Summary
Leverskade er ledsaget av stamcelleekspansjon som representerer en heterogen cellepopulasjon. Ny klassifisering av denne cellerommet gjør det mulig å skille av flere undergrupper. Metoden som beskrives her illustrerer strømningscytometri-analyse og med høy renhet isolasjon av ulike undergrupper som kan brukes for videre analyser.
Abstract
I løpet av kroniske leverskader, stamceller ekspandere i en prosess som kalles ductular reaksjon, noe som også medfører forekomsten av inflammatoriske cellulære infiltrat og epitelial celleaktivering. Den stamcelle befolkningen under slike betennelsesreaksjoner har hovedsakelig blitt undersøkt ved hjelp av enkle overflatemarkører, enten ved histologisk analyse eller ved flowcytometri-baserte teknikker. Men nye overflatemarkører identifisert ulike funksjonelt distinkte undergrupper innenfor leveren stamfar / stamcellerommet. Metoden som presenteres her beskriver isolering og detaljert flyt cytometri analyse av progenitor undergrupper ved hjelp av ny overflatemarkør kombinasjoner. Videre viser det hvordan de ulike stamcelle undergrupper kan isoleres med høy renhet ved hjelp av automatisert magnetisk og FACS sortering-baserte metoder. Viktigere, ny og forenklet enzymatisk dissosiasjon av leveren gjør det mulig for isolering av disse sjeldne cellepopulasjoner med en høy levedyktighetsom er overlegen i forhold til andre eksisterende metoder. Dette er spesielt aktuelt for ytterligere å studere stamceller in vitro, eller for isolering av høy kvalitet RNA for å analysere genekspresjon profilen.
Introduction
Leveren regenerering er hovedsakelig knyttet til selvfornyelse kapasitet på hepatocytter. Ikke desto mindre forekommer kroniske leverskader med stamcelle aktivering og ekspansjon, som er blitt forbundet med deres evne til å differensiere til hepatocytter og cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Dette er spesielt relevant fordi, i løpet av kroniske skader, er hepatocytter spredning ikke er effektive. Til tross for flere genetiske Tracing studier rettet mot stamceller, deres rolle i leveren regenerering er fortsatt kontroversielt 5, 6, 7, 8. Videre har aktiveringen av progenitorceller vært knyttet til økt fibrotisk reaksjon i leveren, noe som stiller spørsmål om deres eksakte rolle under skader 9, 10.
Den heterogene natur av stamcelle kammeret har lenge vært foreslått av genuttrykkstudier det isolerte progenitor-celler som uttrykker et enkelt overflatemarkør ved hjelp av mikrodisseksjon eller cellesortering-baserte metoder 1, 11. Faktisk nylig en ny overflate markør kombinasjon hjelp gp38 (podoplanin) utvetydig knyttes tidligere enkeltmarkører stamceller til ulike undergrupper 12. Viktigere, disse undergrupper ikke bare skilte seg i deres overflate markør uttrykk, men også utstilt funksjonelle endringer i løpet av skader 12.
Flere dyremodeller er blitt benyttet for å undersøke progenitor-celleaktivering og leveren regenerering. Det virker som de ulike skadetyper fremme aktivering av ulike undergrupper av stamceller 12. Dette kan forklare phenotypic divergens av ductular reaksjon er observert hos mennesker 4. Dermed komplekse fenotypiske og funksjonelle analyser av stamceller er avgjørende for å forstå sin rolle i skader og den sanne betydningen av ductular reaksjon i leversykdommer.
Foruten overflate markør kombinasjoner, de avgjørende forskjeller i celle isolasjon protokoller ytterligere komplisere konklusjonene basert på tidligere studier 2. En betydelig mengde av studier rettet rollen til stamceller som i stor grad har forskjellig isolasjonsprotokoll (f.eks lever dissosiasjon (enzymkombinasjon og varigheten av prosessen), tetthet medium og sentrifugehastighet) 2. En optimalisert isolert teknikk, noe som gir bedre levedyktighet for sjeldne celle populasjoner og reflekterende av undergruppe sammensetning, har blitt utviklet og utgitt nylig 12. Målet med denne artikkelen er å gi en mer Fondetfeilte protokoll fra denne levercelleisoleringsprosedyren og den undergruppe analyse for å tillate riktig gjengivelse av teknikken. I tillegg omfatter protokoll en sammenligning med den tidligere isolasjonsmetoden for å vise forskjellene i forhold til den nye protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble gjennomført med godkjenning av etikk og dyr omsorg komiteer av Homburg University Medical Center.
1. Utarbeidelse av materialer og buffere
- Fersk forberede alle buffere som kreves for leveren fordøyelse ved hjelp av sterile komponenter og en laminær hette for å unngå bakteriell forurensning.
- Forbered oppsamlingsbufferen (CB) ved å blande 49,5 ml RPMI-medium og 0,5 ml føtalt bovint serum (FBS; lav endotoksin, varme-inaktivert) for å oppnå en 1% (v / v) løsning. Oppbevar løsningen på is inntil videre bruk.
MERK: Omtrent 25 ml CB er nødvendig for å fordøye en hel lever. - Klargjør fordøyelse buffer (DB) ved anvendelse av følgende ingredienser: RPMI-medium, 1% (v / v) FBS (lav endotoksin, varme-inaktivert), collagenase P (/ ml 0,2 mg), DNase-I (0,1 mg / ml) og dispase (0,8 mg / ml).
MERK: Omtrent 25 ml DB er nødvendig for å fordøye en hel lever. Pre-varme DB i tHan 37 ° C vannbad før bruk. - Rekonstituer enzymene ved ankomst i Hanks 'balanserte saltløsning (HBSS; collagense P og dispase) eller i DNase-I-buffer (50% (v / v) glycerol, 1 mM MgCl2, og 20 mM Tris-HCl; pH 7,5) , delmengde det, og lagre det ved -20 ° C. Oppbevar DNase-I buffer ved 4 ° C og bruke det i løpet av to måneder.
2. Utarbeidelse av Liver Single-celle Suspension
- Avlive ubehandlede villtype mus ved halshugging i samsvar med lokale etikk og dyr omsorg komiteer.
- Plasser mus på en disseksjon bord og våt pels med 70% etanol. Ved hjelp av saks, åpne buken med et midtlinje innsnitt i huden, etterfulgt av en Y-snitt langs bena. Åpne peritoneum opp til brystbenet ved hjelp av saksen. For å avdekke leveren, fortrenge tarmen forsiktig til høyre med en bomullspinne.
- Med hjelp av saks og pinsett, fjerner leveren lobes,forlater galleblæren bak, og unngå forurensning med bindevev. Vei leveren og plassere den på is i en petriskål med HBSS.
- Plasser leverlappene på et tørt petriskål og kutte leveren vev inn i homogene terninger ca 2 mm en side ved hjelp av en skalpell. Overfør bitene inn i en 15-ml konisk sentrifugerør.
- Legg 2,5 ml DB til 15 ml koniske sentrifugerør som inneholdt leverstykkene og plasser det i et 37 ° C vannbad for å starte fordøyelsen (en frisk lever tar 60-70 minutter, og en cirrhotisk lever tar 80-90 minutter ).
MERK: Hvis en hel lever blir fordøyd, bør leveren deles inn i to 15-ml konisk sentrifugerør for å sikre god cellelevedyktighet. - Klargjør en ny 15-ml konisk sentrifugerør å samle utgitt leverceller. Plasser en polyamid 100-um filter mesh på toppen av røret og våt mesh med 800 ul av CB. Plasser den koniske sentrifugerør på is.
- Bland samsippene i 37 ° C vannbad etter 5 og 10 min, for å understøtte den nedbrytningsprosess ved å riste 15 ml konisk sentrifugerør innehold leveren stykker.
- 15 minutter etter start fordøyelsen, forsiktig blande lever stykker ved hjelp av en 1000-mL pipette med et kutt tips som gjør at leveren brikkene til å passere gjennom enkelt. Plasser rørene tilbake i vannbad og la brikkene til å betale for 2 min.
- Fjern supernatanten inneholder spres celler (vanligvis 2x 700 mL) og legge den til røret utarbeidet i trinn 2.6. Erstatt den fjernede supernatant med DB (2x 700 mL) og sett den tilbake i 37 ° C vannbad.
- Gjenta fremgangsmåten beskrevet i trinn 2.8 (typisk 30, 40, 50, 55, og 60 min) inntil omtrent 60-70 minutter har gått siden starten av fordøyelse. Fra 40 min og utover, må de gjenværende leverstykkene være liten nok til å passere gjennom en ukuttet 1000-mL pipettespissen.
MERK: Sunn leveren er DigeSTED fullt innen 60-70 min, mens fibrotisk lever vanligvis trenger 80-90 min. Ved dette tidspunkt bør levervev ikke være synlig i den koniske 15 ml sentrifugerør inneholdende de leverstykkene, og alle frigjorte celler skal overføres inn i røret fremstilt i trinn 2,6. - Ved slutten av fordøyelsesprosessen, samle cellene og sentrifuger dem i 8 min ved 180 xg og 4 ° C (under anvendelse av redusert akselerasjon / retardasjon og 4/2).
- Cellepelleten suspenderes i 1 ml av ammonium-klorid-kalium (ACK) lysebuffer og inkuber det i 1 min ved romtemperatur for å lysere røde blodceller. Stopp reaksjonen ved å tilsette 5 ml av CB, og deretter sentrifuger cellene i 8 min ved 180 xg og 4 ° C (under anvendelse av redusert akselerasjon / retardasjon og 4/2). Resuspender cellene i 4 ml CB og lagre dem på is. Telle celler, som beskrevet i trinn 3.
MERK: Cellepelleten er løs, og derfor supernatanten ble pipettert bort i stedet for å bli dekantert.3. Fastsettelse av celletall ved hjelp av flowcytometri
NB: For bestemmelse av celletall, en automatisk celleteller eller, ideelt sett, er flowcytometri-baserte celle kvantifisering beskrevet nedenfor foreslått i stedet for den klassiske Neubauer kammerbasert metode. Leveren enkeltcellesuspensjon som er beskrevet i trinn 2 inneholder parenchymale og ikke-parenchymale celler (NPC) med sterkt forskjellige størrelser og detaljnivåer. Riktig utelukkelse av mobilnettet rusk sammen med gating-on fremover scatter, side scatter (FSC-SSC) karakteristisk for NPCer ved bruk av flowcytometri sikrer suksess for den beskrevne protokollen 12.
- Fremstille en delmengde av levercellesuspensjon (20 pl) og tilsett 174 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) og 6 ul av propidium jod (PI; sluttkonsentrasjonen 0,375 ug / ml). Legg telle perler som gjør det mulig for kvantifisering av cellene.
- Gate på SSC-A-FSC-A for å unngå rusk og videre utelukke dubletter ved hjelp av FSC-H og FCS-A.
MERK: Det er viktig å følge lede strategi avbildet i figur 2. - Gate ut PI-positive døde celler, måle 30 mL fra prøvene, og registrere hendelser. Følg produsentens retningslinjer for å beregne celletall.
MERK: Følg trinn 4 for flowcytometri måling, trinn 5 og 6 for magnetisk basert stamcelle isolasjon, og trinn 7 for flowcytometri slags forløper subpopulasjoner.
4. Farging av leveren Single-celle Suspension for Fow Cytometry Analyse av Progenitor Delsett
antistoff Clone Vert / Isotype Stock Konsentrasjon [mg / ml] fortynning CD64 X54-5 / 7.1 Mus IgG1, κ 0.5 1: 100 CD16 / 32 93 Rat IgG2a, λ 0.5 1: 100 CD45 30-F11 Rat IgG2b, κ 0.2 1: 200 CD31 MEC13.3 Rat IgG2a, κ 0.5 1: 200 ASGPR1 Polyklonale Goat IgG 0.2 1: 100 Podoplanin 1/8/2001 Syrian Hamster IgG 0.2 1: 1400 Podoplanin 1/8/2001 Syrian Hamster IgG 0.5 1: 1400 CD133 Mb9-3G8 Rat IgG1 0,03 3 pl CD133 315-2C11 Rat IgG2a, λ 0.5 1: 100 CD34 RAM34 Rat IgG2a, κ 0.5 1: 100 CD90.2 53-2,1 Rat IgG2, κ 0.5 1: 800 CD157 BP-3 Mus IgG2b, κ 0.2 1: 600 EpCAM G8.8 Rat IgG2a, κ 0.2 1: 100 Sca-en D7 Rat IgG2a, κ 0,03 10 mL Mus IgG2b, κ MPC-11 0.2 Rat IgG1 RTK2071 0.2 Rat IgG2b, κ RTK4530 0.2 Rat IgG2a, κ RTK2758 0.5 Rat IgG2a, κ RTK2758 0.2 Syrian Hamster IgG SHG-en 0.2 Syrian Hamster IgG SHG-en 0.5 Normal Goat IgG kontroll Polyklonale Goat IgG 1 Donkey anti-Goat IgG Donkey IgG 2 1: 800 streptavidin 1 1: 400 Tabell 1.
antistoff 1 2 3 4 5 CD45 APC / Cy7 Rat IgG2b, κ
0,5 mL+ + + + CD31 Biotin + Rat IgG2a, κ
0,5 mL+ + + ASGPR1 renset + + Normal Goat IgG kontroll
0,2 mL+ + Podoplanin APC + + + Syrian Hamster IgG
1 mL av en 01:14 fortynning+ CD133 PE + + </ Td> + + Rat IgG1
0,45 mLDonkey anti-Goat
Alexa Fluor 488+ + + + + streptavidin
Alexa Fluor 405+ + + + + Tabell 2.
- Å plassere en prøve av cellesuspensjonen fra trinnet 2.11 inn i et reaksjonsrør (1,5 ml) inneholdende 2,5 x 10 5 celler, bestemt som beskrevet i trinn 3.
- Sentrifuger cellene i 3 minutter ved 300 xg og 4 ° C ved anvendelse av en mikrosentrifuge.
MERK: På dette punktet, kan en vakuumpumpe benyttes til å fjerne supernatanten forsiktig. - Resuspender cellepelleten i Fc-blokk blandingen og inkuberes det i 5 min på is. Fremstille Fc-blokk blanding med et totalvolum på 50 ul pr flekken. Legg en0 mL av FcR-blokkerende reagens, 1 pl av renset anti-CD64 (1: 100; 0,5 ug / flekk), og 40 ul av flekker buffer (ST-buffer: HBSS, 1% (v / v) FBS og 0,01% natriumazid) per flekken.
MERK: Natriumazid er svært giftig. Bruk egnet personlig verneutstyr, for eksempel nitril hansker, laboratoriefrakk og munnbind. - Tilsett 50 mL av flekker blanding til cellene (det totale volum av celler er nå 100 ul) og inkubere cellene med antistoffet blandingen, beskyttet mot lys og i 20 minutter på is.
- Fremstille antistoffet blanding med et totalvolum på 50 ul pr flekken. For 50 mL av ST buffer, legge til følgende konjugerte antistoffer for grunnleggende farging: CD45 (0,5 ul, 1: 200, 0,1 pg / beis), CD31 (0,5 ul, 1: 200, 0,25 mikrogram / beis), ASGPR1 (1 mL ; 1: 100; 0,2 ug / flekk), podoplanin (1 pl av en 1:14 fortynning, 1: 1400 fortynning end; 0,014 ug / flekk), og CD133 (3 ul, 0,09 ug / flekk).
MERK: Table1 oppsummerer de antistoff-kloner og fortynninger som anvendes for grunnleggende flekker og for ytterligere overflatemarkører for de forskjellige delsettene. Fremstille ekstra cellesuspensjoner for antistoffblanding inneholdende de tilsvarende kontroller isotype og / eller fluorescens minus en kontroller (FMOs), som vist i tabell 2. - Tilsett 400 ul av ST-buffer til hver prøve og sentrifuger cellene i 4 minutter ved 300 xg og 4 ° C.Discard supernatanten og resuspender cellene i 100 pl sekundært antistoff blanding inneholdende 0,125 mL av esel anti-geite-IgG (1: 800; 0,25 ug / flekk) og 0,25 mL av fluorescerende-konjugert streptavidin (1: 400; 0,25 ug / flekk) i 100 ul buffer ST.
- Cellene inkuberes under beskyttelse mot lys og med antistoffet blanding i 20 min på is. Tilsett 400 ul av ST-buffer til hver prøve og sentrifuger cellene i 4 minutter ved 300 xg og 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender cellene i 300 ul av ST buffer inneholdende 0,25 ug / ml PI.
MERK: celleviabilitet av progenitorceller avtar med tiden; Derfor er det foreslått å måle ferske prøver så snart som mulig.
5. Magnetisk mikrobaserte Anriking av stamceller
- Overføre en alikvot av leveren enkeltcellesuspensjon inneholdende 1,5-2 x 10 6 celler basert på celletallet bestemt som beskrevet i trinn 3, inn i en ny 15-ml konisk sentrifugerør.
- Sentrifuger cellene i 8 min ved 180 xg og 4 ° C (under anvendelse av redusert akselerasjon / retardasjon og 4/2).
MERK: Vanligvis vil en sunn C57Bl / 6 mus leveren (eller 1 g levervev) trenger å bli separert i tre 15-ml konisk sentrifugerør. - Resuspender cellene i 400 pl HBSS 0,5% (v / v) bovint serumalbumin (BSA) og tilsett 40 ul av anti-CD31-mikroperler og 30 ul av anti-CD45-mikroperler. Cellene inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C.
MERK: Ikke overskrid than inkubasjonstid, som renheten av separasjons vil bli betydelig redusert. - Tilsett 5 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA til cellene og sentrifuger dem i 8 min ved 180 xg og 4 ° C (under anvendelse av redusert akselerasjon / retardasjon og 4/2).
- Resuspender cellepelleten i 100 ul av død celle fjerning perler og inkuber dem ved romtemperatur i 15 min. I mellomtiden forbereder en LS separasjonskolonne og kalibrere den med 3 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA.
MERK: Ikke overskrid inkubasjonstiden, som renheten av separasjon vil bli betydelig redusert. - Legg 900 pl HBSS 0,5% (v / v) BSA til cellene, filtrerer dem ved hjelp av 100-um polyamid filterduken, og laste dem på LS separasjonskolonnen.
MERK: Legg i en hel lever på en LS separasjon kolonne. - Vask kolonnen tre ganger med 3 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA og samle gjennomstrømnings.
- Sentrifuger gjennomstrømnings i 8 min ved 180 xg og 4 ° C (under anvendelse av redusert tilbeleration / 4 og retardasjon / 2).
- Resuspender cellepelleten enten i skyllebuffer (RB) (PBS og 2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)) inneholdende 0,5% (v / v) BSA eller ST-buffer, avhengig av den videre eksperimentelle prosedyren.
6. Magnetic mikrobaserte Automatisert Cell Rensing av stamcelle Delsett Kombinert fra flere Livers
MERK: Siden stamcelle undergrupper representerer sjeldne celle populasjoner, er å kombinere celler fra flere lever ofte nødvendig for å oppnå tilstrekkelig antall celler for videre eksperimenter. Som et eksempel, CD133 + og gp38 + celleseparasjon, er beskrevet nedenfor.
- Isolering av CD133 + forfedre
- Etter trinn 5.9, telle cellene, som beskrevet i trinn 3, og resuspender opp til 10 6 celler (typisk pooling 4-6 friske prøvene lever) i 100 mL av RB.
- Legg til anti-CD64 på 1: 100 og anti-CD16 / 32 1: 100 til cellene og incubspiste dem på is i 5 min. Tilsett 1: 100 anti-CD133 biotinylert antistoff til cellene og inkuber dem på is i ytterligere 10 min.
- Tilsett 5 ml RB og sentrifuger i 8 minutter ved 180 xg og 4 ° C (under anvendelse av redusert akselerasjon / retardasjon og 4/2).
- Resuspender cellene i 400 mL av RB og tilsett 10 ul av anti-biotin mikroperler. Inkuber prøven i 15 minutter ved 4 ° C. Ikke overskrid inkubasjonstid, da dette reduserer renheten av prøvene.
- Tilsett 5 ml RB og sentrifuger i 8 minutter ved 180 xg og 4 ° C (under anvendelse av redusert akselerasjon / retardasjon og 4/2). Resuspender pelleten i 1 ml RB.
- Isolering av gp38 + forfedre
- Etter trinn 5.9, telle cellene, som beskrevet i trinn 3, og resuspender opp til 10 6 celler (typisk pooling 4-6 friske prøvene lever) i 100 mL av RB.
- Legg til anti-CD64 på 1: 100 og anti-CD16 / 32 1: 100 til cellene og inkuber dem på is i 5 min. Deretter legger du en:100 anti-gp38 biotinylert antistoff til cellene og inkuber dem på is i ytterligere 10 min.
- Tilsett 5 ml RB og sentrifuger i 8 minutter ved 180 xg og 4 ° C (under anvendelse av redusert akselerasjon / retardasjon og 4/2).
- Suspender cellene i 400 mL av RB og legge til 5 mL av anti-biotin mikroperler. Inkuber prøven i 15 minutter ved 4 ° C. Ikke overskrid inkubasjonstid, da dette reduserer renheten av prøvene.
- Tilsett 5 ml RB og sentrifuger i 8 minutter ved 180 xg og 4 ° C (under anvendelse av redusert akselerasjon / retardasjon og 4/2).
- Cellepelleten suspenderes i 1 ml RB.
- Vanlige skritt etter skritt 6.1 eller 6.2
- Plasser 15 ml konisk sentrifugerør inneholdende de magnetisk merkede cellesuspensjoner på en kjøle 5 stativ med to ytterligere tomme rør for oppsamling av de positive og negative fraksjoner. Plasser kulden stativet på separasjon plattformen av separatoren.
- Bruk positiv utvelgelse program(Possel_d2) med en omfattende vasketrinn mellom hver prøve (skylling alternativ).
MERK: Ved hjelp av kolonne-baserte manuell separasjon av celler i stedet for den automatiske separatoren vil redusere renheten av prøven. - Samle de positive fraksjonen og sentrifuger i 8 minutter ved 180 xg og 4 ° C (under anvendelse av redusert akselerasjon / retardasjon og 4/2).
- Resuspender cellepelleten enten i RB eller ST-buffer, avhengig av den videre eksperimentelle prosedyren.
- For en renhet sjekk, ta en alikvot av cellene og beis dem som er beskrevet i trinn 4.
7. flowcytometrisystemer Cell Sorting
MERK: En høy renhet slag i alle stamcelle subsett kunne oppnås med protokollen beskrevet nedenfor. Det totale utbyttet av celler som er mye lavere enn den som er beskrevet i trinn 6, og er best for genekspresjon analyse.
Parameter Innstilling dyse størrelse 85 mikrometer Frekvens 46,00 til 46,20 amplitude 38,30 til 55,20 Fase 0 Drop Delay 28,68 til 28,84 Demping Av First Drop 284-297 Target Gap 9.-14 Press 45 psi Tabell 3.
- Erverve celler fra magnetbaserte anrikning (beskrevet i trinn 5); telle dem, slik det er beskrevet i trinn 3; og beis dem for progenitor markører (CD133, gp38), CD31, ASGPR1 og CD45, som forklart i trinn 4.
- Forbered sortering medium (SM): fenol-rød gratis Dulbecco modifiserte Eagles Medium (DMEM) inneholdende 0,5% (v / v) BSA og 0,01% (v / v) natriumazid. Suspender fargede celler i SM, overføre dem til en polypropylen rundbunnet rør, og plassere dem på is.
MERK: Natriumazid er svært giftig. Bruk egnet personlig verneutstyr, for eksempel nitril hansker, laboratoriefrakk og munnbind. Ikke bruk natriumazid hvis de sorterte celler brukes for funksjonelle analyser. - Bruke passende programvare for den type sorter som brukes for celleisolasjon. Åpne programvaren og følg produsentens instruksjoner for å sette opp sorteringsparametere og maskinspesifikasjoner.
MERK: Maskinen spesifikasjoner er oppsummert i tabell 3. Mens maskinens spesifikasjoner kan være forskjellig på forskjellige institusjoner, er det viktig å merke seg at reduksjonen av sorterings trykk og en større dyse størrelse er nødvendig (45 psi og 85-um dyse) for å øke levedyktigheten av stamcelle population og kvaliteten av RNA fremstilt fra de sorterte cellene. Det er viktig å bruke anrikede leveren forløperceller for innstilling av kompensasjon. Andre lever eller leukocyttpopulasjoner har forskjellig auto-fluorescens og resulterer i en suboptimal oppløsning av stromal befolkning og i en falsk gating strategi. - Kalibrer maskinen og plasser en 5-ml polypropylen rundbunnet rør som inneholder 350 mL av SM i sort samlingen enheten. Begynn å prøve kjøp og slag. Samle 1.000 hendelser av en undergruppe og stoppe prøvestrømmen.
- Ta røret ut av sorteringsanordningen og måle de sorterte cellene på strømningscytometer. Identifisere hvor mange prosent av den sorterte cellepopulasjon til stede blant de levende celler. Denne prosentandelen gir renheten av de sorterte cellene.
- Hvis sorterings renhet høyere enn 95%, plassere en 5-ml polypropylen rundbunnet rør inneholdende 350 pl av lyseringsbuffer RLT i sorteringen oppsamlingsanordningen.
- Start sortere og samle 700010.000 hendelser per stromal undergruppe.
- Overfør RLT lyseringsbuffer inneholdende de sorterte cellene i en DNase- og RNase-fri reaksjonsrøret og lagres prøvene ved -80 ° C inntil videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremgangsmåten presentert her for fordøyelsen av leveren ved anvendelse av en ny blanding av enzymer resulterer i en enkeltcellesuspensjon inneholdende parenchymale og ikke-parenchymale leverceller (figur 1 og 2a). Når ACK-lysering av røde blodlegemer, den direkte flowcytometri analyse av enkeltcellesuspensjonen er mulig (figur 1 og 2). Den gating strategien innebærer utelukkelse av dubletter og døde celler (figur 2a). Cellene som er negative for CD45, CD31, og ASGPR1 er inngjerdet. Denne populasjonen omfatter leveren stamceller og kan grupperes basert på deres gp38 og CD133 uttrykk (figur 2a). De gp38 + CD133 + og gp38 - CD133 + celler representerer de mest tallrike cellepopulasjoner blant CD45 - CD31 - ASGPR1 - celler i friske voksne mus liver (figur 2a, b). Disse undergrupper er forskjellige i ekspresjonen av ytterligere overflatemarkører som tidligere er forbundet med progenitor-celler, slik som EpCAM, Sca-1, og CD34 (figur 2c).
Stamceller kan bli tømt fra hematopoietiske og parenchymale celler, slik som hepatocytter og leversinusformet endotelceller (LSECs) (figur 1 og 3), og stamceller kan bli ytterligere renset med magnetiske mikrobasert isolasjon (figur 3a, b) eller med sortering av høy renhet (figur 1 og 4). Den magnetiske mikroperler basert isolering av CD133 + eller gp38 + celler resulterer i over 90% renhet (figur 3a, b) om eventuelle forurensende CD45, CD31, eller ASGPR1 + celler, og cellene forblir høyt levedyktig (figur 3a, b).
2. Dette er spesielt relevant for valg av enzymblanding anvendt for vev dissosiasjon. Her ble kollagenase P i stedet for kollagenase D anvendt for leveren 1, 2, 8. Viktigere, ekspresjonsnivået av CD133 på progenitorceller og utbyttet av isolerte cellepopulasjoner ble sterkt redusert i nærvær av kollagenase D (figur 5a, b). I tillegg til dette, vår blanding inneholdt dispase, som er godt egnet for skånsom disaggregering og subdyrking av forskjellige celletyper 13. Collage P sammen med dispase representereren ideell kombinasjon for celle dissosiasjon av leveren for stamcelle analyse. Denne kombinasjonen var også overlegen i forhold til trypsin eller pronase-baserte fordøyelse av leveren (data ikke vist). Det er like viktig å merke seg at tetthetssentrifugering, for eksempel Percoll-baserte berikelse 2, 14, var ikke nødvendig for progenitor-analyser presentert i denne protokollen.
Figur 1: Workflow av den beskrevne protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Novel klassifisering av leveren progenitor undergrupper. En enkelt-celleSuspensjonen ble fremstilt fra friske, lever og deretter farget med et panel av overflatemarkører: CD45, CD31, CD133 og gp38 (A). For død celle utelukkelse, ble propidiumjodid (PI) utnyttet. Representative dot tomter med gating strategien er avbildet. De brukes til flowcytometri legemer besluttsomhet porter er også merket. (B) Prosentene og det absolutte antall celler tilstede pr g levervev av de forskjellige stromale celleundergrupper mellom de CD45-negative celler i villtype ubehandlede dyr er vist. (C) Histogrammene viser karakteristiske markør egenskapene til stromal-celleundergrupper i en frisk lever. Høy ekspresjon av CD90.2 og tilstedeværelsen av CD157 er spesifikke for A, mens CD34 er spesifikk for subpopulasjonen B. Sca-1 er til stede i B, C, D og EpCAM er bare til stede i populasjonen C og D. Gjennomsnitt ± SEM; dataene (AC) representerer 2-3 uavhengige forsøk med n = 3-4 per eksperiment. Dataene were sammenlignet ved hjelp av en uparet, tosidige T test * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Magnetic mikrobaserte berikelse og automatisert celle rensing. (A) Magnetisk mikroperle-baserte anriking av CD45 -, CD31 - og ASGPR1 - celler er vist før og etter berikelse. (B) Representative dot plots av automatiserte mikrobaserte celle isoleringer er avbildet for CD133 + og gp38 + celler, til venstre. På høyre, blir levedyktigheten til de cellepopulasjoner før og etter berikelse vist som prosentandelenpropidiumjodid (PI) -negative cellene. Gjennomsnitt ± SEM; data (AB) representerer 3 uavhengige eksperimenter med n = 3 per forsøk. Dataene ble sammenlignet ved bruk av en uparet, tosidige T test * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Flowcytometri slags forløper undergrupper med høy renhet. Prikkplott viser renheten av cellepopulasjoner i de sorterte prøver (post-slag). Dataene representerer 3 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
= "En"> 
Figur 5: Sammenligning av fordøyelsesenzymer. Den enkeltcellesuspensjon ble fremstilt ved bruk av kollagenase P (som beskrevet i trinn 2) eller kollagenase D (1 mg / ml + DNase-I 0,1 mg / ml) fra friske lever og ble deretter farget med et panel av overflatemarkører: CD45, CD31, CD133, og gp38 (A). Prosentandelene av celler tilstede pr g levervev av de forskjellige stromale celleundergrupper mellom de CD45-negative celler i villtype ubehandlede dyr er vist. (B) Den midlere fluorescensintensitet av CD133 er vist for den CD133 + cellepopulasjonen. Gjennomsnitt ± SEM; data (AB) representerer 2 uavhengige eksperimenter med n = 3 per forsøk. Dataene ble sammenlignet ved bruk av en uparet, tosidige T test * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0001.target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leverbetennelse og skader av ulik opprinnelse utløse regenerative prosesser i leveren som er ledsaget av stamcelleekspansjon og aktivering to, tre. Disse lever stamceller har stamcelleegenskaper og sannsynligvis spille en betydelig rolle i pathomechanism av ulike leversykdommer.
Heterogeniteten av lever progenitorceller har lenge vært foreslått. Den revurdering av lever progenitor undergrupper ved hjelp av en ny overflate markør kombinasjon av CD133 og gp38 kunne identifisere undergrupper som bærer ulike overflatemarkører og uttrykke et unikt sett av inflammasjonsrelaterte gener ved leverskade 12. Fremgangsmåten som er beskrevet her gjør det mulig for den direkte flowcytometri analyse av sjeldne celler og deres direkte sammenligning i forskjellige leverskade modeller. Dette er spesielt relevant, da forskjellige skader utløser aktiveringen av multiple forløper- subsets som kan være representative for den cellulære heterogenitet observert i ductular reaksjoner 3, 4, 11, 12. Spesielt, en liten brøkdel av murine levervev (0,2 g) er tilstrekkelig til å isolere tilstrekkelig antall celler for flowcytometri analyse av progenitorceller ved å bruke den beskrevne metoden.
Flowcytometri sortering gi befolkningen i de undergrupper høy renhet er nødvendig for å utforske de unike genuttrykk profiler. Tidligere rapporter beskrevet flowcytometri-baserte stamcelle isolasjon 15, 16. Ikke desto mindre, den protokoll som presenteres her gir en optimalisert metode som sikrer høy renhet og levedyktigheten til disse cellene. Spesielt, kan in vitro dyrking og utvidelse teknikker beskrevet tidligere være pent kombinert med protokollen presenteres her 15
Mange typer flowcytometri sorters er tilgjengelig på ulike institusjoner, og deres spesielle besetninger kan være litt annerledes. Ikke desto mindre er de generelle prinsipper for cellesortering presentert i den beskrevne protokoll. Generelt blir et lavere trykk og større dysestørrelse er absolutt nødvendig, uavhengig av de maskintyper og spesifikasjoner. Dessuten kan bruk av et passende sorteringsmedium i betydelig grad øke levedyktigheten og RNA kvaliteten av de sorterte celler, noe som er en viktig faktor, særlig for genuttrykkstudier. Sorteringen av stamceller, men reduserer cellenes levedyktighet, og utbyttet av cellene etter sortering er forholdsvis lav (for høy renhet slags 7-10,000 hendelser / undergruppe, 4-5 friske lever trenger å bli slått sammen). Dette kan være en begrensende faktor for videre in vitro analyser. Vi foreslår magnetiske mikrobasert isolasjon for ivitro-undersøkelser på grunn av sin høyere utbytte og celle-levedyktighet, og flowcytometri sortering for genekspresjon analyse, spesielt når mer spesifisert undersett analyser og isoleringer er nødvendig.
Basert på det faktum at levedyktigheten til cellene er sterkt redusert etter strømningscytometri sortering, har en automatisk magnetisk mikrobasert isolering av progenitorceller blitt utviklet og presentert her. Det gir mulighet for isolering av et større antall progenitorceller med høy renhet (kombinere flere lever). Videre er levedyktigheten til cellene opprettholdes, siden den tid som er nødvendig for isolasjonsprosess er sterkt redusert. Mens lavere antall stamceller kan utvides in vitro 1, 2, 15, 16, er det anbefalt å vurdere hvordan disse in vitro-manipulasjoner kan endre cellulære funksjoner i stammen / ProgenMonitor celler beskrevet for andre mesenchymale og stromal celle populasjoner 17, 18.
Den store begrensning av presenterte magnetiske mikrobasert isolasjon er at CD133 + og gp38 + cellepopulasjoner representerer heterogene celler. Andre overflatemarkører kan være nødvendig for å identifisere små cellepopulasjoner.
Forståelsen av hvordan lever stamceller og stamceller forholder seg til hverandre er langt fra komplett, til tross for gode studier av Lola Reid og andre 1, 8, 19. Dermed kunne nøye vurdering av teknikker som resulterer i høyere avkastning og levedyktighet, for eksempel en foreslått her, bidra til å forlenge analysene av progenitor undergrupper og forståelsen av deres sammenhengende forhold.
Totalt har vi beskrevet than detaljert isolering og analyse av leveren progenitor undergrupper som nylig ble preget 12. Videre, ved å anvende en ny enzymkombinasjon, sjeldne forløpere kan bli analysert ved hjelp av strømningscytometri direkte målinger. I tillegg demonstrerer hvordan protokollen for å berike forløperceller med en høy renhet, ved hjelp av enten cellesortering eller et automatisert mikroperle-basert teknikk.
Feilsøking:
Prosentandelene av cellerester og døende celler er høy
Hvis du under fordøyelsen (trinn 2), er det pipettering av prøvene leveren for harde, prosentandelen av døende celler i encellede suspensjon øker. Hvis leveren kuttes i større stykker enn foreslått, er mindre effektiv fordøyelse og resulterer i mer celledød under fremstillingen.
Etter å ha gjennomført fremgangsmåten i trinn 5, er ikke tilstrekkelig til renheten av prøvene
Dersom prosenttages av cellerester og døende celler i enkeltcellesuspensjonen fremstilt i trinn 2 er for høye, mikroperlene bindes uspesifikt, og derfor, er renheten av isolerings sterkt redusert.
Lav celle nummer etter mikrobasert rensing
For å lykkes med de beskrevne protokollen, er det viktig at forholdet mellom cellene til mikroperler er optimal, som foreslått i protokollen. Utnytte flere mikroperler reduserer renhet og reduserer utbyttet og levedyktighet av isolerte celler. Dersom andre enn de som er presentert i protokollen overflatemarkører anvendes for progenitor undergruppe isolasjon, må det optimale forholdet av celler til mikroperler bestemmes.
Magnetisk mikro basert isolering av gp38 + CD133 - befolkningen
Følg fremgangsmåten i del 5. I trinn 5.3 legger i tillegg 10 mL anti-CD133 + mikroperler, så følg trinn 5, 6.2 og 6.3 som beskriverd.
Beregning absolutte celle tall
Leveren vekt brukes til å beregne hvor mange celler av et bestemt delsett er til stede per gram levervev.
(% Av en undergruppe i levende celler (basert på flowcytometri) / 100) x total levende celle nummer isolert fra leveren stykke = Z
(1 / vekt av lever stykke) x Z = celle nummer / g levervev
Andre cellepopulasjoner som kan bli isolert sammen med denne metoden
Det er mulig å isolere de følgende leverceller ved hjelp av denne fordøyelse protokollen: CD45 + celler (eller subpopulasjoner av hematopoetiske celler, f.eks Kupffer-celler, dendrittiske celler, T-celler, NK-celler, etc.) og LSECs. Fordøyelsen protokollen er ikke egnet for isolering av hepatocytter eller leverstel celler. Disse cellene er til stede i forholdsvis lave celletall og de viser redusert levedyktighet i forhold til other tilgjengelige metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Alexander von Humboldt Foundation Sofja Kovalevskaja Award til VLK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
- Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
- Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
- Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
- Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
- Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
- Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
- Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
- Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
- Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
- Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
- Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
- Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
- Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
- Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).
