Summary
肝臓損傷は、不均一な細胞集団を表し、前駆細胞の増殖を伴います。この細胞区画の新規分類は、複数のサブセットの区別を可能にします。ここで説明する方法は、分析し、さらなるアッセイのために使用することができる種々のサブセットの高純度分離、フローサイトメトリーを示します。
Abstract
慢性肝臓傷害の間、前駆細胞は、炎症性細胞浸潤および上皮細胞の活性化の出現を伴う小管反応と呼ばれるプロセスで展開します。そのような炎症反応中に前駆細胞集団は、大部分の組織学的分析によって、またはフローサイトメトリーベースの技術のいずれかによって、単一の表面マーカーを使用して研究されています。しかしながら、新規な表面マーカーは、細胞コンパートメント幹/肝前駆細胞内の種々の機能的に異なるサブセットを同定しました。ここで紹介する方法は、新規の表面マーカーの組み合わせを使用して、前駆細胞サブセットの分析サイトメトリー分離と詳細な流れを説明しています。また、種々の前駆細胞のサブセットは、自動磁気及びFACSソーティングに基づく方法を用いて高純度で単離することができる方法を示します。重要なことは、小説や肝臓の単純化された酵素的解離は高い生存率これらの希少な細胞集団の単離を可能にしますそれは、他の既存の方法に比べて優れています。これは、さらに、インビトロで前駆細胞を研究するため、または遺伝子発現プロファイルを分析するために、高品質のRNAを単離するために特に適切です。
Introduction
肝臓再生は、主に肝細胞の自己再生能と関連しています。それにもかかわらず、慢性肝損傷は、肝細胞及び胆管1、2、3、4に分化する能力と関連している前駆細胞の活性化および拡大で起こります。慢性傷害の間、肝細胞増殖が有効でない場合、これは特に重要です。前駆細胞を標的とする多数の遺伝的追跡研究にもかかわらず、肝臓再生におけるそれらの役割は、5、6、7、8議論の余地。また、前駆細胞の活性化は、負傷9の間にそれらの正確な役割について疑問を提起肝臓で増加した線維化反応、にリンクされています、10。
前駆細胞コンパートメントの不均一な性質は、長い顕微解剖または細胞選別に基づく方法1、11を使用して単一の表面マーカーを発現する前駆細胞を単離し、遺伝子発現研究によって示唆されています。実際、最近、GP38（ポドプラニン）を使用して、新規な表面マーカーの組み合わせは明確種々のサブセット12に前駆細胞の前の単一のマーカーを結合されました。重要なことは、これらのサブセットは、それらの表面マーカー発現が異なるだけでなく、怪我12の間に機能的変化を示しただけではなく。
多数の動物モデルは、前駆細胞の活性化及び肝再生を研究するために利用されています。様々な損傷の種類は、前駆細胞12の異なるサブセットの活性化を促進すると思われます。これは、pHを説明するかもしれません人間4で観察された小管反応のenotypic発散。このように、前駆細胞の複雑な表現型および機能解析は、怪我や肝疾患における小管反応の真の意義における役割を理解することが極めて重要です。
表面マーカーの組み合わせの他に、細胞単離プロトコールにおける重要な違いは、さらに、以前の研究2に基づいて結論を複雑にします。研究のかなりの量が大きく、それらの単離プロトコルが異なる前駆細胞（ 例えば、肝臓解離（酵素の組み合わせと処理の持続時間）、密度媒体、及び遠心分離スピード）の役割に対処2。希少な細胞集団とサブセットの組成物の反射のためのより良い生存可能性を提供する最適化された分離技術は、開発され、最近12公開されています。この記事の目的は、より多くのDETを提供することです技術の適切な再現を可能にするために、この肝細胞の単離手順およびサブセット解析のプロトコルをailed。さらに、プロトコルは、新しいプロトコルと比較して違いを示すために、以前の分離法との比較を含んでいます。
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Protocol
全ての実験手順は、ホンブルク大学医療センターの倫理や動物管理委員会の承認を得て行きました。
材料およびバッファの作製
- たての細菌汚染を避けるために、無菌のコンポーネントと層流フードを使用して、肝臓の消化のために必要なすべてのバッファを準備します。
- 1％（v / v）の溶液を達成するために、RPMI培地49.5 mLおよびウシ胎児血清（低エンドトキシン、熱不活性化FBS）を0.5mLを混合することにより収集バッファ（CB）を準備します。さらに使用するまで氷上でソリューションを保存してください。
注：CBの約25mLのは、一つ肝臓全体を消化することが必要です。 - RPMI培地、1％（v / v）のFBS（低エンドトキシン、熱不活化）、コラゲナーゼP（0.2 mg / mlで）、DNアーゼI（0.1 mg / mlで）以下の成分を使用して消化緩衝液（DB）の調製、およびディスパーゼ（0.8 mg / mlで）。
注：DBの約25mLのは、一つ肝臓全体を消化することが必要です。トンで事前暖かいDB使用前に彼は、37℃の水浴。 - またはDNアーゼI緩衝液中、ハンクス平衡塩溶液（collagense PとディスパーゼHBSS）に到着時に酵素を再構成する（50％（v / v）のグリセロール、1mMのMgCl 2、および20mMトリス-HCl、pH7.5）で、それを分注し、-20℃で保管してください。 4℃でのDNase-Iバッファを保存し、2カ月以内にそれを使用。
肝臓単一細胞懸濁液の調製
- 地元の倫理や動物管理委員会に合わせて頸椎脱臼により未処理の野生型マウスを安楽死させます。
- 解剖ボード上にマウスを置き、70％エタノールで毛皮を濡らします。はさみを使用して、手足に向かってY-切開に続いて皮膚の正中切開で腹部を開きます。はさみを使用して胸骨に腹膜を開きます。肝臓を明らかにするために、綿棒を使用して、右側に優しく腸を移動さ。
- はさみや鉗子の助けを借りて、肝葉を削除し、背後に胆嚢を残し、および結合組織による汚染を避けます。肝臓を計量し、HBSSを含むペトリ皿に氷の上に置きます。
- 乾燥ペトリ皿上の肝葉を置き、メスを使用することにより、均質な立方体に約2ミリメートル側を肝組織を切断。 15-mLコニカル遠心管に駒を転送します。
- 肝臓片を含む15 mLのコニカル遠心管にDBの2.5 mLを加え、消化プロセスを開始するために37℃の水浴に入れ（健康な肝臓は60~70分かかり、硬変した肝臓は、80〜90分を要します）。
注：ある全肝臓は消化されている場合、肝臓は、良好な細胞生存率を確保するために、2つの15 mLのコニカル遠心管に分離されるべきです。 - 放出された肝臓細胞を収集するために、新しい15 mLコニカル遠心チューブを準備します。チューブの上にポリアミド100μmのフィルターメッシュを配置し、CBの800μLとメッシュを濡らします。氷上のコニカル遠心チューブを置きます。
- SAMを混ぜますples肝臓片を含む15 mLのコニカル遠心管を振盪することによって、消化プロセスをサポートするために、5及び10分後に37℃の水浴です。
- 消化開始後15分で、静かに肝臓片を容易に通過することができますカットの先端で1,000μLピペットを用いて、肝臓片を混ぜます。バックウォーターバスにチューブを置き、作品は2分間沈降することを可能にします。
- （典型的には、700μL2倍）播種性細胞を含有する上清を除去し、ステップ2.6で調製したチューブに追加します。 DB（2×700μL）で削除された上清を交換し、戻って37℃の水浴中に入れてください。
- 約60〜70分は消化の開始以来経過するまで（典型的には30、40、50、55、および60分で）ステップ2.8で説明した手順を繰り返します。以降40分からは、残りの肝臓片をノーカット1,000μLピペットチップを通過するのに十分小さくなければなりません。
注：健康な肝臓はDIGEです線維性肝臓は通常、80〜90分を必要としながら、60〜70分以内に完全にSTED。この時点では、肝臓組織は、肝臓片を含む円錐形の15-mL遠心管に見えてはならない、とすべて放出された細胞は、ステップ2.6で作製したチューブに転送する必要があります。 - 消化プロセスの最後に、細胞を回収し、180×gで8分間4°Cのためにそれらを遠心分離（使用して還元加速/ 4及び減速/ 2）。
- 赤血球を溶解するために塩化アンモニウム - カリウム（ACK）溶解緩衝液1mlに細胞ペレットを再懸濁し、室温で1分間それをインキュベートします。 CBの5ミリリットルを加えて反応を停止し、180×gで4°C（還元加速/ 4および減速/ 2を使用して）で8分間、細胞を遠心してください。 CBの4 mL中に細胞を再懸濁し、氷上で保管してください。ステップ3で説明したように、細胞をカウントします。
注：細胞ペレットが緩んでいるため、上清をデカントしているのではなく、離れてピペットで。フローサイトメトリーを用いた細胞数の3決意
注：細胞数を決定するために、自動細胞カウンターまたは、理想的には、以下に説明するフローサイトメトリーに基づく細胞の定量化は、代わりに、古典的ノイバウアー室ベースの方法を提案しています。ステップ2で説明した肝臓単一細胞懸濁液を大幅に異なるサイズや粒度で実質および非実質細胞（NPC）が含まれています。フローサイトメトリーを用いたNPCのゲーティングオン前方散乱、側方散乱（FSC-SSC）特性と共に、細胞破片の適切な除外が記載されているプロトコル12の成功を保証します。
- 肝細胞懸濁液（20μL）のアリコートを準備し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の174μLとヨウ化プロピジウムの6μL（PI;最終濃度0.375μgの/ ml）を追加します。細胞の定量化を可能にカウントビーズを追加します。
- S上のゲート破片を回避し、さらにFSC-HとFCS-Aを使用してダブレットを除外するには、SC-A-FSC-A。
注：これは、 図2に示したゲート戦略に従うことが重要です。 - ゲートアウトPI陽性の死細胞は、あなたのサンプルから30μLを測定し、イベントを記録します。細胞数を計算するために、メーカーのガイドラインに従ってください。
注：フローサイトメトリー測定のための手順4に従い、磁気ベースの前駆細胞の単離のために5と6ステップ、及び前駆亜集団のフローサイトメトリーのソートに7を繰り返します。
前駆サブセットのFOWサイトメトリー分析のために肝臓の単一細胞懸濁液の4染色
抗体 クローン ホスト/アイソタイプ ストック濃度[mg / mlで] 希釈 CD64 X54-5 / 7.1 マウスのIgG1、κ 0.5 1：100 CD16 / 32 93 ラットIgG2aで、λ 0.5 1：100 CD45 30-F11 ラットのIgG2b、κ 0.2 1：200 CD31 MEC13.3 ラットIgG2aで、κ 0.5 1：200 ASGPR1 ポリクローナルヤギのIgG 0.2 1：100 ポドプラニン 2001年1月8日 シリアのハムスターのIgG 0.2 1：1400 ポドプラニン 2001年1月8日 シリアのハムスターのIgG 0.5 1：1400 CD133 Mb9-3G8 ラットIgG1 0.03 3μL CD133 315-2C11 ラットIgG2A、λ 0.5 1：100 CD34 RAM34 ラットIgG2aで、κ 0.5 1：100 CD90.2 53-2,1 ラットのIgG2、κ 0.5 1：800 CD157 BP-3 マウスのIgG2b、κ 0.2 1：600 EpCAMの G8.8 ラットIgG2aで、κ 0.2 1：100 SCA-1 D7 ラットIgG2aで、κ 0.03 10μL マウスのIgG2b、κ MPC-11 0.2 ラットIgG1 RTK2071 0.2 ラットのIgG2b、κ RTK4530 0.2 ラットIgG2aで、κ RTK2758 0.5 ラットIgG2aで、κ RTK2758 0.2 シリアのハムスターのIgG SHG-1 0.2 シリアのハムスターのIgG SHG-1 0.5 正常ヤギIgGをコントロール ポリクローナルヤギのIgG 1 ロバ抗ヤギIgG ロバのIgG 2 1：800 ストレプトアビジン 1 1：400 表1。
抗体 1 2 3 4 5 CD45 APC / Cy7の ラットのIgG2b、κ
0.5μL+ + + + CD31ビオチン + ラットIgG2aで、κ
0.5μL+ + + ASGPR1精製 + + 正常ヤギIgGをコントロール
0.2μL+ + ポドプラニンAPC + + + シリアのハムスターのIgG
1時14希釈の1μL+ CD133 PE + + </ TD> + + ラットIgG1
0.45μLロバ抗ヤギ
アレクサフルオロ488+ + + + + ストレプトアビジン
アレクサフルオロ405+ + + + + 表2。
- ステップ3で説明したように決定し、2.5×10 5個の細胞を含む反応チューブ（1.5 mL）にステップ2.11から細胞懸濁液のアリコートを置きます。
- 遠心機微量を使用して、300×gで、4℃で3分間細胞。
注：この時点で、真空ポンプは、慎重に上清を除去するために利用することができます。 - Fcをブロックミックスに細胞ペレットを再懸濁し、氷上で5分間静置します。染みあたり50μLの総容量を有するFc-ブロックミックスを調製します。 1を追加します。FcRブロッキング試薬の0μL、精製した抗CD64の1μL（1：100; 0.5μgの/染色）、および染色緩衝液の40μL（STバッファ：HBSS、1％（v / v）のFBS、および0.01％染色あたりアジ化ナトリウム）。
注：アジ化ナトリウムは、非常に有毒です。ニトリル手袋、白衣、およびフェイスマスクとして、適切な個人保護具を使用します。 - 細胞にミックスを染色の50μLを追加します（セルの合計容量は現在100μLである）、および抗体混合物を有する細胞、光から保護し、氷上で20分間インキュベートします。
- 染みあたり50μLの総容量を有する抗体ミックスを調製します。 STバッファー50μLのために、基本的な染色のために、以下のコンジュゲート抗体を追加：CD45（0.5μL; 1：200; 0.1μgの/染色）、CD31（0.5μL; 1：200; 0.25μgの/染色）、ASGPR1（1μLを; 1：100; 0.2μgの/染色）、ポドプラニン（1午前1時14希釈のμL; 1：1400のエンド希釈; 0.014μgの/染色）、およびCD133（3μL; 0.09μgの/染色）。
注： 表1は、基本的な汚れのためにと様々なサブセットの追加の表面マーカーのために利用する抗体クローンおよび希釈液をまとめました。 表2に示すように、対応するアイソタイプコントロールおよび/または蛍光マイナス1のコントロール（のFMO）を含む抗体混合物のための余分な細胞懸濁液を準備します。 - 300×gで4分間、細胞を各試料および遠心分離機にSTバッファの400μLを加え、4°C.Discardに上清をし、ロバ抗ヤギIgGの0.125μL（1を含む二次抗体混合物の100μLで細胞を再懸濁： 800; 0.25μgの/染色）、蛍光結合ストレプトアビジンの0.25μL（1：400; 0.25μgの/染色）のST緩衝液100μLインチ
- 光から、氷上で20分間、抗体混合物で保護しながら、細胞をインキュベートします。各サンプルにSTバッファの400μLを加え、300×gで4分間、細胞を遠心分離し、4°C。上清を捨て、STバフの300μLで細胞を再懸濁ERを0.25μg/ mLのPIを含みます。
注：前駆細胞の細胞生存率は時間とともに減少します。したがって、できるだけ早く新鮮なサンプルを測定することが提案されています。
前駆細胞の5磁気マイクロビーズベースの濃縮
- 新しい15 mLコニカル遠心管に、ステップ3で説明したように決定された細胞数に基づいて、1.5〜2×10 6個の細胞を含む肝単一細胞懸濁液のアリコートを移します。
- 180×gで8分間4℃で、細胞を遠心（縮小用いた加速度/ 4及び減速/ 2）。
注：典型的には、1つの健康なC57BL / 6マウスの肝臓（または肝臓組織1gの）は、3つの15 mLコニカル遠心分離管に分離される必要があります。 - HBSS、0.5％（v / v）のウシ血清アルブミン（BSA）の400μLで細胞を再懸濁し、抗CD31マイクロビーズの40μLおよび抗CD45マイクロビーズの30μLを追加します。 4℃で15分間、細胞をインキュベートします。
注：トンを超えないようにしてください分離の純度が大幅に削減されるように彼は、時間をインキュベーション - 細胞に5mLのHBSS、0.5％（v / v）のBSAを追加し、180×gで8分間4°Cのためにそれらを遠心分離（使用して還元加速/ 4及び減速/ 2）。
- 死細胞の除去ビーズ100μlに細胞ペレットを再懸濁し、室温で15分間、それらをインキュベートします。一方、LS分離カラムを準備し、HBSS、0.5％（v / v）のBSA 3mLでそれを較正します。
注：分離の純度が大幅に削減されるように、インキュベーション時間を超えないようにしてください。 - 、細胞に900μLのHBSSの0.5％（v / v）のBSAを追加し100ミクロンのポリアミドフィルターメッシュを使用してそれらをフィルタリングし、LS分離カラム上にロードします。
注：1のLS分離カラムに1肝臓全体をロードします。 - HBSS 3mLの0.5％（v / v）のBSAでカラムを3回洗浄し、フロースルーを収集します。
- 180×gで8分間、4℃のフローをスルー遠心（縮小ACCEを使用して、leration / 4及び減速/ 2）。
- バッファ（RB）（PBSおよび2mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA））さらなる実験手順に応じて、（v / v）のBSAまたはST緩衝液、0.5％を含有するすすぎのいずれかで細胞ペレットを再懸濁します。
複数の肝臓からの結合前駆細胞サブセットの6磁気マイクロビーズベースの自動細胞精製
注：前駆細胞のサブセットは、希少細胞集団を表しているので、複数の肝臓から細胞を結合することは、多くの場合、さらなる実験のために十分な細胞数を達成するために必要とされます。一例として、CD133 +及びGP38 +細胞の分離について説明します。
- CD133 +前駆細胞の単離
- ステップ3で説明したようにステップ5.9の後、細胞をカウントし、RBの100μLに10 6個の細胞（典型的には4-6健康な肝臓の試料をプール）まで再懸濁します。
- 追加抗CD64 1：100および抗CD16 / 32 1：細胞とincubへ1005分間氷上でそれらを食べました。細胞に100抗CD133ビオチン化抗体、さらに10分間氷上でインキュベート：1を追加します。
- RBの5 mLを加え、180×gで8分間遠心分離し、4°C（還元加速/ 4および減速/ 2を使用して）。
- RBの400μLで細胞を再懸濁し、抗ビオチンマイクロビーズの10μLを追加します。 4℃で15分間サンプルをインキュベートします。これはサンプルの純度を低下させるように、インキュベーション時間を超えないようにしてください。
- RBの5 mLを加え、180×gで8分間遠心分離し、4°C（還元加速/ 4および減速/ 2を使用して）。 RB 1 mLにペレットを再懸濁。
- GP38 +前駆細胞の単離
- ステップ3で説明したようにステップ5.9の後、細胞をカウントし、RBの100μLに10 6個の細胞（典型的には4-6健康な肝臓の試料をプール）まで再懸濁します。
- 追加抗CD64 1：100および抗CD16 / 32 1：細胞への100と5分間氷上でインキュベートします。次に、1を追加します。100細胞に対する抗GP38ビオチン化抗体、さらに10分間氷上でインキュベートします。
- RBの5 mLを加え、180×gで8分間遠心分離し、4°C（還元加速/ 4および減速/ 2を使用して）。
- RBの400μLで細胞を再懸濁し、抗ビオチンマイクロビーズの5μLを追加します。 4℃で15分間サンプルをインキュベートします。これはサンプルの純度を低下させるように、インキュベーション時間を超えないようにしてください。
- RBの5 mLを加え、180×gで8分間遠心分離し、4°C（還元加速/ 4および減速/ 2を使用して）。
- RBの1mLに細胞ペレットを再懸濁します。
- ステップ6.1または6.2後の一般的な手順
- 正と負の画分を収集するための2つの追加の空の管を有するチル5ラックの磁気標識した細胞懸濁液を含む15 mLのコニカル遠心チューブを置きます。セパレータの分離プラットフォーム上で冷却ラックを配置します。
- ポジティブ選択プログラムを使用します各サンプル（リンスオプション）との間に大規模な洗浄工程で（Possel_d2）。
注：代わりに自動セパレータのセルの列ベースのマニュアルの分離を使用することにより、試料の純度が低下します。 - 180×gで8分間の陽性率と遠心分離機を収集し、4°C（還元加速/ 4および減速/ 2を使用して）。
- さらに実験手順に応じて、いずれかのRBまたはSTバッファに細胞ペレットを再懸濁します。
- 純度チェックのために、細胞のアリコートを取り、ステップ4で説明したように、それらを染色します。
7.フローサイトメトリー細胞選別
注：任意の前駆細胞サブセットの高純度のソートは、以下に記載のプロトコルを用いて達成することができます。細胞の全体的な収率は、ステップ6に記載されたものよりもはるかに低く、遺伝子発現解析に最適です。
パラメーター 設定 ノズルサイズ 85ミクロン 周波数 46.00から46.20 振幅 38.30から55.20 段階 0 ドロップディレイ 28.68から28.84 減衰 オフ 最初のドロップ 284から297 ターゲットギャップ 9.-14 圧力 45 psiの 表3。
- （ステップ5で説明した）磁気ベースの濃縮から細胞を取得します。ステップ3で説明したように、それらを数えます。ステップ4で説明したように、前駆細胞マーカー（CD133、GP38）、CD31、ASGPR1およびCD45のためにそれらを染色します。
- フェノールレッドフリーのDulbec：ソート培地（SM）を準備0.5％（v / v）のBSAおよび0.01％（v / v）のアジ化ナトリウムを含むコ改変イーグル培地（DMEM）。 、SMで染色された細胞を再懸濁ポリプロピレン丸底チューブにそれらを転送し、氷の上に置きます。
注：アジ化ナトリウムは、非常に有毒です。ニトリル手袋、白衣、およびフェイスマスクとして、適切な個人保護具を使用します。選別された細胞は、機能的アッセイのために使用されている場合はアジ化ナトリウムを使用しないでください。 - 細胞の単離に使用するソーターのタイプのための適切なソフトウェアを使用してください。ソフトウェアを開いて、並べ替えパラメータおよび機械の仕様を設定するには、製造元の指示に従ってください。
注：機械の仕様を表3にまとめます。マシンの仕様は、様々な機関で異なる可能性がありますが、（45 PSIおよび85μmのノズル）がpopulat前駆細胞の生存率を高めるためにソート圧力の低減と、より大きなノズルサイズが必要であることに注意することが重要ですイオンと分類された細胞から調製したRNAの品質。補償を設定するための濃縮された肝前駆細胞を使用することが重要です。他の肝臓や白血球集団は間質人口の次善の解像度で、偽ゲーティング戦略の異なる自家蛍光との結果を持っています。 - マシンを校正し、ソート収集装置にSMの350μLを含む5 mLのポリプロピレン丸底チューブを配置します。サンプル取得およびソートを開始します。亜集団の千のイベントを収集し、サンプルの流れを止めます。
- 選別装置の外管を取り、フローサイトメーター上で選別された細胞を測定します。生きている細胞間に存在するソートされた細胞集団の割合を特定します。この割合は、選別された細胞の純度を与えます。
- ソート純度が95％を超える場合、ソート収集装置にRLT溶解緩衝液350μLを含む5 mLのポリプロピレン丸底チューブを置きます。
- 並べ替えを起動し、収集し7,000-間質亜集団あたり10,000事象。
- DNase-とRNaseフリーの反応チューブで選別された細胞を含むRLT溶解緩衝液を移し、さらなる分析まで-80℃でサンプルを記憶。
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Representative Results
実質及び非実質肝細胞（ 図1および図2A）を含む単一細胞懸濁液中の酵素の結果の新規な混合物を使用して、肝臓の消化のためにここに提示手順。赤血球のACK-溶解後、単一細胞懸濁液の分析サイトメトリー直接流れが（ 図1及び2）が可能です。ゲーティング戦略はダブレットと死細胞（ 図2a）の排除を伴います。 CD45、CD31、およびASGPR1のために陰性である細胞がゲートされます。この集団は、肝臓前駆細胞を含み、それらのGP38及びCD133発現（ 図2A）に基づいて分類することができます。 GP38 + CD133 +およびGP38 - CD133 +細胞はCD45の中で最も豊富な細胞集団表す- CD31 - ASGPR1 -健常成人マウスLIVで細胞をER（ 図2A、B）。これらのサブセットは、以前にこのようなEPCAM、SCA-1、およびCD34（ 図2c）のような前駆細胞に関連する付加的な表面マーカーの発現において異なります。
前駆細胞は、肝細胞、肝臓類洞内皮細胞（のLSEC）（ 図1及び図 3）、および前駆細胞は、磁気マイクロビーズベースの分離とさらに精製することができた（ 図3a、b）またはのように、造血および実質細胞から枯渇させることができましたソーティング高純度（ 図1及び4）。 90％を超える純度のCD133 +またはGP38 +細胞の結果の磁気マイクロビーズベースの分離（ 図3a、b）のいずれかの汚染CD45、CD31、またはASGPR1 +細胞について、細胞は非常に生存したままで（ 図3a、b）に 。
2の細胞組成および生存率が異なることができます。これは、組織解離のために利用する酵素混合物の選択のために特に関連しています。ここで、コラゲナーゼPの代わりに、コラゲナーゼDは、肝臓1、 図2、 図8に使用しました。重要なことには、前駆細胞のCD133の発現レベルおよび単離された細胞集団の収率が大幅コラゲナーゼDの存在下で減少した（ 図5A、B）。これに加えて、我々の混合物は、種々の細胞型13の穏やかな分解および継代培養のために非常に適している、ディスパーゼ含まれます。ディスパーゼが表すと共にコラゲナーゼP前駆細胞分析のために肝臓の細胞解離用の理想的な組み合わせ。この組み合わせはまた、肝臓（データは示していない）のトリプシン消化またはプロナーゼ系よりも優れていました。それは、このようなパーコールベースの濃縮2、14のようなその密度遠心分離を、注意することも同様に重要である、このプロトコルで提示された前駆分析のために必要ではなかったです。
図1：記載されているプロトコルのワークフロー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：肝前駆細胞サブセットの新規分類。単細胞懸濁液を、健康な肝臓から調製し、続いて表面マーカーのパネルを用いて染色した：CD45、CD31、CD133およびGP38（A）。死細胞を排除するために、ヨウ化プロピジウム（PI）を用いました。ゲーティング戦略を持つ代表的なドットプロットが示されています。細胞数の決意をフローサイトメトリーのために使用されるゲートはまた、印が付けられています。 （B）の割合と、野生型の未処理動物におけるCD45陰性細胞の中で様々な間質細胞サブセットの肝臓組織1g当たりに存在する細胞の絶対数を示します。 （C）のヒストグラムは、健康な肝臓にストローマ細胞サブセットの区別マーカー特性を表示します。 CD34はB. SCA-1は、Bに存在する亜集団に特異的である一方で、高CD90.2の発現およびCD157の存在は、Aに特異的である、C、D及びEPCAMは人口CとDの平均値±SEMで唯一の存在です。データ（AC）を、2-3の独立した実験を表すのn = 1実験あたり3-4。データWEReは対になっていない、両側t検定* P <0.05、** P <0.005、*** P <0.0001を用いて比較しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：磁気マイクロビーズベースの濃縮および自動化された細胞精製。 （A）CD45の磁気マイクロビーズベースの濃縮- 、CD31 -及びASGPR1 -細胞を濃縮する前と後に描かれています。自動化されたマイクロビーズベースの細胞の単離の（B）代表ドットプロットは左に、CD133 +およびGP38 +細胞のために描かれています。右側には、濃縮前と後の細胞集団の生存率は、の割合として示されていますヨウ化プロピジウム（PI）陰性細胞。平均±SEM;データ（AB）は、1回の実験当たりのn = 3と3つの独立した実験を表します。データは対になっていない、両側t検定* P <0.05、** P <0.005、*** P <0.0001を用いて比較しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：高純度の前駆細胞サブセットの並べ替えフローサイトメトリー。ドットプロットは、ソートされたサンプル（ポストソート）で細胞集団の純度を示します。データは3回の独立した実験を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図5：消化酵素の比較。単一細胞懸濁液を、健康な肝臓から、コラゲナーゼP（ステップ2に記載されるように）またはコラゲナーゼD（1mg / mlの+ DNアーゼIを0.1mg / ml）を用いて調製し、続いて表面マーカーのパネルを用いて染色した、CD45 CD31、CD133、およびGP38（A）。野生型の未処理動物におけるCD45陰性細胞の中で様々な間質細胞サブセットの肝臓組織のグラム当たりに存在する細胞の割合が示されています。 （B）CD133のメジアン蛍光強度はCD133 +細胞集団のために示されています。平均±SEM;データ（AB）は、1回の実験当たりのn = 3と2つの独立した実験を表します。データは対になっていない、両側t検定* P <0.05、** P <0.005、*** P <0.0001を用いて比較しました。ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
肝臓の炎症と異なる起源の損傷は、前駆細胞の増殖および活性化2、3を伴う肝臓での再生プロセスをトリガーします。これらの肝前駆細胞は、細胞性幹有し、おそらく、様々な肝疾患の病理学的機序において重要な役割を果たす。
肝臓前駆細胞の不均一性は、長い間示唆されています。異なる表面マーカーを運ぶサブセットを識別し、肝損傷12の間の炎症関連遺伝子の固有のセットを表現できるCD133およびGP38の新たな表面マーカーの組み合わせを使用して、肝前駆細胞サブセットの再評価。ここで説明する方法は、稀な細胞の直接のフローサイトメトリー分析および種々の肝障害モデルでの直接比較を可能にします。種々の傷害は、複数の前駆体の活性化をトリガーするように、これは、特に適切です小管反応3、4、11、12で観察された細胞の不均一性を反映することができubsets。注目すべきことに、マウスの肝臓組織（0.3 g）を小部分に記載した方法を用いて前駆細胞のフローサイトメトリー分析のために十分な細胞を単離するのに十分です。
サブセットの高純度の集団を提供する仕分けフローサイトメトリーは、独自の遺伝子発現プロファイルを探求する必要があります。以前の報告は、フローサイトメトリーベースの前駆細胞の単離15、16について説明しました 。それにもかかわらず、ここで紹介するプロトコルは、高純度、これらの細胞の生存性を確実に最適化された方法を提供します。なお、前述のインビトロ培養および拡張技術がうまくここ15に提示プロトコルと組み合わせることができ
ソーターフローサイトメトリーの多くの種類は、様々な機関で利用可能であり、それらの特定のインストルメンテーションは若干異なる場合があります。それにもかかわらず、細胞選別のための一般的な原理は、記載されたプロトコルに提示されています。一般的に、より低い圧力とより大きなノズルサイズは、マシンの種類と仕様の独立した絶対に必要です。また、適切な選別培地の利用が著しく生存率および特に遺伝子発現研究のために、重要な因子で選別された細胞のRNAの品質を高めることができます。前駆細胞の選別は、しかしながら、非常に細胞生存率が減少し、選別後の細胞の収率は、（7-10,000イベント/亜集団の高純度の並べ替えのために、4-5健康な肝臓をプールする必要がある）比較的低いです。これはさらに、in vitroでの分析のための制限要因である可能性があります。我々は、 中のため、磁気マイクロビーズベースの分離を示唆していますインビトロで、そのより高い収率および細胞生存性のアッセイ、および複数の指定されたサブセットを分析し、単離が必要とされる場合は特に、遺伝子発現解析のためにソーティングフローサイトメトリー。
細胞の生存率が大幅にソーティングフローサイトメトリーの後に減少するという事実に基づいて、前駆細胞の自動化された磁気ビーズベースの分離が開発され、ここで提示されています。これは、高純度（複数肝臓を組み合わせる）で前駆細胞のより多くの単離を可能にします。さらに、細胞の生存率は、分離プロセスのために必要な時間が大幅に削減されるため、維持されます。前駆細胞の下の数字は、in vitro 1、2、15、16 に拡張することができますが、これらのインビトロ操作は、幹/ PROGENの細胞の特徴を変化させることができる方法を検討することをお勧めしますコンデンサ細胞は、他の間葉系間質細胞集団17、18について記載しました。
提示された磁気マイクロビーズベースの分離の主な制限は、CD133 +およびGP38 +細胞集団は、異種の細胞を表していることです。追加の表面マーカーは、より小さな細胞集団を同定することが必要になる場合があります。
肝幹細胞や前駆細胞が互いにどのように関係するかを理解することは、ローラ・リード、その他1、8、19による優れた研究にもかかわらず、完成には程遠いです。したがって、このようなここで提案1として、高い収率および生存率が得られた技術を慎重に考慮すべきことは、前駆細胞サブセットの分析とそれらの相互接続された関係の理解を拡張するために助けることができます。
全体として、我々は、Tが記載されています彼は最近、12の区別された肝前駆細胞サブセットの単離および分析を詳述しました。また、新規な酵素の組み合わせを使用することにより、稀な前駆体は、直接フローサイトメトリー測定により分析することができました。さらに、プロトコルは、細胞選別または自動化されたマイクロビーズベースの技術のいずれかを使用して、高純度の前駆細胞を濃縮する方法を示しています。
トラブルシューティング：
細胞片のパーセンテージおよび死細胞が高いです
消化（ステップ2）の間に、肝臓試料のピペットがあまりに過酷である場合、単一細胞懸濁液が増加中の細胞死滅のパーセンテージ。肝臓が示唆さよりも大きな片に切断されている場合は、消化が少なく効率的であり、準備中に複数の細胞死をもたらします。
ステップ5の手順を完了した後、サンプルの純度が不十分です
percen場合ステップ2で調製した単一細胞懸濁液中の細胞破片のtages及び瀕死細胞は、マイクロビーズを非特異的に結合し、したがって、分離の純度が大幅に低減され、高すぎます。
マイクロビーズベース精製後の低細胞数
記載されたプロトコルの成功のためには、プロトコルに示唆されるようにマイクロビーズへの細胞の割合が、最適であることが重要です。より多くのマイクロビーズを利用する純度を低減し、単離された細胞の収量と生存率を低下させます。プロトコルで提示されたもの以外の表面マーカーは、前駆体サブセットの単離のために使用されている場合は、マイクロビーズに対する細胞の最適な比率を決定しなければなりません。
GP38 + CD133の磁気マイクロビーズベースの分離-個体群
ステップ5.3ではセクション5の手順に従い説明するように、その後のステップ5、6.2及び6.3に従って、さらに10μL抗CD133 +マイクロビーズを追加D。
絶対細胞数を計算します
肝臓重量は、特定のサブセットの多くの細胞は、グラム肝臓組織あたりに存在するかを計算するために使用されます。
（フローサイトメトリーに基づいて、生細胞中の亜集団の％（）/ 100）は、肝臓片= Zから単離された全生細胞数をxは
（肝臓片の1 /重量）Z =細胞数/ g肝臓組織にxは
この方法で単離することができる他の細胞集団
CD45 +細胞（または造血細胞の亜集団、 例えばクッパー細胞、樹状細胞、T細胞、NK細胞など ）とのLSEC：この消化プロトコルを使用して、以下の肝細胞を単離することが可能です。消化プロトコルは、肝細胞または肝星状細胞の単離には適していません。これらの細胞は比較的低い細胞数で存在し、それらは、パーソナルプラグインと比較して減少し生存率を示し利用可能な方法rを。
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Disclosures
著者には、競合する金融利害関係を持っていません。
Acknowledgments
この作品は、VLKにアレクサンダー・フォン・フンボルト財団Sofja Kovalevskaja賞によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
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