Summary
Leberschädigungen durch Vorläuferzellexpansion begleitet, die eine heterogene Zellpopulation darstellt. Neuartige Klassifizierung dieses Zellkompartiment ermöglicht die Unterscheidung von mehreren Untergruppen. Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse und hoher Reinheit Isolierung verschiedener Untermengen, die für die weiteren Tests verwendet werden kann.
Abstract
Bei chronischen Leberschädigungen, erweitern Vorläuferzellen in einem Prozess ductularen Reaktion genannt, die auch das Auftreten von entzündlichen Zellinfiltrat und epithelialen Zellaktivierung zur Folge hat. Die Vorläuferzellpopulation während eines solchen Entzündungsreaktionen hat meist worden Markern einzigen Oberfläche untersucht, entweder durch die histologische Analyse oder mittels Durchflusszytometrie-basierte Techniken. Allerdings neuartige Oberflächenmarker verschiedene funktionell unterschiedliche Teilmengen innerhalb der Leber Vorläufer identifiziert / Stammzellfach. Die hier vorgestellten Verfahren beschreibt die Isolierung und detaillierte Durchflusscytometrieanalyse von Vorläuferuntergruppen neuartige Oberflächenmarker-Kombinationen. Darüber hinaus zeigt es, wie die verschiedene Vorläuferzelluntergruppen mit hoher Reinheit mit automatisierten magnetischen und FACS-Sortierung-basierten Methoden isoliert werden. Wichtig ermöglicht, neuartige und vereinfachte enzymatische Dissoziation der Leber für die Isolierung dieser seltenen Zellpopulationen mit hoher Rentabilitätdass überlegen ist im Vergleich zu anderen bestehenden Methoden. Dies ist besonders relevant für die weitere Vorläuferzellen in vitro zu studieren oder hochwertige RNA zur Isolierung des Genexpressionsprofil zu analysieren.
Introduction
Leberregeneration wird meist mit der Selbsterneuerungskapazität von Hepatozyten verbunden. Dennoch treten chronische Leberverletzungen mit Progenitorzellen Aktivierung und Expansion, die mit ihrer Fähigkeit in Verbindung gebracht wurden in Hepatozyten und Cholangiozyten 1, 2, 3, 4 zu unterscheiden. Dies ist besonders relevant, da während der chronischen Verletzungen, Hepatozytenproliferation nicht wirksam ist. Trotz mehrerer Studien genetische Tracing Vorläuferzellen Targeting, ihre Rolle bei der Leberregeneration bleibt umstritten 5, 6, 7, 8. Darüber hinaus hat die Aktivierung von Vorläuferzellen wurden zu einer erhöhten fibrotische Reaktion in der Leber verbunden sind , die während Verletzungen Fragen über ihre genaue Rolle 9 wirft, 10.
Die heterogene Natur des Vorläuferzellkammer ist seit langem von Genexpressionsstudien vorgeschlagen worden , die Vorläuferzellen isoliert eine einzelne Oberflächenmarker exprimieren Mikrodissektion oder Zellsortierung-basierten Methoden 1, 11. Tatsächlich, die vor kurzem eine neuartige Oberflächenmarker Kombination mit gp38 (podoplanin) eindeutig vorherige einzelne Marker der Vorläuferzellen zu verschiedenen Untergruppen 12 verbunden. Wichtig ist , dass nur diese Teilmengen nicht in ihrer Oberflächenmarker Ausdruck unterschieden , sondern auch funktionelle Veränderungen bei Verletzungen 12 ausgestellt.
Mehrere Tiermodelle wurden verwendet, um Vorläuferzellaktivierung und die Leberregeneration untersuchen. Es scheint , dass die verschiedenen Arten von Verletzungen , die Aktivierung verschiedener Untergruppen von Vorläuferzellen 12 zu fördern. Dies könnte die ph erklärenenotypic Divergenz der ductularen Reaktion beim Menschen beobachteten 4. Somit sind die komplexen phänotypische und funktionelle Analysen von Vorläuferzellen Schwenk ihre Rolle bei Verletzungen und die wahre Bedeutung der ductularen Reaktion in Lebererkrankungen zu verstehen.
Neben Oberflächenmarker Kombinationen, erschweren die entscheidenden Unterschiede in der Zellisolierung Protokolle weiter die Basis Schlussfolgerungen zu früheren Studien 2. Eine wesentliche Menge von Studien angesprochen , die Rolle von Vorläuferzellen , die in ihrem Isolierungsprotokoll (zB Leber Dissoziation (Enzymkombination und der Dauer des Prozesses), Dichte Medium und Zentrifugation Geschwindigkeit) stark unterscheiden 2. Eine optimierte Isolationstechnik, eine bessere Rentabilität für seltene Zellpopulationen und reflektierende Teilmenge Zusammensetzung, wurde vor kurzem 12 entwickelt und veröffentlicht. Das Ziel dieses Artikels ist es, eine det zu schaffenailed Protokoll dieser Leberzellisolierungsverfahren und der Teilmenge Analyse für die korrekte Wiedergabe der Technik zu ermöglichen. Zusätzlich weist das Protokoll einen Vergleich mit dem vorherigen Isolierungsverfahren, die Unterschiede zu zeigen, im Vergleich zu dem neuen Protokoll.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren wurden mit der Zustimmung der Ethik und Tierpflegegremien von Homburg University Medical Center durchgeführt.
1. Herstellung von Materialien und Puffer
- Frisch herstellen alle Puffer für Leber Verdauung erforderlich unter Verwendung von sterilen Komponenten und eine laminare Haube bakterielle Kontamination zu vermeiden.
- Bereiten Sie die Sammelpuffer (CB) von 49,5 ml RPMI-Medium gemischt und 0,5 ml fötales Rinderserum (FBS; niedrig Endotoxin, hitzeinaktiviert) mit einer 1% (v / v) Lösung zu erreichen. Bewahren Sie die Lösung auf Eis bis zur weiteren Verwendung.
HINWEIS: Etwa 25 ml CB ist notwendig, eine ganze Leber zu verdauen. - Bereiten Sie den Verdauungspuffer (DB) unter Verwendung der folgenden Zutaten: RPMI-Medium, 1% (v / v) FBS (niedrige Endotoxin, Hitze inaktiviert), Kollagenase P (0,2 mg / ml), DNase-I (0,1 mg / ml) und Dispase (0,8 mg / ml).
HINWEIS: Etwa 25 ml DB ist notwendig, eine ganze Leber zu verdauen. Pre-warm die DB in ter 37 ° C Wasserbad vor dem Gebrauch. - Rekonstituieren die Enzyme bei der Ankunft in Hanks 'ausgeglichener Salzlösung (HBSS; collagense P und Dispase) oder in DNase-I - Puffer (50% (v / v) Glycerin, 1 mM MgCl 2 und 20 mM Tris-HCl; pH 7,5) Aliquotierung, es, und speichern sie sie bei -20 ° C. Bewahren Sie die DNase-I bei 4 ° C Puffer und verwenden Sie es innerhalb von zwei Monaten.
2. Herstellung von Liver Einzelzellsuspension
- Euthanize unbehandelten Wildtyp-Mäuse durch Genickbruch in Übereinstimmung mit den lokalen Ethik und Tierpflegegremien.
- Legen Sie die Mäuse auf einer Dissektion Bord und nass das Fell mit 70% Ethanol. Mit einer Schere, öffnen Sie den Bauch mit einem Mittelschnitt der Haut, gefolgt von einem Y-Schnitt in Richtung der Extremitäten. Öffnen Sie das Peritoneum mit dem Brustbein nach oben mit der Schere. Um die Leber zu entdecken, verdrängen den Darm sanft auf der rechten Seite mit einem Wattestäbchen.
- Mit Hilfe von Schere und Pinzette, entfernen Sie die Leberlappen,so dass die Gallenblase hinter und Kontamination mit Bindegewebe zu vermeiden. Wiegen Sie die Leber und legen Sie es auf Eis in einer Petrischale mit HBSS.
- Legen Sie die Leberlappen auf einer trockenen Petrischale und schneiden Sie das Lebergewebe in homogene Würfel etwa 2 mm eine Seite mit einem Skalpell. Übertragen Sie die Stücke in einen 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen.
- In 2,5 ml DB an den 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen die Leberstücke enthalten, und legen Sie sie in einem 37 ° C Wasserbad die Verdauung (eine gesunde Leber nimmt 60-70 min und einer Leberzirrhose dauert 80-90 min zu starten ).
HINWEIS: Wenn eine gesamte Leber verdaut wird, sollte die Leber in zwei 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen getrennt werden gute Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten. - Bereiten Sie einen neuen 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen freigegeben Leberzellen zu sammeln. Legen Sie ein Polyamid 100 um Filtergewebe auf der Oberseite des Rohres und benetzt das Netz mit 800 & mgr; l von CB. Legen Sie die konische Zentrifugenröhrchen auf Eis.
- Mischen Sie die samsätze im 37 ° C warmen Wasserbad nach 5 und 10 Minuten, um durch Schütteln des 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen, das die Leberstücke die Verdauung zu unterstützen.
- 15 min nach der Verdauung beginnt, vorsichtig mischen die Leberstücke unter Verwendung einer 1000-ul-Pipette mit einem Schnitt Spitze, die die Leberstücke ermöglicht durch leicht passieren. Die Röhrchen wieder in das Wasserbad und lassen Sie die Stücke für 2 min absetzen.
- Entfernen Sie den Überstand mit den disseminierten Zellen enthält (in der Regel 700 & mgr; l 2x) und fügen Sie ihn in die Röhre, hergestellt in Schritt 2.6. Ersetzen Sie den abgenommenen mit DB (2x 700 & mgr; l) und legen Sie es wieder in den 37 ° C warmen Wasserbad.
- Wiederholen Sie das Verfahren beschrieben in Schritt 2.8 (typischerweise bei 30, 40, 50, 55 und 60 min), bis etwa 60-70 min seit dem Start der Aufschluss bestanden haben. Ab 40 min ab, sollten die verbleibenden Leber Stücke klein genug sein, durch eine ungeschnittene 1000 ul Pipettenspitze zu übergeben.
HINWEIS: Gesunde Leber ist DIGEvoll sted innerhalb von 60 bis 70 min, während in der Regel fibrotischen Leber 80-90 min benötigt. Von diesem Zeitpunkt sollte das Lebergewebe in dem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen nicht sichtbar sein, um die Leberstücke enthalten, und alle freigesetzten Zellen sollten in das Rohr in Schritt 2.6 hergestellten übertragen werden. - Am Ende der Verdauungsprozess, sammelt die Zellen und zentrifugieren für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
- Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Die Reaktion durch Zugabe von 5 ml CB, und dann zentrifugiert werden die Zellen für 8 min bei 180 × g und 4 ° C (mit reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2). Resuspendieren der Zellen in 4 ml CB und speichert sie auf dem Eis. Zählen Sie die Zellen, wie in Schritt 3 beschrieben.
HINWEIS: Das Zellpellet wird lose und daher wird der Überstand entfernt pipettiert anstelle dekantiert zu werden.3. Bestimmung der Zellzahl unter Verwendung Flow Cytometry
Hinweis: Für die Zellzahl zu bestimmen, eine automatische Zellzähler oder idealerweise die Durchflusszytometrie-basierte Zell Quantifizierung unten statt der klassischen Neubauer-Kammer-Methode auf Basis vorgeschlagen beschrieben. Die Leber Einzelzellsuspension in Schritt 2 beschrieben, enthält parenchymalen und nicht-parenchymalen Zellen (NPC) mit sehr unterschiedlichen Größen und Körnungen. Die richtige Ausschluss von Zelltrümmern zusammen mit dem Gating-On - Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung (FSC-SSC) charakteristisch für NPCs , wenn Durchflusszytometrie unter Verwendung sichert den Erfolg des beschriebenen Protokoll 12.
- Bereiten eines Aliquots der Leberzellsuspension (20 & mgr; l) und füge 174 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und 6 & mgr; l von Propidiumiodid (PI; Endkonzentration 0,375 & mgr; g / ml). Hinzufügen Zählen Perlen, die für die Quantifizierung der Zellen ermöglichen.
- Tor auf SSC-A-FSC-A Schutt zu vermeiden und weitere Dubletten auszuschließen mit FSC-H und FCS-A.
Hinweis: Es ist wichtig , dass die Gating - Strategie dargestellt in Abbildung 2 zu folgen. - Tor aus PI-positive toten Zellen, messen 30 & mgr; l aus Ihren Proben, und die Ereignisse aufzeichnen. Folgen Sie den Richtlinien des Herstellers, die Zellzahl zu berechnen.
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 4 für die Durchflusszytometrie Messung, Schritte 5 und 6 für die magnetische Basis Vorläuferzellisolierung und die Schritte 7 für die Durchflusszytometrie Art von Vorläufer Subpopulationen.
4. Anfärbung der Leber Einzelzellsuspension für die Fow Cytometry Analysis of Progenitor Subsets
Antikörper Klon Host / Isotype Stock Konzentration [mg / ml] Verdünnung CD64 X54-5 / 7.1 Mouse IgG1, κ 0,5 1: 100 CD16 / 32 93 Ratten-IgG2a, λ 0,5 1: 100 CD45 30-F11 Ratte IgG2b, κ 0,2 1: 200 CD31 MEC13.3 Ratten-IgG2a, κ 0,5 1: 200 ASGPR1 Polyklonalen Ziege IgG 0,2 1: 100 Podoplanin 2001.01.08 Syrian Hamster IgG 0,2 1: 1.400 Podoplanin 2001.01.08 Syrian Hamster IgG 0,5 1: 1.400 CD133 Mb9-3G8 Ratten-IgG1 0,03 3 ul CD133 315-2C11 Ratten-IgG2a, λ 0,5 1: 100 CD34 RAM34 Ratten-IgG2a, κ 0,5 1: 100 CD90.2 53-2,1 Ratte IgG2, κ 0,5 1: 800 CD157 BP-3 Maus-IgG2b, κ 0,2 1: 600 EpCAM G8.8 Ratten-IgG2a, κ 0,2 1: 100 Sca-1 D7 Ratten-IgG2a, κ 0,03 10 & mgr; l Maus-IgG2b, κ MPC-11 0,2 Ratten-IgG1 RTK2071 0,2 Ratte IgG2b, κ RTK4530 0,2 Ratten-IgG2a, κ RTK2758 0,5 Ratten-IgG2a, κ RTK2758 0,2 Syrian Hamster IgG SHG-1 0,2 Syrian Hamster IgG SHG-1 0,5 Normale Ziege IgG Kontrolle Polyklonalen Ziege IgG 1 Esel anti-Ziege IgG Donkey IgG 2 1: 800 Streptavidin 1 1: 400 Tabelle 1.
Antikörper 1 2 3 4 5 CD45 APC / Cy7 Ratte IgG2b, κ
0,5 ul+ + + + CD31 Biotin + Ratten-IgG2a, κ
0,5 ul+ + + ASGPR1 gereinigt + + Normale Ziege IgG Kontrolle
0,2 ul+ + Podoplanin APC + + + Syrian Hamster IgG
1 ul einer 1.14 Dilution+ CD133 PE + + </ Td> + + Ratten-IgG1
0,45 & mgr; lEsel anti-Ziege
Alexa Fluor 488+ + + + + Streptavidin
Alexa Fluor 405+ + + + + Tabelle 2.
- Platzieren eines Aliquots der Zellsuspension aus Schritt 2.11 in ein Reaktionsrohr (1,5 ml) , die 2,5 x 10 5 Zellen, bestimmt , wie in Schritt 3 beschrieben.
- Zentrifugation der Zellen für 3 min bei 300 xg und 4 ° C unter Verwendung einer Mikrozentrifuge.
HINWEIS: An diesem Punkt kann eine Vakuumpumpe verwendet werden, um den Überstand vorsichtig entfernen. - Zellpellet in Fc-Block-Mix und Inkubation für 5 min auf Eis. Bereiten Fc-Block-Mix mit einem Gesamtvolumen von 50 & mgr; l pro Fleck. 10 & mgr; l FcR-Blockierungsreagenz, 1 & mgr; l gereinigtem anti-CD64 (1: 100; 0,5 ug / Fleck) und 40 & mgr; l Färbepuffer (ST Puffer: HBSS, 1% (v / v) FBS und 0,01% Natriumazid) pro Fleck.
HINWEIS: Natriumazid ist hochgiftig. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, wie Nitril Handschuhe, Labormantel, und eine Gesichtsmaske. - Zugabe von 50 & mgr; l zu den Zellen (das Gesamtvolumen der Zellen ist nun zu 100 & mgr; l) und Inkubieren der Zellen mit der Antikörpermischung, vor Licht geschützt und 20 min auf Eis Anfärben Mischung.
- Bereiten Sie die Antikörper-Mix mit einem Gesamtvolumen von 50 & mgr; l pro Fleck. Für 50 ul ST-Puffer, fügen Sie die folgenden konjugierte Antikörper für die Grundfärbung: CD45 (0,5 & mgr; l, 1: 200; 0,1 ug / Fleck), CD31 (0,5 & mgr; l, 1: 200; 0,25 ug / Fleck), ASGPR1 (1 & mgr; l ; 1: 100; 0,2 ug / Fleck), podoplanin (1 ul einer 1.14 Verdünnung; 1: 1400 Ende Verdünnung; 0,014 g / Fleck) und CD133 (3 & mgr; l; 0,09 ug / Fleck).
HINWEIS: Tabelle1 fasst die Antikörperklone und Verdünnungen für Grund Flecken genutzt und zusätzliche Oberflächenmarker der verschiedenen Untergruppen. Bereiten zusätzliche Zellsuspensionen für die Antikörpermischung , die entsprechenden Isotypkontrollen und / oder Fluoreszenz minus einer Kontrollen (RGV), wie in Tabelle 2 dargestellt. - In 400 ul ST Puffer zu jeder Probe und zentrifugiert werden die Zellen für 4 min bei 300 g und 4 ° C.Discard den Überstand und resuspendieren Zellen in 100 ul sekundären Antikörper Mischung, die 0,125 ul Esel-Anti-Ziegen-IgG (1: 800; 0,25 ug / Fleck) und 0,25 ul fluoreszenz konjugiertem Streptavidin (1: 400; 0,25 ug / Fleck) in 100 & mgr; l Puffer ST.
- Inkubieren Sie die Zellen während vor Licht geschützt und mit dem Antikörper-Mix für 20 Minuten auf Eis. In 400 ul ST Puffer zu jeder Probe und zentrifugiert werden die Zellen für 4 min bei 300 g und 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 300 & mgr; l ST Buffer enthält 0,25 & mgr; g / ml PI.
HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellen von Vorläuferzellen verringert sich mit der Zeit; Daher wird vorgeschlagen, so schnell wie möglich frische Proben zu messen.
5. Magnetische Microbead-basierte Anreicherung von Progenitorzellen
- Transfer eines Aliquots der Einzelzellsuspension Leber enthaltend 1,5-2 x 10 6 Zellen, bezogen auf die Zellzahl bestimmt , wie in Schritt 3 in ein neues 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen beschrieben.
- Zentrifugation der Zellen für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
HINWEIS: In der Regel eine gesunde C57BL / 6-Mausleber (oder 1 g Lebergewebe) müssen in drei 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen getrennt werden. - Resuspendieren der Zellen in 400 & mgr; l HBSS 0,5% (v / v) Rinderserumalbumin (BSA) und füge 40 ul anti-CD31-Microbeads und 30 & mgr; l anti-CD45-Microbeads. Inkubieren der Zellen für 15 min bei 4 ° C.
HINWEIS: Überschreiten Sie nicht ter Inkubationszeit, da die Reinheit der Trennung wird deutlich reduziert werden. - 5 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA zu den Zellen und zentrifugieren für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
- Zellpellet in 100 ul von toten Zellentfernung Perlen und brüten sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit eine LS Trennsäule herzustellen und mit 3 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA kalibrieren.
Hinweis: Die Inkubationszeit nicht überschreiten, da die Reinheit der Trennung wird deutlich reduziert werden. - Hinzufügen 900 & mgr; l HBSS 0,5% (v / v) BSA zu den Zellen, filtern sie 100 um Polyamid Filtergewebe verwenden und laden sie auf dem LS-Trennsäule.
HINWEIS: Legen Sie eine ganze Leber auf einer LS Trennsäule. - Die Säule wird dreimal mit 3 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA und sammeln den Durchfluss.
- Zentrifugieren Sie die Durchfluss für 8 min bei 180 × g und 4 ° C (mit reduziertem Zubeschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
- Resuspendieren des Pellets Zelle entweder in Spülpuffer (RB) (PBS und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)), enthaltend 0,5% (v / v) BSA oder ST-Puffer, je nach der weiteren experimentellen Verfahren.
6. Magnetische Microbead-basierte automatisierte Zellreinigung von Progenitor-Zell-Populationen aus mehreren Livers Kombinierte
HINWEIS: Da Zellvorläuferuntergruppen seltenen Zellpopulationen darstellen, ist Zellen aus mehreren Leber kombiniert häufig benötigt ausreichende Zellzahlen für weitere Experimente zu erreichen. Als ein Beispiel, CD133 + und gp38 + Zelltrennung wird unten beschrieben.
- Isolierung von CD133 + Vorläufern
- Nach dem Schritt 5.9, die Zellen zählen, wie in Schritt 3 beschrieben, und resuspendieren bis 10 6 Zellen in 100 & mgr; l von RB (typischerweise 4-6 gesunde Leberproben Pooling).
- Hinzufügen anti-CD64 1: 100 und anti-CD16 / 32 1: 100 zu den Zellen und incubaß sie für 5 Minuten auf Eis. 1: 100 Anti-CD133 biotinylierte Antikörper an die Zellen und Inkubation sie auf Eis für weitere 10 min.
- 5 ml RB und zentrifugieren für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
- Resuspendieren der Zellen in 400 & mgr; l von RB und dann werden 10 & mgr; l anti-Biotin-Mikrokugeln. Inkubieren der Probe für 15 min bei 4 ° C. Nicht die Inkubationszeiten überschreiten, da dies die Reinheit der Proben reduziert.
- 5 ml RB und zentrifugieren für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2). Resuspendieren des Pellets in 1 ml RB.
- Isolierung von gp38 + Vorläufern
- Nach dem Schritt 5.9, die Zellen zählen, wie in Schritt 3 beschrieben, und resuspendieren bis 10 6 Zellen in 100 & mgr; l von RB (typischerweise 4-6 gesunde Leberproben Pooling).
- Hinzufügen anti-CD64 1: 100 und anti-CD16 / 32 1: 100 zu den Zellen und inkubiere sie auf Eis für 5 min. Als Nächstes fügen Sie 1:100 anti-gp38-Antikörpers an die Zellen biotinyliert und für weitere 10 min auf Eis inkubieren.
- 5 ml RB und zentrifugieren für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
- Resuspendieren der Zellen in 400 & mgr; l von RB und mit 5 & mgr; l anti-Biotin-Mikrokugeln. Inkubieren der Probe für 15 min bei 4 ° C. Nicht die Inkubationszeiten überschreiten, da dies die Reinheit der Proben reduziert.
- 5 ml RB und zentrifugieren für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
- Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml RB.
- Gemeinsame Schritte nach dem Schritt 6.1 oder 6.2
- Legen Sie die 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen, die magnetisch markierte Zellsuspensionen auf einer Kühl 5-Rack mit zwei zusätzlichen Leerrohre zum Sammeln der positiven und negativen Fraktionen enthalten. Legen Sie die Chill-Rack auf die Trennplattform des Separators.
- Verwenden Sie die positive Auswahlprogramm(Possel_d2) mit einem umfangreichen Waschschritt zwischen jeder Probe (rinse-Option).
HINWEIS: column basierte manuelle Trennung von Zellen anstelle des automatischen Separators wird die Reinheit der Probe zu verringern. - Sammeln Sie die positive Fraktion und Zentrifuge für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
- Resuspendieren des Zellpellets entweder in RB oder ST-Puffer, je nach der weiteren experimentellen Verfahren.
- Für eine Reinheitskontrolle, ein Teil der Zellen nehmen und sie färben, wie in Schritt 4 beschrieben.
7. Durchflusszytometrie Zellsortierung
ANMERKUNG: Eine hochreine Sortierung jeder Vorläuferzelle Teilmenge konnte mit dem Protokoll im folgenden beschrieben erreicht. Die Gesamtausbeute an Zellen ist viel geringer als die in Schritt 6 beschrieben ist, und ist am besten für die Genexpressionsanalyse.
Parameter Rahmen Düsengröße 85 & mgr; m Frequenz 46,00-46,20 Amplitude 38,30-55,20 Phase 0 Tröpfchenverzögerungs 28,68-28,84 Dämpfung Aus First Drop 284-297 Ziel Gap 9.-14 Druck 45 psi Tisch 3.
- Erwerben Zellen, die aus dem Magnetbasis Anreicherung (beschrieben in Schritt 5); zählen sie, wie in Schritt 3 beschrieben; und färben sie für Vorläufermarker (CD133, gp38), CD31, CD45 und ASGPR1, wie in Schritt 4 erläutert.
- Bereiten Sie Sortiermedium (SM): Phenol-Rot frei Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 0,5% (v / v) BSA und 0,01% (v / v) Natriumazid. Resuspendieren der gefärbten Zellen in SM, übertragen sie in eine Polypropylen-Rundbodenrohr und legen Sie sie auf Eis.
HINWEIS: Natriumazid ist hochgiftig. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, wie Nitril Handschuhe, Labormantel, und eine Gesichtsmaske. Nicht Natriumazid verwenden, wenn die sortierten Zellen für funktionelle Assays verwendet werden. - Verwenden Sie die entsprechende Software für die Art von Sortierer für die Zellisolierung verwendet. Öffnen Sie die Software und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, die Sortierparameter und Maschinenspezifikationen einzurichten.
HINWEIS: Die Maschinenspezifikationen zusammengefasst sind in Tabelle 3. Während Maschinenspezifikationen an verschiedenen Institutionen anders sein könnte, ist es wichtig, dass die Reduzierung der Sortier Druck zu beachten und eine größere Düsengröße erforderlich ist (45 psi und 85 & mgr; m Düse), um die Lebensfähigkeit der Vorläuferzelle zu erhöhen populatIonen und die Qualität der RNA aus den sortierten Zellen hergestellt. Es ist wichtig, angereichert Lebervorläuferzellen zu verwenden, um den Ausgleich zu setzen. Andere Leber oder Leukozyten-Populationen haben unterschiedliche Autofluoreszenz und führen zu einer suboptimalen Lösung der Stroma-Bevölkerung und in einer falschen Gating-Strategie. - Kalibrieren Sie die Maschine und legen Sie eine 5-ml-Polypropylen-Rundboden-Röhrchen 350 ul SM in der Sortiersammelvorrichtung enthält. Starten Probenerfassung und Sortierung. Sammeln Sie 1.000 Veranstaltungen der Subpopulation und stoppen Sie den Probenstrom.
- Nehmen Sie den Schlauch aus der Sortiereinrichtung und messen die sortierten Zellen auf dem Durchflusszytometer. Identifizieren Sie den Prozentsatz der sortierten Zellpopulation unter den lebenden Zellen. Dieser Prozentsatz gibt die Reinheit der sortierten Zellen.
- Wenn Art Reinheit 95% übersteigt, legen Sie ein 5-ml-Polypropylen-Rundboden-Röhrchen 350 & mgr; l RLT Lysepuffer in der Sortiersammelvorrichtung enthält.
- Starten Sie die Art und sammeln 7,000-10.000 Ereignisse pro Stromatumoren Subpopulation.
- Übertragung der RLT Lysepuffer die sortierten Zellen in einer DNase- und RNase-freie Reaktionsrohr und lagern die Proben bei -80 ° C bis zur weiteren Analyse enthält.
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Representative Results
Das Verfahren hier für die Verdauung der Leber präsentiert ein neuartiges Gemisch aus Enzymen führt zu einer Einzelzellsuspension mit parenchymalen und nicht-parenchymalen Leberzellen (1 und 2a) verwendet wird . Nach dem ACK-Lyse von roten Blutzellen ist die direkte Durchflusszytometrie - Analyse der Einzelzellsuspension möglich (1 und 2). Die Gating - Strategie beinhaltet den Ausschluss von Dubletten und toten Zellen (Abbildung 2a). Die Zellen, die negativ sind für CD45, CD31 und ASGPR1 sind gated. Diese Population umfasst die Vorläuferzellen der Leber und kann basierend auf ihrer gp38 und CD133 - Expression (Abbildung 2a) gruppiert werden. Die gp38 + CD133 + und die gp38 - CD133 + Zellen repräsentieren die am häufigsten vorkommende Zellpopulationen unter CD45 - CD31 - ASGPR1 - Zellen im gesunden erwachsenen Maus Liver (2a, b). Diese Untergruppen unterscheiden sich in der Expression von zusätzlichen Oberflächenmarker zuvor mit Vorläuferzellen assoziiert sind , wie EpCAM, Sca-1 und CD34 (Abbildung 2c).
Vorläuferzellen können von hämatopoetischen und parenchymalen Zellen, wie Hepatozyten und Leber sinus Endothelzellen (LSECs) (1 und 3) aufgebraucht werden und Vorläuferzellen weiter gereinigt mit magnetischen Mikrokügelchen basierende Isolation (Abbildung 3a, b) oder mit könnte hochreine Sortierung (Figuren 1 und 4). Die magnetische Mikrokügelchen basierende Isolierung von CD133 + oder gp38 + Zellen zu mehr als 90% Reinheit (Abbildung 3a, b) in Bezug auf alle kontaminierenden CD45, CD31 oder ASGPR1 + Zellen, und die Zellen bleiben hoch lebensfähig (3a, b).
2 unterscheiden. Dies ist besonders relevant für die Wahl der Enzymmischung für Gewebedissoziation verwendet. Hier Kollagenase P anstelle von Kollagenase D wurde für die Leber 1, 2, 8 verwendet. Wichtig ist , dass die Expression von CD133 auf Vorläuferzellen und die Ausbeute an isolierten Zellpopulationen stark in der Gegenwart von Kollagenase D reduziert (5a, b). Zusätzlich dazu haben unsere Mischung enthielt Dispase, die zur schonenden Disaggregation und Subkultivierung von verschiedenen Zelltypen 13 gut geeignet ist. Kollagenase P zusammen mit Dispase darstellteine ideale Kombination für Zelldissoziationsmedium der Leber für Vorläuferzellanalyse. Diese Kombination wurde auch überlegen Trypsin oder Pronase-basierten Verdau der Leber (Daten nicht gezeigt). Ebenso wichtig ist es , dass die Dichte der Zentrifugation, wie Percoll-Anreicherungs 2, 14, zu beachten war nicht erforderlich , dass der Vorläufer in diesem Protokoll vorgestellt Analysen.
Abbildung 1: Workflow des beschriebenen Protokolls. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Neue Klassifizierung der Lebervorläuferuntergruppen. Eine EinzelzelleSuspension wurde von gesunden Leber hergestellt und anschließend mit einer Gruppe von Oberflächenmarker gefärbt: CD45, CD31, CD133 und gp38 (A). Für tote Zelle Ausgrenzung, Propidiumiodid (PI) wurde verwendet. Repräsentative Dot-Plots mit der Gating-Strategie dargestellt. Die Tore für die Durchflusszytometrie Zellzahlbestimmung verwendet werden, auch gekennzeichnet. (B) Die Prozentsätze und die absolute Anzahl der vorhandenen Zellen pro g Lebergewebe der verschiedenen Stroma - Zelluntergruppen unter den CD45-negativen Zellen in Wildtyp unbehandelten Tieren sind gezeigt. (C) Die Histogramme zeigen Scheidungsmarkereigenschaften von Stroma - Zell - Subpopulationen in einer gesunden Leber. Hohe Expression von CD90.2 und die Gegenwart von CD157 sind spezifisch für A, während CD34 spezifisch für Subpopulation ist B. Sca-1 vorhanden ist, in B, C, D und EpCAM ist nur in Population C und D. Mittelwert ± SEM; die Daten (AC) repräsentieren 2-3 unabhängigen Experimenten mit n = 3-4 pro Experiment. Die Daten were verglichen einem ungepaarten, zweiseitigen T - Test * P mit <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0001. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Magnetische Mikrokügelchen basierende Anreicherung und automatisierte Zellreinigung. (A) Magnetische Mikrokügelchen basierende Anreicherung von CD45 -, CD31 - und ASGPR1 - Zellen werden vor und nach Anreicherung dargestellt. (B) Repräsentative Dot - Plots der automatisierten Mikrokügelchen basierenden Zellisolationen für CD133 + und gp38 + -Zellen dargestellt, auf der linken Seite. Auf der rechten Seite sind die Lebensfähigkeit der Zellpopulationen vor und nach der Anreicherung als Prozentsatz dargestellt vonPropidiumiodid (PI) -negativen Zellen. Mittelwert ± SEM; die Daten (AB) repräsentieren drei unabhängige Experimente mit n = 3 pro Experiment. Die Daten wurden unter Verwendung eines ungepaarten verglichen, two-tailed T - Test * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0001. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Durchflusszytometrie Art von Vorläuferuntergruppen mit hoher Reinheit. Dot Plots zeigen die Reinheit der Zellpopulationen in den sortierten Proben (Post-Sortierung). Die Daten repräsentieren drei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Figur 5: Vergleich der Verdauungsenzyme. Die Einzelzellsuspension wurde Kollagenase P unter Verwendung oder Kollagenase D (1 mg / ml + DNase-I 0,1 mg / ml) von gesunden Lebern (wie in Schritt 2 beschrieben), und wurde anschließend mit einer Gruppe von Oberflächenmarker gefärbt: CD45, CD31, CD133 und gp38 (A). Die Prozentsätze von Zellen, die pro g Lebergewebe der verschiedenen Stroma-Zelluntergruppen unter den CD45-negativen Zellen in Wildtyp unbehandelten Tieren sind gezeigt. (B) Die mittlere Fluoreszenzintensität von CD133 ist für die CD133 + Zellpopulation gezeigt. Mittelwert ± SEM; die Daten (AB) repräsentieren zwei unabhängige Experimente mit n = 3 pro Experiment. Die Daten wurden unter Verwendung eines ungepaarten verglichen, two-tailed T - Test * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0001.target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Leberentzündung und Verletzung verschiedener Herkunft auslösen regenerative Prozesse in der Leber , die durch zwei Vorläuferzellexpansion und Aktivierung begleitet werden, 3. Diese Lebervorläuferzellen besitzen Zelleigenschaften stammen und wahrscheinlich eine bedeutende Rolle in der Pathomechanismus verschiedener Lebererkrankungen spielen.
Die Heterogenität der Leber Vorläuferzellen ist seit langem vorgeschlagen worden. Die Neubewertung von Untergruppen Lebervorläufer eine neuartige Oberflächenmarker Kombination von CD133 und gp38 unter Verwendung von Untergruppen identifizieren konnten , die verschiedene Oberflächenmarker tragen und eine einzigartige Reihe von entzündungsbedingten Gene während der Leberschädigung 12 auszudrücken. Das hier beschriebene Verfahren erlaubt die direkte Durchflusszytometrie-Analyse von seltenen Zellen und deren direkten Vergleich in verschiedenen Leberschädigung Modellen. Dies ist besonders relevant, da verschiedene Verletzungen, die Aktivierung von mehreren Vorläufer s triggernubsets , die 3, reflektierendes der 4 in ductularen Reaktionen beobachtet zellulärer Heterogenität könnte, 11, 12. Bemerkenswerterweise ist ein kleiner Bruchteil murine Lebergewebe (0,2 g) genügend genügend Zellen für die Flusszytometrie-Analyse von Vorläufern zu isolieren, die beschriebene Methode verwendet.
Durchflusszytometrie Sortierung hoher Reinheit Populationen der Subsets Bereitstellung ist notwendig, um ihre einzigartigen Genexpressionsprofile zu erkunden. In früheren Berichten beschrieben Durchflusszytometrie basierende Vorläuferzellisolierung 15, 16. Dennoch stellte das Protokoll hier bietet eine optimierte Methode, die die hohe Reinheit und Lebensfähigkeit dieser Zellen gewährleistet. Bemerkenswert ist , in - vitro - Kultivierung und Expansion zuvor beschriebenen Techniken gut mit dem Protokoll hier 15 vorgestellt kombiniert werden können ,
Viele Arten von Durchflusszytometrie Sortierer sind an verschiedenen Institutionen zur Verfügung, und ihre besonderen Instrumentierungen leicht abweichen. Dennoch sind die allgemeinen Grundsätze für die Zellsortierung in dem beschriebenen Protokoll dargestellt. Im Allgemeinen sind ein geringerer Druck und größere Düsengröße unbedingt erforderlich, unabhängig von den Maschinentypen und Spezifikationen. Darüber hinaus kann die Verwendung eines geeigneten Sortiermedium signifikant die Rentabilität und die RNA-Qualität der sortierten Zellen zu erhöhen, die ein wichtiger Faktor ist, insbesondere für Studien der Genexpression. Die Sortierung von Vorläuferzellen jedoch stark reduziert die Lebensfähigkeit der Zellen, und die Ausbeute an Zellen nach der Sortierung ist relativ niedrig (für hochreine Art von 7-10,000 events / Subpopulation, 4-5 gesunde Lebern gebündelt werden müssen). Dies könnte ein begrenzender Faktor für weitere in vitro Analysen sein. Wir schlagen vor , magnetische Mikrobead-basierte Isolierung invitro - Assays wegen der höheren Ausbeute und Lebensfähigkeit der Zellen, und Durchflusszytometrie zur Genexpressionsanalyse Sortieranlage, insbesondere wenn mehrere bestimmte Teilmenge analysiert und Isolationen erforderlich.
Basierend auf der Tatsache, dass die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Durchflusszytometrie Sortier stark reduziert wird, wird eine automatisierte magnetische Mikrokügelchen basierende Isolation von Progenitorzellen wurde hier entwickelt und präsentiert. Es ermöglicht die Isolierung einer größeren Anzahl von Vorläuferzellen mit hoher Reinheit (multiple Lebern Kombination). Darüber hinaus wird die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechterhalten wird, da die Zeit, die für die Isolationsprozess stark verringert. Während geringere Anzahl von Vorläuferzellen können in vitro 1, 2, 15, 16 ausgebaut werden, wird empfohlen , zu betrachten , wie diese in vitro - Manipulationen , die zellulären Eigenschaften von Stamm / Progen verändern könntenitor Zellen für andere mesenchymale Stromazellen und Zellpopulationen 17, 18 beschrieben.
Die wesentliche Einschränkung der dargestellten magnetischen Mikrobead-basierte Isolation ist , dass die CD133 + und die gp38 + Zellpopulationen darstellen heterogenen Zellen. Zusätzliche Oberflächenmarker könnte notwendig sein, kleinere Zellpopulationen zu identifizieren.
Das Verständnis dafür , wie Leberstammzellen und Vorläuferzellen miteinander in Beziehung stehen ist bei weitem nicht vollständig, trotz hervorragender Studien , die von Lola Reid und andere 1, 8, 19. Somit könnte die sorgfältige Prüfung der Techniken führt zu höheren Erträgen und Lebensfähigkeit, wie die hier vorgeschlagen, helfen die Analysen von Vorläuferuntergruppen und das Verständnis ihrer miteinander verbundenen Beziehungen zu erweitern.
Insgesamt haben wir beschrieben ter detaillierte Isolierung und Analyse von Lebervorläuferuntergruppen, die vor kurzem 12 auszeichneten. Darüber hinaus wird durch eine neuartige Enzymkombination verwendet wird, könnte selten Vorläufern durch direkte Messungen der Durchflusszytometrie analysiert werden. Zusätzlich zeigt das Protokoll, wie Vorläuferzellen mit einer hohen Reinheit zu bereichern, entweder Zellsortierung oder eine automatisierte Mikrokügelchens basierte Technik.
Fehlerbehebung:
Der prozentuale Anteil der Zelltrümmer und sterbende Zellen sind hoch
Wenn während der Verdauung (Schritt 2), die dem Pipettieren der Leberproben ist zu hart, der Prozentsatz an Zellen in der Einzelzellsuspension erhöht sterben. Wenn die Leber in größere Stücke geschnitten wird, als vorgeschlagen, ist die Verdauung weniger effizient und führt zu mehr Zelltod während der Herstellung.
Nach Abschluss des Verfahrens in dem Schritt 5 ist die Reinheit der Proben nicht ausreichen
Wenn die percenteile der Zelltrümmer und sind zu hoch in Schritt 2 hergestellten Zellen in der Einzelzellsuspension zu sterben, binden die Mikrokügelchen unspezifisch, und daher wird die Reinheit der Isolation stark reduziert.
Niedrige Zellzahl nach Mikrobead-basierte Reinigung
Für den Erfolg des Protokolls beschrieben, ist es wichtig, dass das Verhältnis von Zellen zu Microbeads optimal ist, wie im Protokoll vorgeschlagen. mehr Microbeads Verwendung reduziert die Reinheit und verringert die Ausbeute und die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen. Wenn Oberflächenmarker andere als die in dem Protokoll vorgestellt werden für Vorläufer Subset Isolation verwendet wird, muss das optimale Verhältnis von Zellen zu Mikrokugeln bestimmt werden.
Magnetische Mikrokügelchen auf Basis Isolierung von gp38 + CD133 - Bevölkerung
Führen Sie die Schritte in Abschnitt 5. In Schritt 5.3 fügen Sie zusätzlich 10 ul anti-CD133 + Mikrokügelchen, dann folgen Sie den Schritten 5, 6.2 und 6.3 als beschreibend.
Die Berechnung absolute Zellzahlen
Das Lebergewicht wird verwendet, um zu berechnen, wie viele Zellen einer bestimmten Teilmenge vorhanden sind pro Gramm Lebergewebe.
(% Der Subpopulation in lebenden Zellen (basierend auf Durchflusszytometrie) / 100) x Zahl Gesamt lebende Zelle aus dem Stück Leber isoliert = Z
(1 / Gewicht der Leber Stück) x Z = Zellzahl / g Lebergewebe
Andere Zellpopulationen, die mit diesem Verfahren isoliert werden kann
Es ist möglich , die folgenden Leberzellen unter Verwendung dieser Verdauung Protokoll zu isolieren: CD45 + Zellen (oder Subpopulationen von hämatopoetischen Zellen, zB Kupffer - Zellen, dendritischen Zellen, T - Zellen, NK - Zellen, etc.) und LSECs. Die Verdauung Protokoll ist nicht geeignet für die Isolierung von Hepatozyten oder hepatischen Sternzellen. Diese Zellen vorhanden sind, bei relativ niedrigen Zellzahlen, und sie zeigen eine verminderte Lebensfähigkeit im Vergleich zu other verfügbaren Methoden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung Sofja Kovalevskaja-Preis an VLK unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
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