Här specificerar vi metoden för S- ekventering av P- sorolen tvärbunden, L igaterad och S väljs H ybrids (SPLASH), som möjliggör genomgående kartläggning av intramolekylära och intermolekylära RNA-RNA-interaktioner in vivo . SPLASH kan appliceras för att studera RNA-interaktomer av organismer inklusive jäst, bakterier och människor.
Att veta hur RNA interagerar med sig själva och med andra är nyckeln till förståelsen av RNA-baserad genreglering i cellen. Även om exempel på RNA-RNA-interaktioner såsom mikroRNA-mRNA-interaktioner har visat sig reglera genuttryck, är den fullständiga utsträckning som RNA-interaktioner uppträder i cellen fortfarande okänd. Tidigare metoder för att studera RNA-interaktioner har huvudsakligen fokuserat på delmängder av RNA som interagerar med ett visst protein eller RNA-art. Här specificerar vi en metod som heter S- ekventering av P soralen tvärbunden, L igaterad och S valda H ybrids (SPLASH) som möjliggör genomgripande infångning av RNA-interaktioner in vivo på ett opartiskt sätt. SPLASH använder in vivo tvärbindning, närhetligering och hög genomströmningssekvensering för att identifiera intramolekylära och intermolekylära RNA-basparparametrar globalt. SPLASH kan appliceras på olika organismer inklusive bakterier, jäst och mänskliga celler, liksom aS olika cellulära förhållanden för att underlätta förståelsen av RNA-organisationens dynamik under olika cellulära sammanhang. Hela experimentella SPLASH-protokollet tar ungefär 5 dagar att slutföra och beräkningsflödet tar ungefär 7 dagar att slutföra.
Att studera hur makromolekyler viks och interagerar med varandra är nyckeln till att förstå genreglering i cellen. Medan mycket arbete har fokuserats under det senaste decenniet om att förstå hur DNA och proteiner bidrar till genreglering, är relativt mindre känt om post-transkriptionell reglering av genuttryck. RNA bär information i både sin linjära sekvens och i dess sekundära och tertiära struktur 1 . Dess förmåga att basera paret med sig själv och med andra är viktigt för sin funktion in vivo . Nyliga framsteg inom RNA-sekundärstrukturundersökning med hög genomströmning har givit värdefulla insikter i placeringen av dubbel- och enkelsträngade regioner i transkriptomen 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer information om parningsparametrarna saknas fortfarande i stor utsträckning. För att bestämma vilken RNA-sekvens som interagerar med en annan RNA-region i transkriptomen behöver vi global parvis information.
Kartläggning av parvisa RNA-interaktioner på ett globalt, opartiskt sätt har traditionellt varit en stor utmaning. Medan tidigare tillvägagångssätt, såsom CLASH 9 , hiCLIP 10 och RAP 11 , används för att identifiera RNA-interaktioner i stor skala, kartlägger dessa tekniker typiskt RNA-basparning för en delmängd av RNA som antingen interagerar med ett visst protein eller RNA-species. Den senaste utvecklingen i studier av globala RNA-interaktioner inkluderar metoden RPL 12 , som inte stabiliserar RNA-interaktioner in vivo och kan därför endast fånga en delmängd av in vivo- interaktioner. För att övervinna dessa utmaningar utvecklade vi och andra genomgående, opartiska strategier för maP RNA-interaktomer in vivo , med användning av modifierade versioner av tvärbindningspsoralen 13 , 14 , 15 . I detta protokoll beskriver vi detaljerna för utförande av S- ekventering av P- soralt tvärbunden, L- igaterad och S valda H ybrids (SPLASH), vilken utnyttjar biotinylerad psoralen för att tvärbinda basparrings-RNA in vivo följt av närliggande ligering och hög genomströmningssekvensering till Identifiera RNA-basparparametrar genomgående ( Figur 1 ) 15 .
I det här manuskriptet beskriver vi stegen för att utföra SPLASH med hjälp av odlade vidhäftande celler, i detta fall HeLa-celler. Samma protokoll kan lätt anpassas till suspensionsdäggdjursceller och till jäst- och bakterieceller. I korthet behandlas HeLa-celler med biotinylerad psoralen och bestrålas vid 365 nm för att tvärbinda interaktiva RNA-baspar in vivo. RNA: erna extraheras sedan från cellerna, fragmenteras och berikas för tvärbindningsregioner med användning av streptavidinpärlor. Interaktiva RNA-fragment ligeras sedan tillsammans med användning av närliggande ligering och gjordes i ett cDNA-bibliotek för djup sekventering. Vid sekvensering mappas de chimära RNA på transcriptomen / genomet för att identifiera de RNA-interagerande regionerna som är parade med varandra. Vi har framgångsrikt utnyttjat SPLASH för att identifiera tusentals RNA-interaktioner in vivo i jäst och olika humana celler, inklusive intramolekylär och intermolekylär RNA-basparning i olika klasser av RNA, såsom snoRNA, lncRNA och mRNA, för att glimta in i strukturorganisationen och interaktionsmönstren Av RNA i cellen.
Här beskriver vi i detalj det experimentella och beräknade arbetsflödet för SPLASH, en metod som gör det möjligt för oss att identifiera parvisa RNA-interaktioner på ett genomgående sätt. Vi har framgångsrikt utnyttjat SPLASH i bakteriella, jäst- och mänskliga kulturer och förutse att strategin kan tillämpas allmänt på olika organismer under olika cellulära tillstånd. Ett av de kritiska stegen i protokollet är att börja med minst 20 | jg tvärbunden RNA för att ha tillräckligt material för nedstr…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmarna av Wan Lab och Nagarajan Lab för informativa diskussioner. N.Nagarajan stöds av finansiering från A * STAR. Y.Wan stöds av finansiering från A * STAR och Society i Science-Branco Weiss Fellowship.
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
20 % SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
List of software required | |||
FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
Buffer composition | |||
Elution buffer: | |||
0.3 M sodium acetate | |||
Lysis Buffer: | |||
50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
10 mM EDTA | |||
1% SDS | |||
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
Proteinase K Buffer | |||
100 mM NaCl | |||
10 mM TrisCl pH 7.0 | |||
1 mM EDTA | |||
0.5% SDS | |||
Hybridization Buffer | |||
750 mM NaCl | |||
1% SDS | |||
50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
1 mM EDTA | |||
15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
Always add Superase-in fresh before use | |||
2x SSC Wash Buffer | |||
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
0.5% SDS | |||
2X RNA fragmentation buffer | |||
18mM MgCl2 | |||
450mM KCl | |||
300mM Tris-CL pH 8.3 | |||
2x RNA loading Dye: | |||
95% Formamide | |||
0.02% SDS | |||
0.02% bromophenol blue | |||
0.01% Xylene Cyanol | |||
1mM EDTA | |||
3' RNA adapter sequence | 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC | ||
RT primer sequence | AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |