Summary
Karaciğer yaralanmaları heterojen bir hücre popülasyonunu temsil progenitör hücre genişlemesi eşlik ediyor. Bu hücresel bölmenin yeni sınıflandırma birden altgruplarının ayırmada sağlar. Burada tarif edilen yöntem, analiz ve başka analizler için de kullanılabilen çeşitli alt-kümelerinin yüksek saflıkta izole sitometri akışı göstermektedir.
Abstract
Kronik karaciğer yaralanmaları sırasında, progenitör hücreler aynı zamanda inflamatuar hücre infiltrasyonu ve epitel hücre aktivasyonu görünümünü gerektirir kanalsal reaksiyon denilen bir süreçle, genişletmek. enflamatuar reaksiyonlar sırasında projenitör hücre popülasyonu çok histolojik analiz ile veya akış sitometri tabanlı teknikler ile, ya tek bir yüzey belirteçleri kullanılarak araştırılmıştır. Ancak, yeni yüzey belirteçleri karaciğer atası içinde çeşitli fonksiyonel olarak farklı alt kümeleri tespit / hücre bölmesini kaynaklanıyor. Burada sunulan yöntem, yalıtım ve yeni yüzey işaretleyici kombinasyonlarını kullanarak progenitör alt kümelerinin sitometri analizi ayrıntılı akışını açıklar. Ayrıca, çeşitli progenitör hücre alt yüksek saflıkta manyetik otomatik kullanılarak ve FACS ayıklama bazlı yöntemler ile izole edilebilir gösterilmiştir. Önemlisi, karaciğer roman ve basitleştirilmiş enzimatik ayrılma yüksek canlılığı bu nadir bir hücre popülasyonlarının izolasyonu sağlardiğer mevcut yöntemlere kıyasla üstündür. Bu da, in vitro projenitör hücreleri incelemek için ya da gen tanımlama profili analiz yüksek kaliteli RNA izole edilmesi için özellikle uygundur.
Introduction
Karaciğer yenilenmesi çok hepatosit kendini yenileme kapasitesi ile ilişkilidir. Bununla birlikte, kronik karaciğer yaralanması ve hepatositlerin cholangiocytes, 1, 2, 3, 4 ayırt etme kabiliyetleri ile ilişkilendirilmiştir progenitör hücre aktivasyonu ve genişleme ile meydana gelir. Kronik yaralanma sırasında hepatosit proliferasyonu etkili değildir, çünkü bu özellikle geçerlidir. Progenitör hücreleri hedef alan çok sayıda genetik izleme çalışmalara rağmen, karaciğer rejenerasyonu rolleri 5, 6, 7, 8 tartışmalıdır. Ayrıca, progenitör hücrelerin aktivasyon yaralanmalarında 9 sırasında tam rolü hakkında sorular ortaya çıkarmaktadır karaciğerde artan fibrotik yanıtı, bağlantılı olmuştur10.
Progenitör hücre bölmesine heterojen doğası uzun mikrodiseksiyon veya hücre sıralama tabanlı yöntemler 1, 11 ile tek bir yüzey işaretleyici ifade eden progenitör hücreler izole edilmiş gen ekspresyon çalışmaları ile öne sürülmüştür. Gerçekten de, en son, yeni bir yüzey markör kombinasyonu kullanılarak gp38 (podoplanin) açık bir şekilde, çeşitli alt-12 progenitör hücrelerin önceki tek belirteçleri bağlandı. Önemlisi, bu alt-gruplar sadece yüzey işaretleyici ifadesinde farklılık değil, aynı zamanda yaralanmaların 12 sırasında işlevsel değişiklikler sergilemiştir.
Çoklu hayvan modelleri progenitör hücre aktivasyonu ve karaciğer rejenerasyonu araştırmak için kullanılmıştır. Çeşitli yaralanma türleri progenitör hücrelerin 12 alt kümelerini farklı aktivasyonunu teşvik gibi görünüyor. Bu ph açıklayabilirİnsanlarda 4 gözlenen kanalsal reaksiyon enotypic sapma. Böylece, progenitör hücrelerin karmaşık fenotipik ve fonksiyonel analizleri kendi yaralanmalarda rolü ve karaciğer hastalıklarında kanalsal reaksiyonun gerçek önemini anlamak için çok önemlidir.
Yüzey işaretleyici kombinasyonları yanı sıra, hücre izolasyonu protokolleri önemli farklılıklar daha önceki çalışmalarda 2 dayanarak sonuçları zorlaştırıyor. Bazı çalışmalar, önemli miktarda büyük ölçüde izole protokolünde farklıdır progenitör hücreler (örneğin, karaciğer ayrılma (enzim kombinasyonu ve işlemin süresi), yoğunluk, orta ve santrifüj hızı) rolünü ele 2. Optimize edilmiş izolasyon tekniği, nadir hücre popülasyonlarının daha iyi canlılığı sağlayan ve alt küme bileşiminin yansıtıcı, gelişmiş ve son zamanlarda 12 yayımlanmıştır. Bu makalenin amacı, bir daha det sağlamaktırBu karaciğer hücre izolasyon prosedürü ve alt küme analizi ailed protokol tekniğinin uygun üreme için izin vermek. Ayrıca, protokol yeni protokole göre farklılıklar göstermek için önceki izolasyon yöntemi ile bir karşılaştırmasını içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deney prosedürleri Homburg Üniversitesi Tıp Merkezi etik ve hayvan bakım komitelerinin onayı ile yapılmıştır.
Malzeme ve Tamponlar hazırlanması 1.
- Taze bakteri kontaminasyonu önlemek için steril bileşenleri ve laminar kaput kullanarak karaciğer sindirim için gerekli tüm tamponlar hazırlamak.
- RPMI ortamı içinde 49.5 mL ve fetal sığır serumu, 0.5 mL karıştırılarak toplama tamponu (CB) hazırlama (FBS, düşük endotoksin, ısı ile inaktive edilmiş),% 1 (h / h) çözeltisi elde etmek için. Daha fazla kullanım kadar buz üzerinde çözüm saklayın.
Not: Yaklaşık olarak 25 CB ml bir bütün karaciğer sindirimi gereklidir. - Aşağıdaki bileşenler kullanılarak sindirim tamponu (DB) hazırlayın: RPMI ortamı,% 1 (h / h) FBS (düşük endotoksin, ısı ile inaktive edilmiş), kolagenaz P (0.2 mg / ml), DNAz I (0.1 mg / mL) ve dispaz (0.8 mg / ml).
Not: yaklaşık 25 dB mL bir bütün karaciğer sindirimi gereklidir. t DB ön ısıtmakKullanmadan önce o 37 ° C su banyosu. - Hanks dengeli tuz çözeltisi içinde girişte enzimler (HBSS; collagense P ve dispaz) sulandırın veya DNase I tamponu (% 50 (h / h) gliserol, 1 mM MgCl2, 20 mM Tris-HCI, pH 7.5) bunu kısım, ve -20 ° C'de saklayın. DNaz-ı saklayın 4 ° C'de tampon ve iki ay içinde kullanın.
Karaciğer Tek hücreli Süspansiyon 2. Hazırlık
- Yerel etik ve hayvan bakım komiteleri çerçevesinde servikal dislokasyon ile tedavi edilmemiş vahşi tür fareler Euthanize.
- Bir diseksiyon gemide fareler yerleştirin ve% 70 etanol ile kürk ıslak. makas kullanarak, bacaklarda karşı Y-kesi ardından derinin bir yarık ile karın açın. makas kullanarak sternum periton açın. karaciğer ortaya çıkarmak için, bir pamuklu çubuk kullanarak sağ tarafına hafifçe bağırsak yerinden.
- makas ve forsepsle yardımıyla, karaciğer lobları kaldırmageride Safra kesesi bırakarak ve bağ dokusu ile kirlenmesini önlemek. karaciğer tartılır ve HBSS içeren bir Petri kabındaki buz üzerine yerleştirin.
- kuru Petri kabı karaciğer lobları yerleştirin ve bir neşter kullanılarak homojen küpler halinde yaklaşık 2 mm yan karaciğer doku kesti. 15 ml konik santrifüj tüpüne parçaları aktarın.
- Karaciğer parçaları içeren 15 ml konik santrifüj tüpüne DB 2.5 ml ekleyin ve sindirim işlemini başlatmak için bir 37 ° C su banyosunda yerleştirin (sağlıklı bir karaciğer 60-70 dakika sürer ve bir sirozlu karaciğer 80-90 dakika sürer ).
NOT: Bir bütün karaciğer sindirilir ediliyorsa, karaciğer iyi hücre canlılığı sağlamak için iki adet 15-ml konik santrifüj tüplerine ayrılmalıdır. - serbest karaciğer hücreleri toplamak için yeni bir 15-ml konik santrifüj tüpü hazırlayın. tüpün üst poliamid 100 mikron filtre örgü yerleştirin ve CB 800 uL örgü ıslak. buz üzerinde konik santrifüj tüpü yerleştirin.
- Sam mixples karaciğer parçaları ihtiva eden 15 mL konik santrifüj tüpü çalkalayarak sindirim sürecini desteklemek için 5 ve 10 dakika sonra 37 ° C su banyosu içinde.
- 15 dakika sindirim başladıktan sonra, yavaşça kolayca geçmesine karaciğer parçaları sağlayan bir kesim ucu ile 1.000 mcL pipet kullanarak karaciğer parçaları karıştırın. geri su banyosu içine tüpler yerleştirin ve parçaları 2 dakika yerleşmek için izin verir.
- (Tipik 700 uL 2x) yaygın hücreleri içeren süpernatant kaldırmak ve adım 2.6 hazırlanan tüp ekleyin. DB ile kaldırılan süpernatant (2x 700 mL) değiştirin ve geri 37 ° C su banyosunda içine yerleştirin.
- Yaklaşık 60-70 dakika sindirim başından beri geçene kadar (tipik olarak 30, 40, 50, 55, ve 60 dakika) adım 2.8 açıklanan prosedürü tekrarlayın. itibaren 40 dk, kalan karaciğer parçaları bir kesilmemiş 1000-ul pipet geçmesine kadar küçük olmalıdır.
NOT: Sağlıklı karaciğer dige olduğunuFibrotik karaciğer tipik olarak 80-90 dakika ihtiyacı olduğu, 60-70 dakika içinde tam olarak sted. Bu zaman noktasında göre, karaciğer doku karaciğer parçaları içeren konik 15 ml santrifüj tüpüne görünür olmamalı ve tüm serbest hücreler adım 2.6 hazırlanan tüpe transfer edilmelidir. - Sindirim işlemi sonunda, hücreler toplama ve 180 x g'de 8 dakika ve 4 ° C'de bunları santrifüj (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
- liziz tamponunda, amonyum-klorid-potasyum, 1 mL (ACK) hücre pelletini ve kırmızı kan hücrelerinin lize edilmesi için oda sıcaklığında 1 dakika için inkübe edilir. CB 5 mL ilave ederek reaksiyonu durdurun ve 180 x g'de 8 dakika ve 4 ° C'de hücreleri santrifüj (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2). CB 4 mL hücrelerin yeniden süspanse ve buz üzerinde saklayın. Aşama 3'te tarif edildiği gibi, hücre sayımı.
Not: Hücre topağı gevşek ve bu nedenle süpernatan boşaltıldı yerine uzak pipetlenir.Akım Sitometri Kullanımı Cep Count 3. Belirlenmesi
NOT: ideal, aşağıda açıklanan akış sitometri tabanlı hücre ölçümü yerine klasik Neubauer odası dayalı yöntemin önerilmektedir hücre sayımı, otomatik hücre sayıcı ya da belirlemek için. aşama 2'de tarif edilen karaciğer, tek hücreli bir süspansiyon büyük ölçüde farklılık gösteren boyutlarda ve granularities ile parankimal olmayan parankimal hücreler (NPC) içerir. Akım sitometri kullanarak NPC'ler yolluk-ileri saçılma, yan dağılım (FSC-SSC) özelliği ile birlikte hücresel enkaz doğru dışlama tarif edilen protokol 12 başarı sağlar.
- Karaciğer hücre süspansiyonu (20 uL) bir kısım hazırlamak ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ve propidyum iyodin 6 uL 174 mcL (PI bitiş konsantrasyonu 0.375 mg / ml). Hücrelerin ölçümü için izin sayma boncuk ekleyin.
- S KapısıSC-A-FSC-A enkaz önlemek ve daha fazla FSC-H ve FCS-A kullanılarak ikilileri dışlamak için.
NOT: Şekil 2'de gösterilen yolluk strateji takip etmek önemlidir. - Kapı dışarı PI-pozitif ölü hücreler, senin örneklerden 30 mcL ölçmek ve olayları kaydetmek. hücre sayısını hesaplamak için üreticinin kılavuz izleyin.
NOT: ölçme flow sitometri adımlarını 4 izleyin manyetik tabanlı progenitör hücre izolasyonu için 5. ve 6. adımları ve progenitör alt popülasyonlarının tür flow sitometri için 7 adımları.
Progenitör Alt Grupları ve Fow Sitometri Analizi Karaciğer Tek hücreli Süspansiyon 4. Boyama
Antikor Klon Host / İzotip Hazır Konsantrasyon [mg / ml] seyreltme CD64 X54-5 / 7.1 Fare IgG1, κ 0.5 1: 100 CD16 / 32 93 Fare IgG2a, λ 0.5 1: 100 CD45 30-F11 Sıçan IgG2b, κ 0.2 1: 200 CD31 MEC13.3 Fare IgG2a, κ 0.5 1: 200 ASGPR1 Poliklonal keçi IgG 0.2 1: 100 podoplanin 2001/01/08 Syrian Hamster IgG 0.2 1: 1400 podoplanin 2001/01/08 Syrian Hamster IgG 0.5 1: 1400 CD133 Mb9-3G8 sıçan IgG1 0.03 3 uL CD133 315-2C11 fare IgG2A, λ 0.5 1: 100 CD34 RAM34 Fare IgG2a, κ 0.5 1: 100 CD90.2 53-2,1 Sıçan IgG2, κ 0.5 1: 800 CD157 BP-3 Fare IgG2b, κ 0.2 1: 600 EpCAM G8.8 Fare IgG2a, κ 0.2 1: 100 Sca-1 D7 Fare IgG2a, κ 0.03 10 uL Fare IgG2b, κ MPC-11 0.2 sıçan IgG1 RTK2071 0.2 Sıçan IgG2b, κ RTK4530 0.2 Fare IgG2a, κ RTK2758 0.5 Fare IgG2a, κ RTK2758 0.2 Syrian Hamster IgG SHG-1 0.2 Syrian Hamster IgG SHG-1 0.5 Normal keçi IgG kontrol Poliklonal keçi IgG 1 Eşek anti-keçi IgG eşek IgG 2 1: 800 streptavidin 1 1: 400 Tablo 1.
Antikor 1 2 3 4 5 CD45 APC / Cy7 Sıçan IgG2b, κ
0.5 uL+ + + + CD31 Biotin + Fare IgG2a, κ
0.5 uL+ + + ASGPR1 saflaştınldı + + Normal keçi IgG kontrol
0.2 uL+ + podoplanin APC + + + Syrian Hamster IgG
Bir 01:14 Seyreltme 1 uL+ CD133 PE + + </ Td> + + sıçan IgG1
0.45 uLEşek anti-keçi
Alexa Fluor 488+ + + + + streptavidin
Alexa Fluor 405+ + + + + Tablo 2.
- Aşama 3'te tarif edildiği gibi belirlenir, 2.5 x 10 5 hücre ihtiva eden bir reaksiyon tüpüne (1.5 mL) içine adım 2.11 hücre süspansiyonunun bir kesri yerleştirin.
- 3 300 xg'de dk ve 4 ° C mikrosantrifüj kullanarak hücreleri Santrifüj.
NOT: Bu noktada, bir vakum pompası dikkatle süpernatant kaldırmak için kullanılabilir. - Fc Block karışımı hücre pelletini ve buz üzerinde 5 dakika için inkübe edilir. leke başına 50 ul toplam hacimde Fc Block karışımı hazırlayın. 1 ekleFcR bloke edici ayıracı 0 uL, saflaştırılmış anti-CD64 1 uL (1: 100; 0.5 ug / leke), ve boyama tamponu 40 uL (ST tamponu: HBSS,% 1 (h / h) FBS ve% 0.01 leke başına sodyum asid).
NOT: Sodyum azit son derece toksiktir. nitril eldiven, laboratuvar kat ve bir yüz maskesi gibi uygun kişisel koruyucu donanımları kullanın. - hücrelere karışımı boyama 50 mcL (hücrelerin toplam hacmi şimdi 100 uL) ve antikor karışımı hücreleri, ışıktan korundu ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir.
- leke başına 50 ul toplam hacim sahip antikor karışımı hazırlayın. CD31 (0.5 uL; 1: 200; 0.25 ug / leke), ASGPR1 (1 uL: CD45 (; 200 0.1 ug / leke 1 0.5 uL:) 50 uL ST tampon için, temel bir boyama aşağıdaki konjuge antikor ekleyin ; 1: 100; 0.2 ug / leke), podoplanin (1 01:14 seyreltme uL; 1: 1.400 uç seyreltme; 0.014 ug / leke) ve CD133 (3 uL; 0.09 ug / leke).
NOT: Tablo1 antikor klonlar ve temel lekeler ve çeşitli alt grupları ek yüzey belirteçleri için kullanılan dilüsyonları özetlemektedir. Tablo 2'de de gösterildiği gibi, karşılık gelen izotip kontrolleri ve / veya floresan eksi kontrol (FMOs) ihtiva eden bir antikor karışımı için ekstra hücre süspansiyonları hazırlanır. - eşek anti-keçi IgG 0.125 uL (1 ihtiva eden ikincil antikor karışımı, 100 uL hücreler her bir örnek için 400 uL ST tamponu ilave edin ve santrifüj hücreler, 4 dakika boyunca 300 x g ve 4 ° C.Discard supernatant ve tekrar süspansiyon: 800; 0.25 ug / leke) ve fluoresan streptavidin konjüge (1 0.25 uL: 400; 0.25 ug / leke) ST, tampon 100 ul.
- ışıktan ve buz üzerinde 20 dakika için antikor karışımı ile korunan ise hücreler inkübe edin. Her bir örnek için, 400 uL ST tamponu ilave edin ve 300 x g'de 4 dakika ve 4 ° C'de hücreleri santrifüj. Süpernatantı atın ve ST tutkunu 300 uL hücreleri tekrar süspansiyoner 0.25 mcg / ml PI içeren.
NOT: projenitör hücrelerin hücre canlılığı zamanla azalır; nedenle, mümkün olan en kısa şekilde, taze numuneleri ölçmek için önerilmektedir.
Progenitör Hücreler 5. Manyetik microbead tabanlı Zenginleştirme
- Yeni bir 15 mL konik santrifüj tüpü içine, Aşama 3'te tarif edildiği gibi belirlenir hücre sayımına bağlı olarak 1.5-2 x 10 6 hücre içeren karaciğer tek hücre süspansiyonunun bir kesri aktarın.
- 180 x g'de 8 dakika ve 4 ° C'de hücreleri santrifüj (indirgenmiş Hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
Not: Genellikle, bir sağlıklı C57BL / 6 fare karaciğer (ya da karaciğer dokusu, 1 g), üç 15-mL konik santrifüj tüpüne ayrılmış gerekecektir. - HBSS% 0.5 (h / h) inek serumu albümini (BSA) 400 ul hücrelerin tekrar ve anti-CD31 mikro boncuklar 40 uL ve anti-CD45 mikro boncuklar 30 mcL ekleyin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe hücreleri.
NOT: t aşmayınayırma saflığı önemli ölçüde azalacaktır gibi O, kuluçkalama süresinin. - hücrelere 5 ml HBSS% 0.5 (h / h) BSA ekleyin ve 180 x g'de 8 dakika ve 4 ° C'de bunları santrifüj (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
- Ölü hücre çıkarma boncuk 100 uL hücre pelletini ve 15 dakika oda ısısında inkübe edilir. Bu arada, bir LS ayırma sütunu hazırlama ve HBSS 0.5 3 mL% (v / v) BSA ile kalibre edin.
NOT: ayırma saflığı önemli ölçüde azalacaktır gibi, kuluçka süresi aşılmamalıdır. - , Hücrelere 900 uL HBSS% 0.5 (v / v) BSA ekle 100 mikron poliamid filtre mesh kullanarak bunları filtre ve LS ayırma kolonuna yükleyin.
NOT: Yük bir bütün karaciğer bir LS ayırma kolonuna. - 3 mL HBSS% 0.5 (v / v) BSA ile sütun üç kez yıkayın ve flow-through toplamak.
- 180 x g'de 8 dakika, 4 ° C akış yoluyla santrifüj (düşük ACCE kullanılarakkard akselerasyonu arasındaki ilişki / 4 ve yavaşlama / 2).
- tampon (RB) (PBS ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA))% 0.5 daha fazla deneysel prosedür bağlı olarak (h / h) BSA veya ST tamponu ihtiva eden yıkama ya hücre pelletini.
Birden ciğeri Kombine progenitör hücre alt 6. Manyetik microbead tabanlı Otomatik Hücre Arıtma
Not: progenitör hücre alt nadir hücre popülasyonlarının temsil ettiğinden, çok karaciğerlerinden birleştiren hücreleri genellikle, daha başka deneyler için yeterli hücre sayıları elde etmek için gereklidir. Bir örnek olarak, CD133 + ve gp38 + hücre ayırma gibi, aşağıda tarif edilmektedir.
- CD133 + atalarıdır İzolasyonu
- 3. adımda açıklandığı gibi adım 5.9 sonra, hücre sayımı ve RB 100 uL 10 6 hücre (genellikle 4-6 sağlıklı karaciğer örnekleri havuzu) kadar tekrar süspansiyon.
- Ekleme, anti-CD64 1: 100 ve anti-CD16 / 32: 1 hücreleri ve inkubasyon 1005 dakika boyunca buz üzerinde yedi. hücrelere 100, anti-CD133 biyotinile antikor ve bir 10 dakika daha buz üzerinde inkübe: 1 eklenir.
- RB 5 ml ilave edilir ve santrifüj 8 dakika boyunca 180 x g ve 4 ° C (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
- RB 400 uL hücreler tekrar süspansiyon ve anti-biyotin mikro-10 uL ekleyin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca örnek inkübe edin. Bu örneklerin saflığını azaltır, kuluçka süresi aşmayın.
- RB 5 ml ilave edilir ve santrifüj 8 dakika boyunca 180 x g ve 4 ° C (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2). RB, 1 mL pelletini.
- Gp38 + progenitörlerin izolasyonu
- 3. adımda açıklandığı gibi adım 5.9 sonra, hücre sayımı ve RB 100 uL 10 6 hücre (genellikle 4-6 sağlıklı karaciğer örnekleri havuzu) kadar tekrar süspansiyon.
- Ekleme, anti-CD64 1: 100 ve anti-CD16 / 32: 1 hücre 100 ve 5 dakika süreyle buz üzerinde inkübe. Sonra, 1 ekleyin:100, anti-gp38 hücrelerine antikor biyotinile edilmiş ve 10 dakika daha buz üzerinde inkübe edilir.
- RB 5 ml ilave edilir ve santrifüj 8 dakika boyunca 180 x g ve 4 ° C (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
- RB 400 uL hücreler tekrar süspansiyon ve anti-biyotin mikro-5 ul ekleyin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca örnek inkübe edin. Bu örneklerin saflığını azaltır, kuluçka süresi aşmayın.
- RB 5 ml ilave edilir ve santrifüj 8 dakika boyunca 180 x g ve 4 ° C (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
- RB, 1 mL hücre pelletini.
- Adım 6.1 veya 6.2 sonra ortak adımlar
- Pozitif ve negatif fraksiyonları toplamak için iki ek boş tüpler bir soğutma 5 raf üzerinde manyetik olarak etiketlenmiş hücre süspansiyonu ihtiva eden 15 ml konik santrifüj tüpüne koyun. ayırıcı ayırma platformu üzerinde soğuk raf yerleştirin.
- Pozitif seçim programı kullanınHer numune (durulama seçeneği) arasında geniş bir yıkama aşaması ile (Possel_d2).
NOT: numunenin saflığını azaltacaktır yerine otomatik ayırıcı hücrelerinin sütun tabanlı manuel olarak ayrılmasını kullanma. - 180 x g'de 8 dakika ve 4 ° C'de pozitif kısmını ve santrifüj kazan (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
- daha fazla deneysel prosedür bağlı olarak ya RB veya ST tampon hücre pelletini.
- saflık kontrolü için, hücrelerin bir kısım alır ve aşama 4'te tarif edildiği gibi bunların leke.
7. Akım Sitometri Hücre Sıralama
NOT: progenitör hücre alt kümesinin bir yüksek saflıkta şort aşağıda tarif edilen protokol ile elde edilebilir. hücrelerin toplam verimi bu aşama 6'da tarif edilen ve gen ekspresyon analizi için en çok daha düşüktür.
Parametre ayar Nozul Boyutu 85 mikron Sıklık 46,00-46,20 Genlik 38,30-55,20 Faz 0 Bırak Gecikme 28,68-28,84 zayıflama kapalı ilk Damla 284-297 hedef Gap 9.-14 Basınç 45 psi Tablo 3.
- (Aşama 5'te tarif edilen), manyetik bazlı zenginleştirme hücreleri elde edilmesi; Aşama 3'te tarif edildiği gibi, bunları saymak; 4. adımda açıklandığı gibi ve progenitör belirteçleri (CD133, gp38), CD31, ASGPR1 ve CD45 için onlara leke.
- fenol-kırmızı ücretsiz Dulbec: sıralama orta (SM) hazırlayın% 0.5 (h / h) BSA ve% 0.01 (h / h) sodyum azid ihtiva eden CO 'nun Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM). SM lekeli hücrelerin tekrar polipropilen yuvarlak alt tüp içine aktarmak ve buz koyun.
NOT: Sodyum azit son derece toksiktir. nitril eldiven, laboratuvar kat ve bir yüz maskesi gibi uygun kişisel koruyucu donanımları kullanın. kriteri hücreler fonksiyonel deneyleri için kullanıldığında sodyum azit kullanmayın. - Hücre izolasyonu için kullanılan sıralayıcı türüne uygun yazılımı kullanın. yazılımını açın ve sıralama parametreleri ve makine özellikleri ayarlamak için üreticinin talimatlarını izleyin.
NOT: Makine özellikleri Tablo 3'te özetlenmiştir. Makine özellikleri çeşitli kurumlarda farklı olabilir iken, (45 psi ve 85 mikron nozul) populat progenitör hücre canlılığı artırmak için sıralama basınç azalması ve daha geniş bir meme büyüklüğü gerekli olduğuna dikkat etmek önemlidiriyon ve sıralanmış hücrelerden hazırlanan RNA kalitesi. Tazminat ayarlamak için zenginleştirilmiş karaciğer progenitör hücreler kullanmak önemlidir. Diğer karaciğer ya da lökosit popülasyonları stromal nüfusun optimal çözünürlükte ve sahte yolluk strateji farklı oto-floresan ve sonucu var. - Makineyi kalibre ve sıralama toplama cihazında SM 350 uL içeren 5 ml polipropilen yuvarlak alt tüp yerleştirin. Örnek toplama ve sıralama başlayın. alt populasyonun 1000 olayları toplayın ve örnek akışını durdurun.
- sıralama cihazdan dışarı tüpü alın ve akış sitometresinde sıralı hücreleri ölçün. canlı hücreler arasındaki mevcut sıralı hücre popülasyonunun yüzdesini belirleyin. Bu oran sıralanmış hücrelerin saflığını verir.
- Sıralama saflığı% 95'in üzerinde, sınıflandırmanın toplama cihazında RLT lizis tamponu 350 uL ihtiva eden bir 5-ml polipropilen yuvarlak dipli tüp yerleştirin.
- sıralama başlatın ve toplamak 7,000-stromal ICSI'nin başına 10.000 olaylar.
- daha sonra analiz -80 ° bir DNase- ve RNaz içermeyen reaksiyon tüpünde kriteri hücreleri içeren RLT lizis tamponu aktarın ve örnekleri saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Parankimal olmayan parankimal karaciğer hücreleri (Şekil 1 ve 2a) ihtiva eden bir tek hücre süspansiyonu enzimler sonuçlar için yeni bir karışımı ile karaciğer, sindirim için burada sunulan prosedür. Kırmızı kan hücrelerinin ACK-Lize etme sonrasında tek hücre süspansiyonu sitometri analizi doğrudan akım olanağı (Şekil 1 ve 2) 'dir. Yolluk strateji çiftler ve ölü hücreleri (Şekil 2a) dışlanması içerir. CD45, CD31 ve ASGPR1 için negatif hücreler Geçitli. Bu nüfus, karaciğer progenitör hücreler içerir ve bunların gp38 ve CD133 ekspresyonu (Şekil 2a) dayalı toplanabilir. Gp38 + CD133 + ve gp38 - sağlıklı yetişkin fare liv hücreleri - CD31 - - ASGPR1 CD133 + hücreler en bol hücre CD45 arasında popülasyonları temsiler (Şekil 2a, b). Bu alt-gruplar, daha önce bu EpCAM, Sca-1 ve CD34 (Şekil 2c) halinde progenitör hücreleri ile ilişkili ek yüzey markerlerinin ifadesiyle farklıdır.
Progenitör hücreler, hepatositler ve karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSECs) (Şekil 1 ve 3), ve projenitör hücreler, manyetik mikroboncuk bazlı yalıtımlı daha da arıtılabilir olabilir (Şekil 3a, b) ya da olduğu gibi hematopoietik ve parankimal hücreler, boşaltılabilir ayırma yüksek saflıkta (Şekiller 1 ve 4). % 90 saflıkta CD133 + veya gp38 + hücrelerinin sonuçları manyetik mikroboncuk bazlı yalıtım (Şekil 3a, b) kirletici CD45, CD31 veya ASGPR1 + hücreleri ile ilgili olarak, ve hücreler, yüksek canlı kalır (Şekil 3a, b).
2 canlılığı açısından farklılık gösterebilir. Bu doku ayrılması için kullanılan enzim karışımının seçimi için özellikle uygundur. Burada, kolajenaz P yerine kolajenaz D karaciğer, 1, 2, 8 kullanılmıştır. Önemli olarak, progenitör hücreler üzerindeki CD133 ekspresyon düzeyi ve izole edilmiş bir hücre popülasyonlarının verimi büyük ölçüde kolajenaz D varlığında azalmış (Şekil 5a, b). Buna ek olarak, karışım, hafif bir ayrıştırma ve çeşitli hücre tipleri 13 alt kültür için son derece uygun olan, dispaz ihtiva etmiştir. dispaz temsil birlikte kollajenaz Pprogenitör hücre analizi için karaciğer hücre ayrışma için ideal bir kombinasyon. Bu kombinasyon aynı zamanda, tripsin üstündü veya karaciğer Pronaz tabanlı sindirimi (veriler gösterilmemiştir). Progenitör Bu protokol sunulan analizler için böyle Percoll tabanlı zenginleştirme 2, 14 olarak o yoğunluk santrifüj dikkat etmek aynı derecede önemlidir, gerekli değildi.
Şekil 1: tarif protokolün iş akışı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Karaciğer progenitör alt gruplarının Roman sınıflandırılması. Tek hücreli birSüspansiyon, sağlıklı karaciğerler hazırlanabilir ve daha sonra yüzey bir belirteç panelinin ile boyanmıştır: CD45, CD31, CD133 ve gp38 (A). Ölü hücre dışlama için propidium iyodür (PI) kullanılmıştır. yolluk stratejisi ile temsili nokta araziler tasvir edilmektedir. Hücre sayısı tayin akış sitometrisi için kullanılan kapıları da işaretlenir. (B) yüzdeleri ve vahşi tip tedavi edilmemiş hayvanlarda CD45-negatif hücreleri arasında, çeşitli stromal hücre alt karaciğer dokusunda gramı başına mevcut hücrelerinin mutlak sayısı gösterilmektedir. (C) histogram sağlıklı karaciğerde stromal hücre alt ayırt edici işaret özelliklerini gösterir. CD34 B Sca-1 B içinde mevcut olan alt-popülasyonundan özgü ise yüksek CD90.2 ifadesi ve CD157 varlığı, spesifik olan, C, D ve EpCAM nüfusu C ve D ortalama ± SEM sadece mevcuttur; veri (AC) n 2-3 bağımsız deneyler = Deneme başına 3-4 temsil etmektedir. veri were Eşleştirilmemiş, iki kuyruklu T testi * P <0.05, ** p <0,005, *** P <0.0001 kullanılarak karşılaştırıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Manyetik microbead tabanlı zenginleştirme ve otomatik hücre arıtma. CD45 (A) Manyetik microbead dayalı zenginleştirme - CD31 - ve ASGPR1 - hücrelerin önce ve zenginleştirme sonrası tasvir edilmiştir. Otomatik microbead bazlı hücre izolasyonların (B) Temsilcisi nokta araziler solda, CD133 + ve gp38 + hücreleri için tasvir edilmektedir. Sağ tarafta, önce ve zenginleştirmeden sonra hücre popülasyonlarının canlılığı yüzdesi olarak gösterilirpropidium iyodür (PI) negatif hücreler. Ortalama ± SEM; verileri (AB) deney başına n = 3 ile 3 bağımsız deneyler temsil etmektedir. Veriler unpaired, iki kuyruklu T testi * P <0.05, ** p <0,005, *** p <0.0001 kullanılarak karşılaştırıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Yüksek saflıkta progenitör alt kümelerinin tür Flow sitometri. Nokta araziler sıralanmış numuneler (post-sort) hücre popülasyonlarının saflığını betimliyor. Veri 3 bağımsız deneyler temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
= "1"> 
Şekil 5: sindirim enzimleri karşılaştırılması. veya collagenase D (adım 2'de tarif edildiği gibi), tek hücreli bir süspansiyon kolajenaz P kullanılarak elde edilmiştir (1 mg / ml + DNaz I 0.1 mg / mL), sağlıklı ciğeri ve daha sonra yüzey bir belirteç panelinin ile boyanmıştır: CD45, CD31, CD133 ve gp38 (A). yabani tip tedavi edilmeyen hayvanlarda CD45-negatif hücreleri arasında çeşitli stromal hücre alt gruplarının karaciğer dokusunda gramı başına mevcut hücrelerin yüzdeleri gösterilmiştir. (B) CD133 ortalama florasan yoğunluğu CD133 + hücre popülasyonu için gösterilmiştir. Ortalama ± SEM; verileri (AB) deney başına n = 3 ile 2 bağımsız deneyler temsil etmektedir. Veriler unpaired, iki kuyruklu T testi * P <0.05, ** p <0,005, *** p <0.0001 kullanılarak karşılaştırıldı.target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karaciğer iltihabı, farklı kökenlerden gelen hasarı progenitör hücre genişlemesi ve aktivasyon 2, 3 ile birlikte karaciğerdeki yenilenme sürecini tetikler. Bu karaciğer progenitör hücrelerin hücre özelliklerini kök sahip ve büyük olasılıkla çeşitli karaciğer hastalıklarının mekanizmasında önemli bir rol oynamaktadır.
Karaciğer progenitör hücrelerin heterojenliği uzun önerilmiştir. Farklı yüzey belirteçleri taşıyan alt kümelerini belirlemek ve karaciğer hasarı 12 sırasında inflamasyon ile ilişkili genlerin özel bir takım ifade edebilecekleri CD133 ve gp38 yeni bir yüzey işaretleyici kombinasyonunu kullanarak karaciğer progenitör alt kümelerinin yeniden değerlendirilmesi. Burada anlatılan yöntemi nadir hücrelerin sitometri analizi doğrudan akış ve çeşitli karaciğer hasarı modellerinde onların doğrudan karşılaştırma için izin verir. Çeşitli yaralanmalar çoklu progenitör s aktivasyonunu tetikler gibi bu özellikle geçerlidirkanalsal reaksiyonlar 3, 4, 11, 12 gözlenen hücresel heterojenlik yansıtıcı olabilir ubsets. Özellikle, murin karaciğer dokusu (0.2 g) küçük bir kısmı anlatılan yöntem kullanılarak progenitörlerin akış sitometri analizi için yeterli hücreleri izole etmek için yeterlidir.
sitometri alt kümelerinin yüksek saflıkta popülasyonları, tasnif Akış eşsiz gen ekspresyon profillerini keşfetmek için gereklidir. Önceki raporlar açıklanan akış sitometri tabanlı progenitör hücre izolasyonu 15, 16. Bununla birlikte, burada sunulan protokol bu hücrelerin yüksek saflık ve canlılığı sağlayan iyileştirilmiş bir yöntem temin etmektedir. Özellikle, daha önce tarif edilen in vitro kültürlenmesi ve genişleme teknikleri güzel buraya 15 sunulan protokolü ile kombine edilebilir
seçmeler akış sitometri Birçok tür çeşitli kurumlar mevcuttur ve bunların belirli ölçekler biraz farklı olabilir. Bununla birlikte, hücre sıralama için genel ilkeler, tarif edilen protokol ile sunulmuştur. Genel olarak, düşük bir basınç ve daha büyük meme boyutu, makine türü ve özellikleri bağımsız kesinlikle gereklidir. Ayrıca, uygun bir ayırma ortamının kullanımı önemli ölçüde canlılığı ve özellikle de gen ekspresyonu çalışmaları için, önemli bir faktördür kriteri hücrelerin RNA kalitesini artırabilir. projenitör hücrelerin ayrıştırılması, ancak, büyük ölçüde hücre canlılığını azaltır ve sıralama sonra hücre verimi (4-5 sağlıklı karaciğer toplanmış gereken 7-10,000 olaylar / alt populasyonun yüksek saflıkta tür için) göreceli olarak düşüktür. Bu analizler vitro ileri için sınırlayıcı bir faktör olabilir. Biz manyetik microbead tabanlı izolasyon önermeknitro deneyler nedeniyle, daha yüksek verim ve hücre canlılığı, ve akış daha özel alt analiz eder ve izolasyonu gerekli, özellikle gen ekspresyon analizi için sıralama sitometrisi.
hücrelerin canlılığı büyük ölçüde sıralama flow sitometri sonra azalır gerçeğine dayanarak, progenitör hücrelerin otomatik manyetik microbead tabanlı yalıtım geliştirilmiş ve burada sunulmuştur. Yüksek saflıkta (çoklu karaciğerler birleştirerek) ile progenitör hücrelerin daha büyük bir sayıda izole edilmesi için izin verir. Bundan başka, hücrelerin canlılığı izolasyon süreci için gerekli zaman büyük ölçüde azalır, çünkü muhafaza edilir. Progenitör hücrelerin alt sayılar vitro 1, 2, 15, 16 genişletilmiş edilebilir olsa da, in vitro manipülasyonlar kök / ProGen hücresel özelliklerini değiştirebilir nasıl dikkate tavsiye edilirin- hücreleri diğer mezenşimal stromal hücre popülasyonlarının 17, 18 için tarif edildiği.
Sunulan manyetik microbead bazlı izolasyon önemli kısıtlılığı CD133 + ve gp38 + hücre popülasyonları heterojen hücreleri temsil olmasıdır. Ek yüzey belirteçleri küçük hücre popülasyonlarının tanımlanması gerekli olabilir.
Karaciğer kök hücreler ve atalarıdır birbirleriyle ilişkilerini nasıl anlaşılması Lola Reid ve diğerleri 1, 8, 19 ile mükemmel çalışmalara rağmen, tam olmaktan uzak. Dolayısıyla, bu tür Burada önerilen biri olarak yüksek verim ve canlılığı, sonuçlanan tekniklerin dikkatli bir şekilde düşündükten progenitör altkümesinin tahlillerini ve birbirine ilişkilerin anlaşılmasını uzatmak için yardımcı olabilir.
Genel olarak, biz anlattığımız to tecrit ve yakın zamanda 12 ayırt edildi karaciğer progenitör alt kümelerinin detaylı analizi. Ayrıca, yeni bir enzim kombinasyonu kullanılarak, nadir ataları direkt akış sitometrisi ölçümleri ile analiz edilebilir. Ayrıca, protokol hücre sıralama veya otomatik microbead bazlı teknik kullanarak, yüksek saflıkta progenitör hücreleri zenginleştirmek gösterilmiştir.
Sorun giderme:
Hücre enkaz yüzdeler ve ölmekte olan hücrelerin yüksek
Sindirim (aşama 2) sırasında, karaciğer örneklerinin pipetleme çok sertse, tek hücreli bir süspansiyon artar hücrelerin ölme yüzdesi. Karaciğer önerilenden daha büyük parçalar halinde kesilmiş ise, sindirim daha az verimli ve hazırlanması sırasında daha fazla hücre ölümü ile sonuçlanır.
5. adımda işlemini tamamladıktan sonra, numunelerin saflığı yeterli değildir
Yüzde varsaAşama 2'de hazırlanan tek hücre süspansiyonu, hücre kalıntılarının n avantaj ve ölmekte olan hücre mikro-spesifik olmayan bağlanma ve bu nedenle, izolasyon saflığı önemli ölçüde azalır, çok yüksektir.
microbead tabanlı saflaştırma sonrası düşük hücre sayısı
tarif edilen protokol başarılı olabilmesi için, protokolde önerilen mikro-hücrelerin oranı optimal olması önemlidir. Daha fazla mikroboncuklar kullanılması saflık azaltır ve izole hücrelerin verimini ve canlılığını azaltır. protokol anlatılandan daha başka yüzey işaretleme maddeleri progenitör alt izolasyonu için kullanılır ise, mikro-hücrelerin optimal oranı tespit edilmelidir.
Gp38 + CD133 Manyetik microbead bazlı izolasyon - Nüfus
Ayrıca 10 uL, anti-CD133 + mikro boncuk eklemek Adım 5.3 yılında 5. bölümde adımları izleyin, sonra izleyin adımları 5, 6.2 ve tarif olarak 6.3d.
mutlak hücre sayıları hesaplanması
Karaciğer ağırlığı Belirli bir alt kümesinin birçok hücre gram karaciğer dokusu başına mevcut nasıl hesaplamak için kullanılır.
(Canlı hücreler subpopülasyonu (%) flow sitometri dayalı / 100), karaciğer parçası = Z izole toplam canlı hücre sayısını x
(Karaciğer parçasının 1 / ağırlık) Z = hücre sayısı / g karaciğer dokusu x
Bu yöntemle izole edilebilir diğer hücre popülasyonları
(Vs. veya hematopoietik hücrelerin bir alt grubu, örneğin, Kupffer hücreleri, dendritik hücreler, T hücreleri, NK hücreleri), CD45 + hücreleri ve LSECs: Aşağıdaki karaciğer bu sindirme protokolü kullanarak hücreleri izole etmek mümkündür. Sindirim protokolü hepatositler ya da hepatik stellat hücrelerin izolasyonu için uygun değildir. Bu hücreler, nispeten düşük hücre sayıları mevcut olup tasarımlarıyla karşılaştırıldığında, indirgenmiş canlılığını gösterenMevcut yöntemler r.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var.
Acknowledgments
Bu çalışma VLK Alexander von Humboldt Vakfı Sofja Kovalevskaja Ödülü ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
- Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
- Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
- Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
- Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
- Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
- Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
- Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
- Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
- Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
- Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
- Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
- Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
- Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
- Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).
