זה עם זה הוא המפתח להבנת רגולציה גנטית בתא. בעוד שמאמצים רבים התמקדו בעשור האחרון בהבנת האופן שבו דנ"א וחלבונים תורמים לרגולציה גנטית, ידוע פחות פחות על תקנה פוסט-תעתיקית של ביטוי גנים. RNA נושאת מידע הן ברצף הליניארי שלה והן במבנה המשני שלה ושלישוני 1 . היכולת שלה בסיס זוג עם עצמו ועם אחרים חשוב לתפקידה in vivo . ההתקדמות האחרונה בתפוקה גבוהה RNA מבנה משני בדיקה חיישן סיפק תובנות ערך למיקומים של אזורים בודדים כפול בודד transcriptome 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , Howeמידע על השותפים לאינטראקציה של זוגות עדיין חסר במידה רבה. כדי לקבוע איזה רצף RNA הוא אינטראקציה עם אזור RNA אחר transcriptome, אנחנו צריכים מידע גלובלי זוג חכם.

מיפוי זוגי אינטראקציות RNA חכם באופן גלובלי, ללא דעות מוקדמות באופן מסורתי היה אתגר גדול. בעוד גישות קודמות, כגון CLASH 9 , hiCLIP 10 ו RAP 11 , משמשות לזיהוי אינטראקציות רנ"א בקנה מידה גדול, טכניקות אלה בדרך כלל מפתבות צימוד בסיס RNA עבור קבוצת משנה של RNAs או אינטראקציה עם חלבון מסוים או מינים RNA. ההתפתחויות האחרונות בחקר אינטראקציות RNA העולמי כוללים את השיטה RPL 12 , אשר אינו מייצב אינטראקציות RNA in vivo ולכן יכול רק ללכוד תת קבוצה של אינטראקציות vivo . כדי להתגבר על האתגרים הללו, אנו ואחרים פיתחנו אסטרטגיות גנומיות רחבות ובלתי מוטותP רנ"א אינטראקציה ב vivo , באמצעות גרסאות שונה של crosslinker psoralen 13 , 14 , 15 . בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הפרטים עבור ביצוע S S השוואות של Sorsen crosslinked, L igated, ו S נבחר H ybrids (SPLASH), אשר מנצל psoralen biotinylated כדי crosslink בסיס זיווג RNAs ב vivo , ואחריו קשירת הקרבה ותפוקה גבוהה התפוקה כדי לזהות RNA בסיס זיווג שותפים גנום רחב ( איור 1 ) 15 .

בכתב יד זה, אנו מתארים את השלבים לביצוע SPLASH באמצעות תאים חסיד תרבותי, במקרה זה תאים הלה. פרוטוקול זהה ניתן להתאים בקלות תאים יונקים ההשעיה כדי שמרים תאים חיידקים. בקצרה, תאים Hella מטופלים עם psoralen biotinylated ו מוקרן ב 365 ננומטר כדי crosslink אינטראקציות RNA זוגות זוג in vivo. RNAs מחולצים מכן מן התאים, מקוטע מועשר על אזורים crosslinking באמצעות חרוזים streptavidin. אינטראקציה שברי RNA אז ligated יחד באמצעות קשירת הקרבה והפך לספריית cDNA עבור רצף עמוק. על רצף, RNAs chimeric ממופים על transcriptome / הגנום כדי לזהות את אזורי RNA אינטראקציה מותאמים זה לזה. יש לנו בהצלחה לנצל SPLASH לזהות אלפי אינטראקציות רנ"א in vivo בשמרים ותאים אנושיים שונים, כולל intramolecular ו intermolecular RNA בסיס צימוד בשיעורים שונים של RNAs, כגון snoRNAs, lncRNAs ו mRNAs, להציץ לתוך הארגון המבני דפוסי אינטראקציה של RNAs בתא.

Protocol

1. טיפול בתאים Hella עם Psoralen Psoralen Biotinated ו RNA התרבות תאים Hella ב Dulbecco שונה של הנשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין סטרפטומיצין (PS) בצלחת 10 ס"מ. לשטוף את התאים הלה פעמיים עם 5 מ&q…

Representative Results

איור 1 מתאר את הסכימה של זרימת העבודה SPLASH. על תוספת של psoralen biotinylated בנוכחות 0.01% digitonin, ו crosslinking UV, RNA סך מופק מהתאים ואת כתם נקודה מבוצעת על מנת להבטיח crosslinking של biotinylated כדי RNA קרה ביעילות ( איור 2 ). אנו משתמשים biiginylated בסיס או…

Discussion

כאן, אנו מתארים בפירוט את זרימת עבודה ניסיונית וחישובית עבור SPLASH, שיטה המאפשרת לנו לזהות אינטראקציות RNA חכם חכמים בצורה גנום רחב. אנו ניצלו בהצלחה SPLASH בתרבית חיידקים, שמרים ותרבויות האדם צופים כי האסטרטגיה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על אורגניזמים שונים תחת מדינות …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לחברי המעבדה וואן ומעבדת Nagarajan לדיונים אינפורמטיביים. N.Nagarajan נתמך על ידי מימון מ * כוכב. Y.Wan נתמך על ידי מימון מ- A * סטאר וחברה במדע- Branco Weiss Fellowship.

Materials

1 Kb Plus DNA Ladder Life Technologies Holdings Pte Ltd 10787026 DNA ladder
10 bp DNA ladder Life Technologies Holdings Pte Ltd 10821-015 DNA ladder
20 % SDS solution First BASE BUF-2052-1L  
20x SSC First BASE BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution First BASE BUF-1151-1L-pH5.2   Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 Bio-Rad 1610145 TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit Life Technologies Holdings Pte Ltd AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade   Promega V3131  TBE Urea gel component
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Chloroform Merck 1.02445.1000 RNA extraction
Single strand DNA ligase Epicentre CL9025K CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters Sigma-Aldrich CLS8160-96EA Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE Sigma-Aldrich D5628-1G For cell treatment
Dark Reader Transilluminator  Clare Chemical Research Dark Reader DR89X Transilluminator Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6X) Life Technologies Holdings Pte Ltd R0611 Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium Pan BioTech P04-03500 For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads Life Technologies Holdings Pte Ltd 65002 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 
Magnetic stand for 15ml tubes Life Technologies Holdings Pte Ltd 12301D DynaMag-15
Magnetic stand for 15ml tubes Life Technologies Holdings Pte Ltd  12321D DynaMag-2
ThermoMixer Eppendorf 5382 000.015 Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen Life Technologies Holdings Pte Ltd 29986 EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL  Hitachi F8T5/BL  365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum Life Technologies Holdings Pte Ltd 10270106   Components of Hela medium
Formamide Promega H5052   Component in hybridization buffer
G8T5 Sankyo-Denki G8T5 254 nm UV bulb
Glycogen  Life Technologies Holdings Pte Ltd 10814010 Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop Life Technologies Holdings Pte Ltd Nanodrop 2000 Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water  First BASE BUF-1180-500ml  
Penicillin Streptomycin   Life Technologies Holdings Pte Ltd 15140122   Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x) Life Technologies Holdings Pte Ltd F531L  Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1 New England Biolabs E7335L  PCR primers
DNA Gel Extraction Kit QIAgen 28106 QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit Life Technologies Holdings Pte Ltd Q32854 Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit Qiagen 74106 RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor Life Technologies Holdings Pte Ltd AM2696 SUPERase In
Reverse transcriptase Life Technologies Holdings Pte Ltd 18080400 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain Life Technologies Holdings Pte Ltd S11494 SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs M0204L Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ New England Biolabs M0373L Enzyme for adaptor ligation
Temed Bio-Rad 1610801 TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform Life Technologies Holdings Pte Ltd 15596018 TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea First BASE BIO-2070-5kg  
UV crosslinker Stratagene 400072 UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator UVP 95-0417-01 For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF Sigma-Aldrich X4126-10G
DNA cleanup it Zymo Research  D4004 Zymo DNA concentrator-5 
List of software required
FastQC software 0.11.4 http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software 1.0.7 https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software 0.7.12 http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software 1.2.1 http://www.htslib.org/
PULLSEQ software 1.0.2 https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software 2.5.0c https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script PYTHON 2.7.11 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script PYTHON 2.7.11 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script AWK GNU 4.1.2 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer: 
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer 
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2X RNA fragmentation buffer
18mM MgCl2
450mM KCl
300mM Tris-CL pH 8.3
2x RNA loading Dye:
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1mM EDTA 
3' RNA adapter sequence 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG

References

  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
  5. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
  6. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
  7. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
  8. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  9. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  10. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  11. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  12. Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
  13. Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
  14. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O’Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
  15. Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

Play Video

Cite This Article
Aw, J. G. A., Shen, Y., Nagarajan, N., Wan, Y. Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen. J. Vis. Exp. (123), e55255, doi:10.3791/55255 (2017).

View Video