Summary
간 손상은 이종 세포 인구를 나타내는 전구 세포의 확장을 동반한다. 이 세포 구획의 소설 분류는 여러 부분 집합의 구별이 가능합니다. 여기에 설명 된 방법은 추가 분석 및 분석에 사용될 수있는 다양한 서브 세트의 고순도 분리 계측법 흐름을 도시한다.
Abstract
만성 간 손상 동안 전구 세포는 염증 세포의 침윤과 상피 세포 활성화의 모양을 수반 ductular 반응이라는 프로세스에 확장. 이러한 염증 반응 동안 전구 세포 인구는 대부분 조직 학적 분석이나 유동 세포 계측법 기반 기술에 의해 하나, 하나의 표면 마커를 사용하여 조사되었다. 그러나, 새로운 표면 마커가 간 전구 내에서 다양한 기능적으로 별개의 하위 집합을 식별 / 셀 구획 줄기. 여기에 제시된 방법은 분리 및 신규 표면 마커의 조합을 사용하여 선조 세포 계측법 분석 서브 세트의 상세한 흐름을 설명한다. 또한, 다양한 전구 세포 서브셋 고순도 자기 자동화 사용하여 FACS 정렬 기반의 방법으로 분리 될 수 있는지 보여준다. 중요한 간 새롭고 단순화 분해 효소는 높은 생존력 이러한 희귀 세포군의 분리를 허용즉 기존의 방법에 비해 우수하다. 이는 시험관 내에서 상기 전구 세포 연구 또는 유전자 발현 프로파일을 분석하는 고품질의 RNA를 분리하는 데 특히 적합하다.
Introduction
간 재생 주로 간세포의자가 재생산 능력과 관련된다. 그럼에도 불구하고, 만성 간 손상은 간세포 및 담관 1, 2, 3, 4로 분화 할 수있는 능력과 관련이있는 전구 세포 활성화 및 확장으로 발생한다. 만성 상처 중에 간세포 증식 효과가없는 경우가 있기 때문 특히 적합하다. 전구 세포를 표적 다중 유전자 추적 연구에도 불구하고, 간 재생에서의 역할은 5, 6, 7, 8 논란이 남아있다. 또한, 전구 세포의 활성화는 부상 9시 자신의 정확한 역할에 대한 질문을 제기 간에서 증가 섬유 성 반응에 연결되어 있습니다10.
선조 세포 구획의 이질적인 성질 긴 미세 절제 또는 세포 분류 기반의 방법 (1) (11)를 사용하여 단일 표면 마커를 발현하는 전구 세포를 격리 유전자 발현의 연구에 의해 제안되고있다. 실제로, 최근 새로운 표면 마커 조합하여 gp38 (podoplanin)는 명백하게 다양한 서브 세트들 (12) 선조 세포의 이전 단일 마커 링크. 중요한 것은, 이러한 서브 세트는 그들의 표면 마커의 발현에 차이가없는 아니라 부상 12시 기능적 변화를 나타냈다.
여러 동물 모델은 전구 세포의 활성화, 간 재생을 조사하기 위해 사용되어왔다. 다양한 부상 유형은 전구 세포 (12)의 하위 집합을 서로 다른의 활성화를 촉진 것으로 보인다. 이는 pH를 설명 할 수있을인간 4에서 관찰 ductular 반응 enotypic 발산. 따라서, 전구 세포의 표현형 복잡한 기능적 분석은 부상 역할 및 간 질환의 ductular 반응의 참된 의미를 이해하는 피봇된다.
표면 마커 조합 외에, 세포 격리 프로토콜의 중요한 차이는 또한 이전의 연구 (2)에 기초하여 결론을 복잡. 연구의 상당한 양을 크게들이 분리 프로토콜 상이한 전구 세포 (예, 간 분리 (효소 결합 프로세스의 기간), 밀도, 매질 및 원심 분리 속도)의 역할이 해결. 최적화 된 분리 기술, 희귀 세포 집단에 대한 더 나은 가능성을 제공하고 일부 조성물의 반사가 개발하고 최근 12 게시되었습니다. 이 문서의 목적은 더 DET을 제공하는 것입니다이 간세포 분리 절차 및 일부 분석 ailed 프로토콜 기술의 적절한 재생을 허용한다. 또한, 프로토콜은 새로운 프로토콜과 비교하여 차이를 설명하기 이전의 분리 방법과의 비교를 포함한다.
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Protocol
모든 실험 절차 부르크 대학 의료 센터의 윤리와 동물 관리위원회의 승인을 실시 하였다.
재료 및 버퍼의 1. 준비
- 갓 세균 오염을 방지하기 위해 살균 성분 및 층류 후드를 사용하여 간 소화에 필요한 모든 버퍼를 준비한다.
- RPMI 배지 49.5 mL의 소 태아 혈청 0.5 mL를 혼합하여 수집 버퍼 (CB)를 준비 (FBS를 낮은 독소는 열 불 활성화)를 1 % (v / v)의 용액을 달성하기 위해. 추가 사용까지 얼음에 솔루션을 저장합니다.
참고 : 약 25 CB mL를 하나의 전체 간을 소화 할 필요가있다. - 하기 성분을 사용하여 소화 버퍼 (DB)를 준비 : RPMI 배지 1 % (V / V) FBS (낮은 독소는, 열 불 활성화), 콜라게나 제 P를 (0.2 ㎎ / ㎖)의 DNase-I (0.1 ㎎ / ㎖) 및 디스 파제 (0.8 ㎎ / ㎖).
참고 : 약 25 DB mL를 하나의 전체 간을 소화 할 필요가있다. t의 DB를 사전 따뜻하게사용하기 전에 그는 37 ° C의 물을 욕조. - 행크스 평형 염 용액에 도착하면 효소 (HBSS; collagense의 P 및 디스 파제) 재구성하거나에서의 DNase를-I을 완충액 (50 % (v / v) 글리세롤, 1 mM의 MgCl 2, 20 mM 트리스 - 염산, pH를 7.5) 그것을 나누어지는 및 -20 ° C에서 보관합니다. 의 DNase를-I는 저장 4 ° C에서 버퍼 및 2 개월 이내에 사용하십시오.
간 단일 세포 현탁액 2. 준비
- 지역 윤리 및 동물 관리위원회에 따라 자궁 전위에 의해 처리되지 않은 야생형 쥐를 안락사.
- 해부 보드에 마우스를 넣고 70 % 에탄올로 모피 젖은. 가위를 사용하여 사지를 향해 Y 절개 다음에 피부의 중간 선 절개로 복부를 엽니 다. 가위를 사용하여 흉골에 복막을 엽니 다. 간을 밝히기 위해, 면봉을 사용하여 우측으로 부드럽게 부위를 변위.
- 가위와 집게의 도움으로 간 로브를 제거,뒤에 담낭을 떠나, 결합 조직과 오염을 방지. 간을 달아 HBSS를 포함하는 페트리 접시에 얼음에 놓습니다.
- 건조 페트리 접시에 간 로브를 놓고 메스를 사용하여 균일 한 큐브로 약 2mm 측면을 간 조직을 잘라. 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 조각을 전송합니다.
- 간 조각을 포함하는 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 DB 2.5 mL로 추가하고 소화 과정을 시작하기 위해 37 ° C의 물을 욕조에 배치 (건강한 간은 60 ~ 70 분을 소요하고, 간경변증, 간은 80 ~ 90 분 소요 ).
주 : 하나의 전체 간을 절단하고있는 경우, 간이 좋은 세포 생존을 위해 두 개의 15 mL의 원추형 원심 분리 튜브로 분리되어야한다. - 릴리스 간 세포를 수집하는 새로운 15 mL의 원추형 원심 분리 튜브를 준비한다. 상기 튜브의 상단에 폴리 아미드 100 ㎛의 메쉬 필터를 놓고 CB 800 μL와 메쉬 젖은. 얼음에 원뿔 원심 분리기 튜브를 놓습니다.
- 샘 믹스PLES 간 조각을 함유하는 15 mL의 원추형 원심 분리 튜브를 흔들어 소화 처리를 지원하기 위해도 5 및 10 분 후에 37 ° C의 물 중탕한다.
- 15 분 분해 시작 후 가볍게 쉽게 통과 간 편 있도록 절단 끝 1000-μL 피펫을 사용하여 간 조각을 혼합한다. 다시 물을 욕조에 튜브를 놓고 조각 2 분 동안 정착 할 수 있습니다.
- (통상적으로 700 μL 배)를 파종 세포를 함유하는 상등액을 제거하고 260 단계에서 제조 된 튜브에 추가. DB와 제거 된 상층 액 (2 배 700 μL)를 교체하고 다시 37 ° C의 물을 욕조에 넣습니다.
- 약 60-70 분은 소화의 시작이 경과 할 때까지 (전형적으로 30, 40, 50, 55 및 60 분) 단계 2.8에 기재된 절차를 반복한다. 이후 40 분에서, 나머지 간 조각은 포경 1,000 μL 피펫 팁을 통과 할 정도로 작아야한다.
참고 : 건강한 간 dige입니다섬유 성 간은 일반적으로 80 ~ 90 분을 필요로하면서, 60 ~ 70 분 이내에 완전히 STED. 이 시점으로, 간 조직의 간 조각을 포함 원추형 15 mL의 원심 분리 튜브에 보이지 않아야하고, 모든 방출 셀은 단계 2.6에서 제조 된 튜브 내로 이송한다. - 소화 과정의 끝에, 세포를 수집하고 180 XG에서 8 분, 39 ° C 그들을 원심 분리 (감소하여 가속 / 감속 (4) / 2).
- 용해 완충액 암모늄, 염화 칼륨 1 ㎖ (ACK)에서 세포 펠렛을 재현 탁하고, 적혈구를 용해시키기 위하여 실온에서 1 분 정도 배양한다. CB 5 ㎖를 첨가하여 반응을 정지하고 180 XG에서 8 분, 39 ° C에 대해 세포를 원심 분리 (감소하여 가속 / 감속 (4) / 2). CB의 4 mL에 세포를 재현 탁하고 얼음에 저장합니다. 3 단계에서 설명 된 바와 같이, 세포를 계산.
주 : 세포 펠렛 느슨한이므로 상등액을 경사 분리되는 대신 얻어 피펫 팅한다.유동 세포 계측법을 사용하여 세포 수의 3 결정
참고 : 이상적으로, 아래에서 설명하는 유동 세포 계측법 기반의 셀 정량화 대신 고전 노이 바 우어 챔버 기반 방법을 제안 셀 수, 자동 세포 계수기 또는를 결정하십시오. 2 단계에서 설명한 간 단일 세포 현탁액이 크게 다른 크기와 입도와 실질과 비 실질 세포 (NPC)가 포함되어 있습니다. 유동 세포 계측법 사용의 NPC의 게이팅 기능은 앞으로 산란, 측면 산란 (FSC-SSC) 특성과 함께 세포 파편의 적절한 배제는 설명 프로토콜 (12)의 성공을 보장합니다.
- 간 세포 현탁액 (20 μL)의 분취 량을 준비하고 인산 완충 식염수 (PBS)와 프로피 디움 요오드 6 μL 174 μL를 추가 (PI; 최종 농도 0.375 μg의 / ㎖). 세포의 정량을 허용 계산 구슬을 추가합니다.
- S에 게이트SC-A-FSC-A 파편을 방지하고 더 FSC-H 및 FCS-A를 사용하는 이중선을 제외합니다.
참고 : 그것은도 2에 도시 게이팅 전략을 따르는 것이 중요합니다. - 문 밖으로 PI 양성 죽은 세포는 귀하의 샘플에서 30 μL를 측정하고, 이벤트를 기록합니다. 셀 수를 계산하는 제조업체의 지침을 따르십시오.
참고 : 측정 유동 세포 계측법을위한 4 단계를 따라 자기 기반 전구 세포의 분리를 위해 5, 6 단계, 및 전구 개체군의 종류 유동 세포 계측법에 대해 7 단계를 반복합니다.
전구 하위 집합의 FOW 세포 계측법 분석에 대한 간 단일 세포 현탁액 4. 염색
항독소 복제 호스트 / 이소 주식 농도 [㎎ / ㎖] 노동 희석 CD64 X54-5 / 7.1 마우스의 IgG1, κ 0.5 1 : 100 CD16 / 32 93 쥐의 IgG2a, λ 0.5 1 : 100 CD45 30-F11 쥐의 IgG2b, κ 0.2 1 : 200 CD31 MEC13.3 쥐의 IgG2a, κ 0.5 1 : 200 ASGPR1 클론 염소 IgG를 0.2 1 : 100 Podoplanin 2001년 1월 8일 시리아 햄스터의 IgG 0.2 1 : 1,400 Podoplanin 2001년 1월 8일 시리아 햄스터의 IgG 0.5 1 : 1,400 CD133 Mb9-3G8 쥐의 IgG1 0.03 3 μL CD133 315-2C11 쥐 IGG2A, λ 0.5 1 : 100 CD34 RAM34 쥐의 IgG2a, κ 0.5 1 : 100 CD90.2 53-2,1 쥐 IgG2, κ 0.5 1 : 800 CD157 BP-3 마우스의 IgG2b, κ 0.2 1 : 600 는 EpCAM G8.8 쥐의 IgG2a, κ 0.2 1 : 100 무서-1 D7 쥐의 IgG2a, κ 0.03 10 μL 마우스의 IgG2b, κ MPC-11 0.2 쥐의 IgG1 RTK2071 0.2 쥐의 IgG2b, κ RTK4530 0.2 쥐의 IgG2a, κ RTK2758 0.5 쥐의 IgG2a, κ RTK2758 0.2 시리아 햄스터의 IgG SHG-1 0.2 시리아 햄스터의 IgG SHG-1 0.5 보통 염소 IgG를 제어 클론 염소 IgG를 1 당나귀 방지 염소 IgG의 당나귀의 IgG 이 1 : 800 스트렙 타비 딘 1 1 : 400 1 번 테이블.
항독소 1 이 삼 4 (5) CD45 APC / Cy7 쥐의 IgG2b, κ
0.5 μL+ + + + CD31 비오틴 + 쥐의 IgG2a, κ
0.5 μL+ + + ASGPR1 정제 + + 보통 염소 IgG를 제어
0.2 μL+ + Podoplanin APC + + + 시리아 햄스터의 IgG
1:14 희석 1 μL+ CD133 PE + + </ TD> + + 쥐의 IgG1
0.45 μL당나귀 방지 염소
알렉사 플 루어 488+ + + + + 스트렙 타비 딘
알렉사 플 루어 (405)+ + + + + 표 2.
- 단계 3에서 설명한 바와 같이 결정된 2.5 × 105 세포를 함유하는 반응 튜브 (1.5 mL)에 단계 2.11에서 세포 현탁액의 분취 량을 놓는다.
- 3 300 XG에 분, 4 ° C는 마이크로 원심를 사용하기위한 세포를 원심 분리기.
주 :이 시점에서 진공 펌프를 조심스럽게 상층 액을 제거하기 위해 이용 될 수있다. - 된 Fc 블록 믹스 세포 펠렛을 재현 탁하고 얼음에 5 분 정도 배양한다. 얼룩 당 50 μL의 총 부피 Fc와 블록 믹스를 준비한다. 1 추가된 FcR 블록킹 시약 0 μL, 정제 된 항 CD64 1 μL (1 : 100 0.5 μg의 / 염색) 및 염색 완충액 40 μL (ST 완충액 : HBSS 1 % (V / V) FBS 및 0.01 % 얼룩 당 아 지드 화 나트륨).
주 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이다. 이러한 니트릴 장갑, 실험실 코트, 그리고 얼굴에 마스크와 같은 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다. - 세포에 혼합 염색의 50 μL를 추가 (세포의 총 부피는 이제 100 μL입니다) 및 항체 믹스와 세포, 빛으로부터 보호 얼음에 20 분 동안 품어.
- 얼룩 당 50 μL의 총 부피 항체 혼합물을 준비한다. , CD31 (0.5 μL, 1 : 200; 0.25 μg의 / 얼룩), ASGPR1 (1 μL : CD45 (; 200 0.1 μg의 / 얼룩 1 0.5 μL :) 50 μL ST의 버퍼를 들어, 기본 염색에 대한 다음과 같은 복합 항체를 추가 1 : 100을 0.2 μg의 / 얼룩), podoplanin (1 1시 14분 희석 μL 1 : 1,400 최종 희석, 0.014 μg의 / 얼룩) 및 CD133 (3 μL, 0.09 μg의 / 얼룩).
참고 : 표1 항체 클론 및 기본 얼룩과 다양한 부분 집합의 추가 표면 마커에 이용 희석을 요약 한 것입니다. 표 2에 도시 된 바와 같이, 대응하는 아이소 타입 컨트롤 및 / 또는 형광 뺀 제어 (FMOs)을 함유하는 항체 혼합물이 또 다른 세포 현탁액을 준비한다. - 당나귀 방지 염소 IgG를 0.125 μL (1을 포함하는 이차 항체 믹스 100 μL의 세포를 각 샘플에 400 μL ST 버퍼의 추가 원심 분리기 세포를 4 분 동안 300 XG에 4 ° C.Discard 뜨는 및 재현 탁 : 800 0.25 μg의 / 얼룩) 및 형광 접합 된 스트렙 타비 딘 (1 0.25 μL : 400; 0.25 μg의 / 얼룩) ST 버퍼 100 μL있다.
- 빛과 얼음에 20 분의 항체 믹스로 보호하면서 세포를 품어. 각 샘플에 400 μL ST의 버퍼를 추가하고 300 XG에 4 분, 4 ° C를위한 세포를 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 ST 버프 300 μL의 세포를 재현 탁어 0.25 μg의 / ML의 PI를 포함.
주 : 선조 세포의 세포 생존 능력은 시간에 따라 감소; 따라서, 가능한 한 빨리 신선한 샘플을 측정하기 위해 제안된다.
전구 세포의 5. 자기 마이크로 비드 기반 심화
- 새로운 15 mL의 원추형 원심 분리 튜브에 단계 3에 기재된 바와 같이 측정 된 세포 카운트에 기초하여 1.5 × 106 세포를 함유하는 간 단일 세포 현탁액의 분취 량을 전송.
- 180 XG에서 8 분, 39 ° C에 대해 세포를 원심 분리기 (환원 이용한 가속 / 감속 (4) / 2).
참고 : 일반적으로 하나의 건강 C57BL / 6 마우스 간 (또는 간 조직 1 g)을 세 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브로 분리해야합니다. - HBSS 0.5 % (v / v)의 소 혈청 알부민 (BSA)을 400 μL의 세포를 재현 탁 및 항 CD31 마이크로 비드 40 μL 및 항 CD45 마이크로 비드의 30 μL를 추가한다. 4 ° C에서 15 분 동안 세포를 품어.
참고 : t을 초과하지 마십시오분리의 순도가 현저하게 감소되는 바와 같이 그는 시간을 배양. - 세포에 5 ㎖의 HBSS의 0.5 % (v / v)의 BSA를 추가하고 180 XG에 8 분, 4 ° C 그들을 원심 분리 (사용 감소 가속 / 4 및 감속 / 2).
- 죽은 세포를 제거 구슬 100 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 실온에서 15 분 동안이를 부화. 한편에서, LS의 분리 컬럼을 준비하고 HBSS 0.5 %의 3 ㎖ (v / v)의 BSA와 함께 교정.
주 : 분리의 순도가 현저하게 감소되는 바와 같이, 배양 시간을 초과하지 마십시오. - 세포를 900 μL HBSS 0.5 % (v / v)의 BSA 추가 100 μm의 폴리 아미드 메쉬 필터를 사용하여 필터링하고, LS 분리 컬럼을 로딩.
참고 :로드 한 전체 간 한 LS 분리 컬럼 상. - 3 ㎖의 HBSS의 0.5 % (v / v)의 BSA와 함께 열 세 번 세척하고 흐름을 통해 수집합니다.
- 180 XG에 8 분, 4 ° C의 흐름을-을 통해 원심 분리기 (감소 전열을 사용하여leration / 4 및 감속 / 2).
- 버퍼 (RB) (PBS, 2 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)) 0.5 % 추가의 실험 절차에 따라 (v / v)의 BSA 또는 ST 버퍼를 포함하는 하나의 세척 세포 펠렛을 재현 탁.
여러 간을에서 결합 전구 세포 하위 집합 6. 자기 마이크로 비드 기반의 자동화 된 세포 정화
주 : 전구 세포 서브셋 희귀 세포 집단을 대표하므로, 다중 조합 간에서 세포는 종종 추가 실험을 위해 충분한 세포 수를 달성하기 위해 필요하다. 예를 들어, gp38 및 CD133 + + 세포 분리 같이 설명한다.
- CD133 + 전구 세포의 분리
- 3 단계에서 설명 된 바와 같이 단계 59 후에, 세포 수 및 RB 100 μL에 10 6 세포 (일반적으로 4-6 건강 간 샘플을 풀링)까지 재현 탁.
- 추가 안티 CD64 1 : 100, 항 CD16 / 32 (1) : 세포와 incub 1005 분 동안 얼음을 먹었다. 세포에 100 항 CD133 바이오틴 항체 및 추가 10 분 동안 얼음에 그들을 품어 : 1을 추가합니다.
- RB 5 mL를 추가하고 원심 분리기 8 분 180 XG에 4 ° C (사용 감소 가속 / 4 및 감속 / 2).
- RB 400 μL의 세포를 재현 탁 및 안티 - 비오틴 마이크로 비드의 10 μL를 추가합니다. 4 ℃에서 15 분 동안 샘플을 품어. 이 샘플의 순도를 감소시키기 때문에, 배양 시간을 초과하지 마십시오.
- RB 5 mL를 추가하고 원심 분리기 8 분 180 XG에 4 ° C (사용 감소 가속 / 4 및 감속 / 2). RB의 1 ml에 펠렛을 재현 탁.
- gp38 + 전구 세포의 분리
- 3 단계에서 설명 된 바와 같이 단계 59 후에, 세포 수 및 RB 100 μL에 10 6 세포 (일반적으로 4-6 건강 간 샘플을 풀링)까지 재현 탁.
- 추가 항 CD64 1 : 100 및 항 CD16 / 32 1 : 셀 100, 5 분간 얼음을 배양한다. 다음, 1을 추가 :100 항 gp38의 세포에 항체를 바이오틴과 추가로 10 분 동안 얼음을 배양한다.
- RB 5 mL를 추가하고 원심 분리기 8 분 180 XG에 4 ° C (사용 감소 가속 / 4 및 감속 / 2).
- RB 400 μL의 세포를 재현 탁 및 안티 - 비오틴 마이크로 비드의 5 μL를 추가합니다. 4 ℃에서 15 분 동안 샘플을 품어. 이 샘플의 순도를 감소시키기 때문에, 배양 시간을 초과하지 마십시오.
- RB 5 mL를 추가하고 원심 분리기 8 분 180 XG에 4 ° C (사용 감소 가속 / 4 및 감속 / 2).
- RB의 1 mL 중에 세포 펠렛을 재현 탁.
- 단계 6.1 또는 6.2 후 일반적인 단계
- 양극과 음극 분수를 수집하기 위해 두 개의 추가 빈 튜브 냉기 5 랙에 자기 표지 세포 현탁액을 포함하는 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브를 놓습니다. 분리기의 분리 플랫폼에서 냉각 선반을 두십시오.
- 긍정적 인 선택 프로그램을 사용하여각 샘플 (린스 옵션) 사이의 광범위한 세척 단계와 (Possel_d2).
참고 : 시료의 순도를 줄일 대신 자동 분리기의 세포의 열을 기반으로 수동 분리를 사용하여. - 180 XG에서 8 분, 39 ° C에 대한 양성 분획 원심 분리 수집 (하여 감소 가속 / 감속 (4) / 2).
- 추가의 실험 절차에 따라, 하나 또는 RB ST 버퍼 세포 펠렛을 재현 탁.
- 순도 확인을 위해, 세포의 분취 액을 4 단계에 기재된 바와 같이이를 얼룩.
7. 유동 세포 계측법 셀 정렬
주 : 전구 세포 서브셋 고순도 정렬은 후술되는 프로토콜에 의해 달성 될 수있다. 셀의 전체 수율은 단계 6에 기재된 유전자 발현 분석을위한 가장 좋은 것보다 훨씬 낮다.
매개 변수 환경 노즐 크기 85 μm의 회수 46.00-46.20 진폭 38.30-55.20 단계 0 드롭 지연 28.68-28.84 감쇠 떨어져서 첫 번째 드롭 284-297 대상 갭 (9) - (14) 압력 45 PSI 표 3.
- (단계 5에서 설명), 자기 계에서 농축 세포를 획득; 단계 3에서 설명한 바와 같이, 그들 카운트; 4 단계에서 설명 된 바와 같이, 전구 마커 (CD133, gp38), CD31, ASGPR1 및 CD45 그들을 얼룩.
- 페놀 레드 무료 Dulbec : 정렬 매체 (SM)를 준비0.5 % (v / v)의 BSA와 0.01 % (v / v)의 아 지드 화 나트륨을 포함하는 공동의 수정 이글의 중간 (DMEM). , SM에 염색 된 세포를 재현 탁 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브로 전송하고 얼음에 배치합니다.
주 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이다. 이러한 니트릴 장갑, 실험실 코트, 그리고 얼굴에 마스크와 같은 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다. 정렬 세포 기능 분석에 사용하는 경우 아 지드 화 나트륨을 사용하지 마십시오. - 세포 분리에 사용되는 정렬의 유형에 해당하는 소프트웨어를 사용합니다. 소프트웨어를 열고 정렬 매개 변수 및 기계 사양을 설정하는 제조업체의 지침을 따르십시오.
참고 : 기계 사양은 표 3에 요약되어있다. 시스템 사양 다양한 기관에서 다를 수 있지만, 그것은 (45 psi 내지 85 μm의 노즐)의 populat 선조 세포의 생존을 증가시키는 정렬 압력의 감소 및 더 큰 노즐 크기가 필요하다는 것을 유의해야이온 정렬 된 세포로부터 제조 된 RNA의 품질. 보상을 설정 농축 간 전구 세포를 사용하는 것이 중요하다. 다른 간 또는 백혈구 인구는 간질 인구의 최적 해상도와 거짓 게이팅 전략의 다른 자동 형광 및 결과가 있습니다. - 기계를 보정 및 정렬 수집 장치에서 SM의 350 μL를 포함하는 5 ML의 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브를 배치합니다. 샘플 수집 및 정렬을 시작합니다. 하위 집단의 1000 이벤트를 수집하고 샘플의 흐름을 중지합니다.
- 정렬 장치에서 튜브를 타고 흐름 cytometer에 정렬 된 세포를 측정한다. 살아있는 세포 사이에 존재하는 정렬 세포 인구의 비율을 확인합니다. 이 비율은 분류 세포의 순도를 제공한다.
- 정렬 순도가 95 %를 초과하는 경우, 정렬 수집 장치의 RLT 용해 완충액 350 μL를 함유하는 5 ㎖의 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브를 놓는다.
- 정렬을 시작하고 수집 7,000간질 모집단 10,000 이벤트.
- 추가 분석 할 때까지 -80 ℃에서 DNase-과의 RNase가없는 반응 관의 분류를 포함하는 세포 용해 완충액 RLT를 전송하고 샘플을 저장한다.
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Representative Results
실질 비 실질 간세포 (도 1 및도 2a)를 포함하는 단일 세포 현탁액 효소 결과의 신규 한 혼합물을 사용하여 간 소화 여기 제시된 방법. 적혈구의 ACK-용균 후, 단일 세포 현탁액 계측법 분석 직접적인 유동이 가능 (도 1 및 2)이다. 게이팅 전략은 이중선과 죽은 세포 (그림 2a)의 배제를 포함한다. CD45, CD31, 및 ASGPR1 마이너스 된 세포 게이팅된다. 이것은 인구 간 전구 세포를 포함하고 자신의 gp38 및 CD133의 발현 (도 2a)에 기초하여 그룹화 될 수있다. gp38 + CD133 +와 gp38 - 건강한 성인 마우스 리브 셀 - CD31 - - ASGPR1 CD133 + 세포가 가장 풍부한 세포 CD45 중 인구를 나타냅니다ER (도 2a, b). 이러한 서브 세트들은 이전 예는 EpCAM, 무서-1 및 CD34 (도 2C)과 같은 전구 세포와 관련된 추가적인 표면 마커의 발현에 차이가있다.
전구 세포는 그러한 간세포 간 정현파 내피 세포 (LSECs) (도 1 및 3) 및 전구 세포는 자기 마이크로 비드 기반 격리하여 더 정제 할 수있다 (도 3a, b) 또는와 같은 조혈 및 실질 세포에서 소모 될 수있다 정렬 고순도 (도 1 및 4). 90 % 이상의 순도 CD133 + 또는 gp38 + 세포 결과의 자성 마이크로 비드 기반 격리 (도 3a, b) 어떠한 오염 CD45, CD31 또는 ASGPR1 + 세포에 대하여, 상기 세포는 고도로 생존 유지 (도 3a, b).
능력이 상이 할 수있다. 이 조직 분리에 이용 효소 혼합물의 선택에 특히 적합하다. 여기서, 콜라게나 제 P 대신 콜라게나 D 간은 1, 2, 8을 사용 하였다. 중요한 것은, 선조 세포 CD133의 발현 수준 및 절연 세포 집단의 수율이 크게 콜라게나 D의 존재 하에서 저하되었다 (도 5a, b). 이 외에도, 우리의 혼합물을 부드러운 세분화 및 각종 유형의 세포의 계대 배양 (13)에 매우 적합하다, 디스 파제 함유 하였다. 디스 파제가 나타내는 함께 콜라게나 제 P전구 세포 분석 간 세포 해리 이상적인 조합. 이 조합은 트립신 우월하거나 간 프로 나제 계 소화 (데이터는 보이지 않음). 조상이 프로토콜에 제시된 분석을 위해이 같은 퍼콜 기반 농축 2, 14 그 밀도 원심 분리를주의하는 것도 중요하다, 필요하지 않았다.
그림 1 : 설명 프로토콜의 워크 플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 간 전구 부분 집합의 소설 분류. 단일 셀서스펜션은 건강한 간에서 준비하고 이후 표면 마커의 패널로 염색했다 : CD45, CD31, CD133 및 gp38 (A). 죽은 세포 배제, 요오드화 프로피 듐 (PI)을 이용 하였다. 게이팅 전략 대표 도트 플롯이 도시되어있다. 세포 수의 결정 유동 세포 계측법에 사용되는 게이트도 표시됩니다. (B) 백분율 야생형 미처리 동물에서 CD45 음성 세포 중에서 각종 간질 세포의 서브 세트 간 조직의 g 당 본 셀의 절대 값이 도시되어있다. (C) 히스토그램 건강한 간 실질 세포 서브 세트의 구별 마커 특성을 표시. CD34는 B. 무서-1 B에 존재하는 하위 집단에 대한 특정 동안 높은 CD90.2의 표현과 CD157의 존재, A에 대한 특정, C, D와는 EpCAM 인구 C 및 D 평균 ± SEM에만 존재; 데이터 (AC)는 n은 2-3 독립적 인 실험 = 실험 당 3-4을 나타냅니다. 데이터 WER전자는 부대, 두 개의 꼬리 T 테스트 *의 P <0.05, ** P <0.005, *** <0.0001 P를 사용하여 비교 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 자기 마이크로 비드 기반 농축 및 자동화 된 세포 정화. CD45의 (A) 자기 마이크로 비드 기반의 농축 - CD31 - 그리고 ASGPR1는 - 세포는 이전과 농축 한 후 그려져있다. 자동화 된 마이크로 비드 기반 세포 절연 부의 (B) 대표 도트 플롯은 왼쪽에, CD133 + 및 gp38 + 세포에 대한 묘사된다. 우측에서 전후 농축 후의 세포 집단의 생존 능력의 백분율로 나타낸다요오드화 프로피 듐 (PI) -negative 세포. ± SEM을 의미; 데이터 (AB)의 실험 당 N = 3 3 독립적 인 실험을 나타냅니다. 데이터는 부대, 양측 T 테스트의 * P <0.05, ** P <0.005, ** P <0.0001를 사용하여 비교 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 고순도 전구 부분 집합의 종류 유동 세포 계측법. 도트 플롯 정렬 된 샘플 (정렬 후)의 세포 집단의 순도를 도시한다. 데이터는 세 독립적 인 실험을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
= "1"> 
그림 5 : 소화 효소의 비교. 또는 콜라게나 D (2 단계에서 설명 된 바와 같이) 단일 세포 현탁액을 콜라게나 제 P를 사용하여 제조 하였다 (1 ㎎ / ㎖ +의 DNase-I 0.1 ㎎ / ㎖) 건강한 간로부터 연속적 표면 마커의 패널로 염색 하였다 : CD45을 CD31, CD133, gp38 및 (A). 야생형 미처리 동물에서 CD45 음성 세포 중에서 각종 간질 세포의 서브 세트 간 조직의 g 당 존재하는 세포의 비율을 나타낸다. (B) CD133의 중간 형광 세기는 CD133 + 세포 집단에 대해 도시된다. ± SEM을 의미; 데이터 (AB)의 실험 당 N = 3이 독립적 인 실험을 나타냅니다. 데이터는 부대, 양측 T 테스트의 * P <0.05, ** P <0.005, ** P <0.0001를 사용하여 비교 하였다.대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
간 염증과 다른 기원의 부상 전구 세포 확장 및 활성화 2, 3을 동반하는 간에서 재생 프로세스를 트리거합니다. 이러한 간 전구 세포는 세포의 특성을 가지고 줄기 가능성 각종 간 질환의 pathomechanism에서 중요한 역할을한다.
간 전구 세포의 이질성 오랫동안 제안되어왔다. 다른 표면 마커를 운반 서브 세트를 식별하고 간 손상 12시 염증 관련 유전자들의 고유 한 집합을 표현할 수 CD133 및 gp38의 신규 표면 마커의 조합을 사용하여 간 선조 부분 집합의 재평가. 여기에 기재된 방법은 희귀 세포 계측법 분석 직접 유동 각종 간 손상 모델에서의 직접적인 비교를 허용한다. 각종 부상 여러 전구 (S)의 활성화를 트리거로 이는 특히 관련ductular 반응 3, 4, 11, 12에서 관찰되는 세포 이질성 반사 형일 수 ubsets. 특히, 쥐 간 조직 (0.2 g)의 작은 부분은 상술 한 방법을 사용하는 전구 세포의 유세포 분석을위한 충분한 세포를 분리하기에 충분하다.
계측법 서브 세트의 고순도 집단을 제공 정렬 흐름은 고유 한 유전자 발현 프로파일을 조사 할 필요가있다. 이전보고 한 바와 유동 세포 계측법 계 전구 세포 분리 (15, 16). 그럼에도 불구하고, 여기에 제시된 프로토콜은 이러한 세포의 높은 순도와 생존을 보장하는 최적의 방법을 제공한다. 특히, 전술 한 시험 관내 배양 및 확장 기법 좋게 여기 15 제시된 프로토콜에 결합 될 수있다
종류로 유동 세포 계측법 많은 종류의 다양한 기관에서 사용할 수 있으며, 그들의 특정한 측정 장치는 다소 차이가있을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 세포 분류에 대한 일반 원칙은 설명 프로토콜에 제시되어있다. 일반적으로, 낮은 압력과 더 큰 노즐 크기는 시스템 유형 및 사양 독립적 절대적으로 필요하다. 또한, 적절한 정렬 매체의 이용 가능성은 크게, 특히 유전자 발현 연구를위한 중요한 요소이다 정렬 세포의 RNA의 질을 높일 수있다. 선조 세포의 선별은, 그러나, 큰 세포 생존율을 감소시키고, 정렬 후 세포의 수율 (4-5 건강 간 풀링 할 필요 7-10,000 이벤트 / 모집단의 고순도의 정렬을위한) 비교적 낮다. 이 분석 체외에서 추가에 대한 제한 요인이 될 수 있습니다. 우리에 대한 자기 마이크로 비드 기반 격리을 제안시험 관내 분석법으로 인해 더 높은 수율과 세포 생존 및 유동 이상의 지정된 서브 세트 분석 아이솔레이션이 필요할 때, 특히 유전자 발현 분석을 위해 선별 계측법.
세포의 생존율은 크게 분류 유세포 후 감소한다는 사실에 기초하여, 선조 세포의 자동화 된 자성 마이크로 비드 기반 격리 개발되고 여기에 제공되었다. 이 고순도 (복수 간 결합)을 가진 전구 세포의 큰 수의 격리를 허용한다. 또한, 세포의 생존율은 분리 공정에 필요한 시간이 크게 감소되기 때문에, 유지된다. 선조 세포의 낮은 숫자 관내 1, 2, 15, 16로 확장 될 수 있지만, 이러한 시험 관내 조작 줄기 / progen의 세포 기능을 변경할 수있는 방법을 고려하는 것이 권장로 모니터 셀들은 다른 중간 엽 및 간질 세포 집단 (17) (18)에 대해 설명했다.
제시된 자기 마이크로 비드 기반 격리의 주요 제한은 CD133 +와 gp38 + 세포 인구 이종 세포를 나타내는 것입니다. 추가 표면 마커는 작은 세포 집단을 식별하는 데 필요한 수 있습니다.
간 줄기 세포 및 전구 세포가 서로 어떻게 관련되는지에 대한 이해는 롤라 리드 등 1, 8, 19 우수 연구에도 불구하고, 지금까지 전체에서이다. 따라서, 이러한 현재 제안 된 것과 같은 높은 수율과 생존에 생성 기법의 신중한 검토 전구 서브 세트의 분석 및 그들의 상호 관계에 대한 이해를 도울 수 연장.
전반적으로, 우리가 설명했다 t그는 고립과 최근 (12)를 구별하고 간 전구 부분 집합의 분석을 자세히 설명합니다. 또한, 신규 한 효소 조합을 이용하여, 희귀 선조가 직접 유동 세포 계측법 측정에 의해 분석 될 수있다. 또한, 프로토콜은 세포 분류 또는 자동화 된 마이크로 비드 기반 기술을 사용하여, 고순도 전구 세포를 농축하는 방법을 설명한다.
문제 해결:
세포 파편 비율 죽어가는 세포는 높다
소화 (단계 2) 동안 간 샘플 피펫이 너무 열악한 경우, 단일 세포 현탁액의 증가 세포 사망의 비율. 간이 제안 된 것보다 더 큰 조각으로 절단되는 경우, 소화가 덜 효율적이고, 제조시보다 세포 사멸을 초래한다.
단계 5의 절차를 완료 한 후, 샘플의 순도가 충분하지
percen 경우단계 2에서 제조 된 단일 세포 현탁액 중의 세포 파편 TAGES 죽어가는 세포는 마이크로 비드는 비특이적으로 결합하고, 따라서, 단열의 순도가 크게 감소하고, 너무 높다.
마이크로 비드 기반 정제 후 낮은 세포 수
기술 된 프로토콜의 성공을 위해,이 프로토콜에 제시된 바와 같이 마이크로 비드에 세포의 비율을 최적화하는 것이 중요하다. 이상의 마이크로 비드를 이용하여 순도를 감소시키고, 분리 된 세포의 수율 가능성을 감소시킨다. 프로토콜에서 제시된 것 이외의 표면 마커는 전구 서브셋 분리를 위해 사용되는 경우, 마이크로 비드에 세포의 최적 비율을 결정해야한다.
gp38 + CD133의 자기 마이크로 비드 기반 격리 - 인구
추가로 10 μL 안티 CD133 + 마이크로 비드를 추가 단계 5.3에서 섹션 5에서 단계를 수행 한 후 다음 단계 5, 6.2 및 설명과 같은 6.3디.
절대 세포 수를 계산
간 중량은 특정 서브 세트의 많은 세포 g의 간 조직에 따라 존재하는 방법을 계산하는 데 사용된다.
(살아있는 세포의 아 집단의 % () 유동 세포 계측법에 기초하여 / 100) 간 편 = Z로부터 단리 총 생존 세포 수를 X
(간 조각의 1 / 무게) Z = 세포 수 / g의 간 조직을 X
이 방법으로 분리 할 수있는 다른 세포 집단
(등 또는 조혈 세포의 아 집단, 예를 들어, 쿠퍼 세포, 수지상 세포, T 세포, NK 세포) CD45 + 세포 LSECs에는 다음과 같은 간이 소화 프로토콜을 이용하여 세포를 분리 할 수있다. 소화 프로토콜은 간세포 또는 간 성상 세포의 분리에 적합하지 않습니다. 이 세포는 상대적으로 낮은 세포 수에 존재하고 그들은 인접 해에 비해 감소 가능성을 보여가능한 방법을 r에.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 VLK에 알렉산더 폰 훔볼트 재단 Sofja Kovalevskaja 수상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
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