Summary
Leverskader ledsages af progenitorcelle ekspansion, der repræsenterer en heterogen cellepopulation. Novel klassificering af denne cellulære rum giver mulighed for kendingsnummer af flere delmængder. Den her beskrevne fremgangsmåde illustrerer flowcytometrianalyse og høj renhed isolering af forskellige delmængder, der kan anvendes til yderligere analyser.
Abstract
Under kroniske leverskader, progenitorceller ekspandere i en proces kaldet kanalsystem reaktion, som også indebærer udseendet af inflammatorisk cellulært infiltrat og epitelcelle aktivering. Den stamcelle population under sådanne inflammatoriske reaktioner er hovedsagelig blevet undersøgt ved anvendelse enkelt overflade markører, enten ved histologisk analyse eller ved flowcytometri-baserede teknikker. Men nye overflademarkører identificeret forskellige funktionelt adskilte undergrupper inden leveren stamcelle rum / stammer. Fremgangsmåden præsenteres her beskriver isoleringen og detaljerede flowcytometrianalyse af progenitordelmængder anvende nye overflademarkør kombinationer. Desuden demonstrerer, hvordan de forskellige stamceller delmængder kan isoleres med høj renhed under anvendelse af automatiseret magnetisk og FACS sortering-baserede metoder. Vigtigere, hidtil ukendte og forenklet enzymatisk dissociering af leveren muliggør isolering af disse sjældne cellepopulationer med en høj levedygtighedder er overlegen i forhold til andre eksisterende metoder. Dette er især relevant for yderligere at studere progenitorceller in vitro eller til isolering af høj kvalitet RNA til analyse genekspressionsprofilen.
Introduction
Lever regenerering er for det meste forbundet med selv-fornyelse kapacitet på hepatocytter. Alligevel kroniske leverskader forekomme med progenitorcelle aktivering og ekspansion, hvilket har været forbundet med deres evne til at differentiere til hepatocytter og cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Dette er især relevant, fordi under kroniske skader, hepatocytproliferation ikke er effektiv. Trods flere genetiske tracing studier rettet stamceller, deres rolle i leveren regenerering stadig kontroversielt 5, 6, 7, 8. Desuden har aktiveringen af progenitorceller blevet forbundet med øget fibrotisk reaktion i leveren, som rejser spørgsmål om deres nøjagtige rolle under personskader 9, 10.
Den heterogene karakter af stamcelle rummet har længe været foreslået af genekspressionsstudier der isolerede stamceller udtrykker en enkelt overflade markør ved hjælp mikrodissektion eller celle sortering-baserede metoder 1, 11. Faktisk nylig, en ny overflade markør kombination hjælp gp38 (podoplanin) utvetydigt forbundet tidligere enkelt markører for stamceller til forskellige delmængder 12. Vigtigere er det, disse undergrupper ikke kun afveg i deres overflademarkør ekspression men udviste også funktionelle ændringer under skader 12.
Flere dyremodeller har været anvendt til at undersøge progenitorcelle aktivering og leverregenerering. Det forekommer, at de forskellige skade typer fremmer aktiveringen af forskellige undergrupper af progenitorceller 12. Dette kunne forklare den phenotypic afvigelser i kanalsystem reaktion er observeret hos mennesker 4. Således er de komplekse fænotypiske og funktionelle analyser af progenitorceller er afgørende at forstå deres rolle i skader og den sande betydning af kanalsystem reaktion i leversygdomme.
Udover overflade markør kombinationer, de afgørende forskelle i celle isolation protokoller yderligere komplicere konklusioner baseret på tidligere undersøgelser 2. En betydelig mængde af undersøgelser rettet rollen af stamceller, der i høj grad adskiller sig i deres isolation protokol (f.eks, lever dissociation (enzym kombination og varighed af processen), tæthed medium og centrifugering hastighed) 2. En optimeret isolation teknik, der giver bedre levedygtighed for sjældne cellepopulationer og reflekterende af delmængde sammensætning, er blevet udviklet og offentliggjort for nylig 12. Formålet med denne artikel er at give et mere itailed protokol af denne liver celleisolering procedure og undersættet analyse for at muliggøre korrekt gengivelse af teknikken. Derudover protokollen indeholder en sammenligning med den tidligere isolation metode til at påvise de forskelle, sammenlignet med den nye protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev udført med godkendelse af etik og dyr pleje udvalg i Homburg University Medical Center.
1. Forberedelse af materialer og buffere
- Frisk forberede alle buffere kræves for liver fordøjelse ved hjælp af sterile komponenter og en laminar hætte for at undgå bakteriel forurening.
- Forbered indsamling puffer (CB) ved blanding 49,5 ml RPMI-medium og 0,5 ml føtalt bovint serum (FBS; lav endotoxin, varmeinaktiveret) for at opnå en 1% (v / v) opløsning. løsningen på is indtil videre brug opbevares.
BEMÆRK: Ca. 25 ml CB er nødvendig for at fordøje en hel lever. - Forbered fordøjelsen buffer (DB) ved anvendelse af følgende ingredienser: RPMI-medium, 1% (vol / vol) FBS (lavt endotoksin, varmeinaktiveret), collagenase P (0,2 mg / ml), DNase-I (0,1 mg / ml) og dispase (0,8 mg / ml).
BEMÆRK: Ca. 25 ml DB er nødvendig for at fordøje en hel lever. Pre-varme DB i than 37 ° C vandbad før brug. - Rekonstituer enzymerne ved ankomsten i Hanks balanceret saltopløsning (HBSS; collagense P og dispase) eller i DNase-I-puffer (50% (v / v) glycerol, 1 mM MgCl2 og 20 mM Tris-HCl, pH 7,5) , udportionerer det, og opbevar den ved -20 ° C. Opbevar DNase-I buffer ved 4 ° C og bruge det inden for to måneder.
2. Udarbejdelse af Lever Single-celle Suspension
- Afliv ubehandlede vildtype-mus ved cervikal dislokation i overensstemmelse med de lokale etik og dyr pleje udvalg.
- Placer mus på en dissektion bord og våd pels med 70% ethanol. Med en saks, åbne abdomen med en midtlinjeincision i huden, efterfulgt af en Y-snit i retning lemmerne. Åbn bughinden op til brystbenet ved hjælp saksen. For at afdække leveren, forskyde tarmen forsigtigt til højre side med en vatpind.
- Med hjælp fra saks og pincet, fjerne leveren lapper,forlader galdeblære bag, og undgå forurening med bindevæv. Vejes leveren og placere den på is i en petriskål indeholdende HBSS.
- Placer leveren lapperne på en tør petriskål og skæres levervævet i homogene terninger ca. 2 mm en side ved hjælp af en skalpel. Overfør stykkerne i en 15 ml konisk centrifugerør.
- Tilføj 2,5 ml DB til 15-ml konisk centrifugerør indeholder leveren stykker og læg den i en 37 ° C vandbad for at starte fordøjelsesprocessen (en sund lever tager 60-70 min og en syge lever tager 80-90 min ).
BEMÆRK: Hvis man hele leveren bliver fordøjet, bør leveren adskilles i to 15 ml konisk centrifugerør for at sikre god cellelevedygtighed. - Forbered en ny 15-mL konisk centrifugerør at indsamle frigivne leverceller. Placer en polyamid 100-um filter mesh på toppen af røret og våd mesh med 800 pi af CB. Placer koniske centrifugerør på is.
- Bland sampler i 37 ° C vandbad efter 5 og 10 min for at støtte fordøjelsesprocessen ved omrystning af 15 ml konisk centrifugerør indeholdende leveren stykker.
- 15 min efter start af fordøjelsen, bland forsigtigt leveren stykker under anvendelse af en 1000-pi pipette med et snit spids, der muliggør leveren stykker at passere gennem let. Anbring glassene tilbage i vandbadet, så stykkerne til at nøjes med 2 min.
- Fjern supernatanten indeholdende de formidles celler (typisk 2 x 700 pi) og føje den til røret forberedt i trin 2.6. Udskift den fjernede supernatant med DB (2x 700 pi) og læg den tilbage i 37 ° C vandbad.
- Gentag fremgangsmåden beskrevet i trin 2.8 (typisk ved 30, 40, 50, 55, og 60 min), indtil ca. 60-70 min er gået siden starten af fordøjelsen. Fra 40 min og fremefter, bør de resterende lever stykker være lille nok til at passere gennem en uncut 1000-pi pipettespids.
BEMÆRK: Sund leveren er Digeplace helt inden 60-70 minutter, mens fibrotisk lever typisk behov 80-90 min. Ved dette tidspunkt bør levervævet ikke ses i den koniske 15-ml centrifugerør indeholdende leveren stykker, og alle frigivne celler bør overføres i røret fremstillet i trin 2.6. - Ved afslutningen af fordøjelsesprocessen, opsamle cellerne og centrifugeres dem i 8 minutter ved 180 xg og 4 ° C (ved hjælp af reduceret acceleration / 4 og deceleration / 2).
- Resuspender cellepelleten i 1 ml ammonium-chlorid-kalium (ACK) lysepuffer og inkuberes det i 1 min ved stuetemperatur for at lysere de røde blodlegemer. Reaktionen standses ved tilsætning af 5 ml CB, centrifugeres cellerne i 8 minutter ved 180 xg og 4 ° C (ved hjælp af reduceret acceleration / 4 og deceleration / 2). Resuspender cellerne i 4 ml CB og gemme dem på is. Tæl cellerne, som beskrevet i trin 3.
BEMÆRK: Cellepelleten er løs, og derfor supernatanten pipetteres væk i stedet for at blive dekanteret.3. Bestemmelse af celletallet anvendelse af flowcytometri
BEMÆRK: For at bestemme celletal, en automatiseret celletæller, eller ideelt set, er det flowcytometri-baserede celle kvantificering beskrevet nedenfor foreslået i stedet for den klassiske Neubauer kammer-baserede metode. Beskrevet i trin 2 liver enkelt-celle suspension indeholder parenchymale og ikke-parenchymale celler (NPC) med stærkt afvigende størrelser og granularities. Den korrekte udelukkelse af cellerester sammen med gating-on forward scatter, side scatter (FSC-SSC) karakteristisk for NPC'ere når anvendelse af flowcytometri sørger for succesen af den beskrevne protokol 12.
- Forbered en alikvot af leveren cellesuspensionen (20 pi), og der tilsættes 174 pi phosphatpufret saltvand (PBS) og 6 pi propidium iod (PI; slutkoncentration 0,375 ug / ml). Tilføj tælle perler, der giver mulighed for kvantificering af cellerne.
- Gate på SSC-A-FSC-A for at undgå snavs og yderligere udelukke dubletter ved hjælp FSC-H og FCS-A.
BEMÆRK: Det er vigtigt at følge gating strategi afbildet i figur 2. - Gate out PI-positive døde celler, måler 30 uL fra dine prøver, og registrere begivenhederne. Følg producentens vejledning til at beregne celletal.
BEMÆRK: Følg trin 4 til flowcytometri måling, trin 5 og 6 for magnetisk baseret stamcelle isolation, og trin 7 for flowcytometri slags progenitor subpopulationer.
4. Farvning af leveren Single-cellesuspension for FOW cytometrianalyse af progenitordelmængder
antistof Klon Vært / Isotype Stock Koncentration [mg / mL] fortynding CD64 X54-5 / 7.1 Muse IgG1, κ 0.5 1: 100 CD16 / 32 93 Rotte IgG2a, λ 0.5 1: 100 CD45 30-F11 Rotte-IgG2b, κ 0.2 1: 200 CD31 MEC13.3 Rotte IgG2a, κ 0.5 1: 200 ASGPR1 Polyklonalt gede-IgG 0.2 1: 100 Podoplanin 2001/01/08 Syrian Hamster IgG 0.2 1: 1.400 Podoplanin 2001/01/08 Syrian Hamster IgG 0.5 1: 1.400 CD133 Mb9-3G8 Rat IgG1 0.03 3 uL CD133 315-2C11 Rat IgG2a, λ 0.5 1: 100 CD34 RAM34 Rotte IgG2a, κ 0.5 1: 100 CD90.2 53-2,1 Rat IgG2, κ 0.5 1: 800 CD157 BP-3 Muse IgG2b, κ 0.2 1: 600 EpCAM G8.8 Rotte IgG2a, κ 0.2 1: 100 Sca-1 D7 Rotte IgG2a, κ 0.03 10 pi Muse IgG2b, κ MPC-11 0.2 Rat IgG1 RTK2071 0.2 Rotte-IgG2b, κ RTK4530 0.2 Rotte IgG2a, κ RTK2758 0.5 Rotte IgG2a, κ RTK2758 0.2 Syrian Hamster IgG SHG-1 0.2 Syrian Hamster IgG SHG-1 0.5 Normal gede-IgG Kontrol Polyklonalt gede-IgG 1 Æsel-anti-gede-IgG Donkey IgG 2 1: 800 Streptavidin 1 1: 400 Tabel 1.
antistof 1 2 3 4 5 CD45 APC / Cy7 Rotte-IgG2b, κ
0,5 uL+ + + + CD31 biotin + Rotte IgG2a, κ
0,5 uL+ + + ASGPR1 renset + + Normal gede-IgG Kontrol
0,2 uL+ + Podoplanin APC + + + Syrian Hamster IgG
1 pi af en 1:14 fortynding+ CD133 PE + + </ Td> + + Rat IgG1
0,45 uLÆsel-anti-ged
Alexa Fluor 488+ + + + + Streptavidin
Alexa Fluor 405+ + + + + Tabel 2.
- Anbringes en alikvot af cellesuspensionen fra trin 2.11 ind i et reaktionsrør (1,5 ml) indeholdende 2,5 x 10 5 celler, bestemt som beskrevet i trin 3.
- Centrifuger cellerne i 3 minutter ved 300 xg og 4 ° C under anvendelse af en mikrocentrifuge.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan en vakuumpumpe anvendes til forsigtigt at fjerne supernatanten. - Resuspender cellepelleten i Fc-blok blandes og inkuberes det i 5 minutter på is. Forbered Fc-blok blanding med et totalt volumen på 50 pi pr pletten. Tilsæt 10 pi FcR-blokerende reagens, 1 pi oprenset anti-CD64 (1: 100; 0,5 ug / plet), og 40 pi farvning buffer (ST buffer: HBSS, 1% (vol / vol) FBS og 0,01% natriumazid) pr pletten.
BEMÆRK: Natriumazid er meget giftig. Brug egnede personlige værnemidler, såsom nitril, et laboratorium frakke og en ansigtsmaske. - Tilsæt 50 pi farvning mix til cellerne (den samlede mængde af celler er nu 100 pi) og inkuberes cellerne med antistoffet mix, beskyttet mod lys og i 20 minutter på is.
- Forbered antistoffet mix med et samlet volumen på 50 pi pr pletten. For 50 pi ST buffer, tilføje følgende konjugerede antistoffer til grundlæggende farvning: CD45 (0,5 pi, 1: 200; 0,1 ug / plet), CD31 (0,5 pi, 1: 200; 0,25 pg / plet), ASGPR1 (1 uL ; 1: 100; 0,2 ug / plet), podoplanin (1 pi af en 1:14 fortynding; 1: 1.400 ende fortynding 0,014 ug / plet), og CD133 (3 pi; 0,09 ug / plet).
BEMÆRK: Tabel1 opsummerer antistof-kloner og fortyndinger anvendes til basale pletter og for yderligere overflademarkører af de forskellige undergrupper. Forbered ekstra cellesuspensioner for antistoffet-blanding indeholdende de tilsvarende isotypekontroller og / eller fluorescens minus en kontroller (FMO'er), som vist i tabel 2. - Tilsæt 400 pi ST buffer til hver prøve og centrifugeres cellerne i 4 minutter ved 300 xg og 4 ° C.Discard supernatanten og resuspender cellerne i 100 pi sekundært antistof-blanding indeholdende 0,125 pi æsel-anti-gede-IgG (1: 800; 0,25 ug / plet) og 0,25 pi fluorescerende streptavidin (1: 400; 0,25 ug / plet) i 100 pi ST buffer.
- Inkubér cellerne mens beskyttet mod lys og med antistoffet mix i 20 min på is. Tilsæt 400 pi ST buffer til hver prøve og centrifugeres cellerne i 4 minutter ved 300 xg og 4 ° C. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 300 pi ST buffis indeholdende 0,25 ug / ml PI.
BEMÆRK: Cellen levedygtighed progenitorceller aftager med tiden; Derfor foreslås det at måle friske prøver så hurtigt som muligt.
5. Magnetisk mikroperle-baserede Berigelse af stamceller
- En delmængde overføres af leveren enkeltcelle-suspension indeholdende 1,5-2 x 10 6 celler, baseret på celletælling bestemt som beskrevet i trin 3, til et nyt 15-ml konisk centrifugerør.
- Centrifuger cellerne i 8 minutter ved 180 xg og 4 ° C (under anvendelse af reduceret acceleration / 4 og deceleration / 2).
BEMÆRK: Typisk vil en rask C57BI / 6 muselever (eller 1 g levervæv) skal adskilles i tre 15 ml konisk centrifugerør. - Resuspender cellerne i 400 pi HBSS 0,5% (v / v) bovint serumalbumin (BSA), og der tilsættes 40 pi anti-CD31 mikroperler og 30 pi anti-CD45 mikroperler. Inkubér cellerne i 15 minutter ved 4 ° C.
BEMÆRK: Du må ikke overstige than inkubationstid, som renheden af adskillelsen nedsættes betragteligt. - Tilsæt 5 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA til cellerne og centrifugeres dem i 8 minutter ved 180 xg og 4 ° C (ved hjælp af reduceret acceleration / 4 og deceleration / 2).
- Resuspender cellepelleten i 100 pi af døde fjernelse celle perler og inkubere dem ved stuetemperatur i 15 minutter. I mellemtiden udarbejde en LS adskillelse kolonne og kalibrere det med 3 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA.
BEMÆRK: Du må ikke overstige inkubationstiden, som renheden af adskillelsen vil blive væsentligt reduceret. - Tilføj 900 pi HBSS 0,5% (v / v) BSA til cellerne, filtrerer dem under anvendelse af 100-um polyamid filter mesh, og indlæse dem på LS separationskolonnen.
BEMÆRK: Læg ét hele leveren på én LS adskillelse kolonne. - Kolonnen udvaskes tre gange med 3 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA og indsamle gennemløbet.
- Centrifugeres gennemløbet i 8 minutter ved 180 xg og 4 ° C (under anvendelse af reduceret acceleration / 4 og deceleration / 2).
- Resuspender cellepelleten enten i skyllepuffer (RB) (PBS og 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)) indeholdende 0,5% (v / v) BSA eller ST-puffer, afhængig af yderligere eksperimentelle procedure.
6. Magnetisk mikroperle-baserede Automated Cell Oprensning af progenitorcelle Delmængder kombineret fra flere Levere
BEMÆRK: Da stamceller delmængder repræsenterer sjældne cellepopulationer, der kombinerer celler fra flere lever ofte påkrævet for at opnå tilstrækkelige celleantal til yderligere eksperimenter. Som et eksempel, CD133 + og gp38 + celleseparation er beskrevet nedenfor.
- Isolering af CD133 + progenitorer
- Efter trin 5.9, tælle cellerne, som beskrevet i trin 3, og resuspender op til 10 6 celler (typisk samler 4-6 raske leverprøver) i 100 pi RB.
- Tilføj anti-CD64 1: 100 og anti-CD16 / 32 1: 100 til cellerne, og incubspiste dem på is i 5 min. Tilsæt 1: 100 anti-CD133 biotinyleret antistof til cellerne og inkuberes dem på is i yderligere 10 min.
- Tilsæt 5 ml RB og centrifugeres i 8 min ved 180 xg og 4 ° C (ved hjælp af reduceret acceleration / 4 og deceleration / 2).
- Resuspender cellerne i 400 pi RB og tilsæt 10 pi anti-biotin mikroperler. Prøven inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C. Overskrid ikke inkubationstiden, da dette reducerer renheden af prøverne.
- Tilsæt 5 ml RB og centrifugeres i 8 min ved 180 xg og 4 ° C (ved hjælp af reduceret acceleration / 4 og deceleration / 2). Pellet resuspenderes i 1 ml RB.
- Isolering af gp38 + stamfædre
- Efter trin 5.9, tælle cellerne, som beskrevet i trin 3, og resuspender op til 10 6 celler (typisk samler 4-6 raske leverprøver) i 100 pi RB.
- Tilføj anti-CD64 1: 100 og anti-CD16 / 32 1: 100 til cellerne og inkuberes dem på is i 5 min. Dernæst tilsættes 1:100 anti-gp38 biotinyleret antistof til cellerne og inkuberes dem på is i yderligere 10 min.
- Tilsæt 5 ml RB og centrifugeres i 8 min ved 180 xg og 4 ° C (ved hjælp af reduceret acceleration / 4 og deceleration / 2).
- Resuspender cellerne i 400 pi RB og tilsættes 5 pi af anti-biotin mikroperler. Prøven inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C. Overskrid ikke inkubationstiden, da dette reducerer renheden af prøverne.
- Tilsæt 5 ml RB og centrifugeres i 8 min ved 180 xg og 4 ° C (ved hjælp af reduceret acceleration / 4 og deceleration / 2).
- Resuspender cellepelleten i 1 ml RB.
- Fælles skridt efter trin 6.1 eller 6.2
- Placer 15 ml konisk centrifugerør indeholdende de magnetisk mærkede cellesuspensioner på en chill 5 rack med to yderligere tomme rør til opsamling af de positive og negative fraktioner. Placer chill rack på adskillelsen platform af separatoren.
- Brug positive programvalg(Possel_d2) med en omfattende vasketrin mellem hver prøve (skyl option).
BEMÆRK: Brug af kolonne-baserede manuelle adskillelse af celler i stedet for den automatiske separator vil reducere renheden af prøven. - Opsaml den positive fraktion og centrifugeres i 8 minutter ved 180 xg og 4 ° C (ved hjælp af reduceret acceleration / 4 og deceleration / 2).
- Resuspender cellepelleten enten i RB eller ST buffer, afhængigt af yderligere eksperimentelle procedure.
- For en renhed kontrol udtages en alikvot af cellerne og plette dem som beskrevet i trin 4.
7. flowcytometri Cell Sorting
BEMÆRK: En høj renhed slags enhver progenitorcelle delmængde kunne opnås med den nedenfor beskrevne protokol. Det samlede udbytte af celler er meget lavere end den i trin 6, og er bedst til genekspression analyse.
Parameter Indstilling dysestørrelse 85 um Frekvens 46,00-46,20 Amplitude 38,30-55,20 Fase 0 Drop Delay 28,68-28,84 Dæmpning Af Første Drop 284-297 Target Gap 9.-14 Tryk 45 psi Tabel 3.
- Erhverve celler fra den magnetiske-baserede berigelse (beskrevet i trin 5); tælle dem, som beskrevet i trin 3; og plette dem for progenitor markører (CD133, gp38), CD31, ASGPR1 og CD45, som forklaret i trin 4.
- Forbered sortering medium (SM): phenol-rød fri Dulbecco Modificerede Eagles Medium (DMEM) indeholdende 0,5% (v / v) BSA og 0,01% (v / v) natriumazid. Resuspender farvede celler i SM, overføre dem til en polypropylen rundbundet rør, og placere dem på is.
BEMÆRK: Natriumazid er meget giftig. Brug egnede personlige værnemidler, såsom nitril, et laboratorium frakke og en ansigtsmaske. Brug ikke natriumazid, hvis der anvendes de sorterede celler til funktionelle assays. - Brug den relevante software til den type sorter anvendes til celle isolation. Åbn softwaren og følg producentens anvisninger for at oprette sortering parametre og maskinens specifikationer.
BEMÆRK: maskinens specifikationer er sammenfattet i tabel 3. Mens maskinspecifikationerne kunne være forskellig på forskellige institutioner, er det vigtigt at bemærke, at reduktionen af sortering tryk og en større dyse størrelse er nødvendig (45 psi og 85-um dyse) for at forbedre levedygtigheden af progenitorcelle population og kvaliteten af RNA fremstillet fra de sorterede celler. Det er vigtigt at bruge berigede leveren stamceller til indstilling af kompensationen. Andre lever eller leukocytpopulationer har forskellige auto-fluorescens og resultat i en suboptimal løsning på det stromale befolkning og i en falsk gating-strategi. - Kalibrere maskinen og placere en 5-ml polypropylen rundbundet rør indeholdende 350 pi SM i den slags opsamlingsanordning. Start erhvervelse prøve og sortere. Saml 1.000 begivenheder subpopulationen og stoppe prøven flow.
- Tage røret ud af sorteringsanordningen og måle de sorterede celler på flowcytometeret. Identificere den procentdel af det sorterede cellepopulation stede blandt de levende celler. Denne procentdel giver renheden af de sorterede celler.
- Hvis sortering renhed overstiger 95%, anbringes en 5-ml polypropylen rundbundet rør indeholdende 350 pi RLT lysepuffer i sorteringen opsamlingsanordning.
- Start sortere og indsamle 7.00010.000 begivenheder pr stromale delpopulation.
- Overfør RLT lysepuffer indeholdende de sorterede celler i en DNase- og RNase-fri reaktionsrør og opbevare prøverne ved -80 ° C indtil yderligere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proceduren præsenteres her for fordøjelsen af leveren ved anvendelse af en hidtil ukendt blanding af enzymer resulterer i en enkelt-celle suspension indeholdende parenchymale og ikke-parenchymale leverceller (Figur 1 og 2a). Efter ACK-lysering af røde blodlegemer, den direkte flowcytometri analyse af en enkelt cellesuspension er mulig (figur 1 og 2). Gating strategi indebærer udelukkelse af dubletter og døde celler (figur 2A). De celler, der er negative for CD45, CD31, og ASGPR1 er gated. Denne population omfatter leveren progenitorceller og kan grupperes på grundlag af deres gp38 og CD133 ekspression (figur 2a). De gp38 + CD133 + og gp38 - CD133 + celler repræsenterer de mest udbredte cellepopulationer blandt CD45 - CD31 - ASGPR1 - celler i raske voksne mus livER (figur 2a, b). Disse delmængder forskellige i ekspressionen af yderligere overflademarkører der tidligere var forbundet med progenitorceller, såsom EpCAM, Sca-1, og CD34 (figur 2c).
Progenitorceller kunne være udtømt fra hæmatopoietiske og parenchymale celler, såsom hepatocytter og lever sinusformet endotelceller (LSECs) (figur 1 og 3), og progenitorceller kunne oprenses yderligere med magnetisk mikroperle-baserede isolation (figur 3a, b) eller med høj renhed sortering (figur 1 og 4). Det magnetiske mikroperle-baserede isolering af CD133 + eller gp38 + celler resulterer i over 90% renhed (figur 3a, b) vedrørende eventuelle kontaminerende CD45, CD31, eller ASGPR1 + celler, og cellerne forbliver stærkt levedygtige (figur 3a, b).
2. Dette er især relevant for valget af enzym blanding anvendes til væv dissociation. Her blev collagenase P i stedet for collagenase D anvendes til leveren 1, 2, 8. Vigtigere, blev ekspressionsniveauet af CD133 på progenitorceller, og udbyttet af isolerede cellepopulationer stærkt reduceret i nærværelse af collagenase D (figur 5a, b). Ud over dette, vores blandingen indeholdt dispase, som er særdeles velegnet til skånsom disaggregering og subkultivering af forskellige celletyper 13. Collagenase P sammen med dispase betegneren ideel kombination for celle dissociation af leveren for progenitorceller analyse. Denne kombination var også overlegen i forhold til trypsin eller pronase-baserede fordøjelse af leveren (data ikke vist). Det er lige så vigtigt at bemærke, at densitetscentrifugering, såsom Percoll-baserede berigelse 2, 14, var ikke nødvendigt for stamfader analyser præsenteres i denne protokol.
Figur 1: Arbejdsgang af den beskrevne protokol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Novel klassificering af leveren progenitordelmængder. En enkelt-cellesuspension blev fremstillet ud fra sunde lever og efterfølgende farvet med et panel af overflademarkører: CD45, CD31, CD133 og gp38 (A). For døde celle udstødelse, blev propidiumiodid (PI) udnyttes. Repræsentative dot plots med gating strategi er afbildet. Portene bruges til flowcytometri celletal bestemmelse er også markeret. (B) Procentdelene og det absolutte antal celler til stede pr g levervæv fra de forskellige stromale celle-undergrupper blandt CD45-negative celler i vildtype ubehandlede dyr er vist. (C) Histogrammerne viser karakteristiske markør karakteristika stromale celle-undergrupper i en sund lever. Høj ekspression af CD90.2 og tilstedeværelsen af CD157 er specifikke for A, mens CD34 er specifikt for subpopulationen B. Sca-1 er til stede i B, C, D og EpCAM er kun til stede i populationen C og D. gennemsnit ± SEM; data (AC) repræsenterer 2-3 uafhængige forsøg med n = 3-4 pr eksperiment. De data were sammenlignet under anvendelse af en uparret, to-halet t-test * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Magnetisk mikroperle-baserede berigelse og automatiseret celle rensning. (A) Magnetisk mikroperle-baserede berigelse af CD45 -, CD31 - og ASGPR1 - celler er afbildet før og efter berigelse. (B) Repræsentative dot plots af de automatiserede mikroperle-baserede celle isoleringer er afbildet for CD133 + og gp38 + celler, til venstre. Til højre er levedygtigheden af cellepopulationer før og efter berigelse vist som procentdelen afpropidiumiodid (PI) -negative celler. Middelværdi ± SEM; data (AB) repræsenterer 3 uafhængige eksperimenter med n = 3 pr eksperiment. Dataene blev sammenlignet under anvendelse af en uparret, to-halet t-test * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Flowcytometri slags progenitordelmængder med høj renhed. Dot plots skildrer renheden af cellepopulationerne i de sorterede prøver (post-SORT). Dataene repræsenterer 3 uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
= "1"> 
Figur 5: Sammenligning af fordøjelsesenzymer. Den fælles-cellesuspensionen blev fremstillet under anvendelse af collagenase P (som beskrevet i trin 2) eller collagenase D (1 mg / ml + DNase-I 0,1 mg / ml) fra sunde lever og blev efterfølgende farvet med et panel af overflademarkører: CD45, CD31, CD133, og gp38 (A). Procentdelene af celler til stede pr g levervæv fra de forskellige stromale celle-undergrupper blandt CD45-negative celler i vildtype ubehandlede dyr er vist. (B) Den gennemsnitlige fluorescensintensitet af CD133 er afbildet for CD133 + cellepopulationen. Middelværdi ± SEM; data (AB) repræsenterer 2 uafhængige eksperimenter med n = 3 pr eksperiment. Dataene blev sammenlignet under anvendelse af en uparret, to-halet t-test * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001.target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leverbetændelse og skade af forskellig oprindelse udløse regenerative processer i leveren, der er ledsaget af stamcelle ekspansion og aktivering 2, 3. Disse lever stamceller besidder stamceller egenskaber og sandsynligvis spiller en væsentlig rolle i patomekanisme af forskellige leversygdomme.
Heterogenitet liver progenitorceller har længe været foreslået. Revurderingen af lever progenitordelmængder ved hjælp af en ny overflade markør kombination af CD133 og gp38 kunne identificere delmængder, der bærer forskellige overflademarkører og udtrykke et unikt sæt af inflammation-relaterede gener under leverskade 12. Den her beskrevne metode giver mulighed for direkte flowcytometri analyse af sjældne celler og deres direkte sammenligning i forskellige leveren skade modeller. Dette er især relevant, da forskellige skader udløser aktivering af multiple stamfader subsets, der kunne være reflekterende af cellulære heterogenitet observeret i kanalsystem reaktioner 3, 4, 11, 12. Især en lille brøkdel af murint levervæv (0,2 g) er nok til at isolere tilstrækkelige celler til flowcytometrianalyse af progenitorer ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde.
Flowcytometri sortering giver høj renhed bestande af delmængder er nødvendig for at udforske deres unikke genekspression profiler. Tidligere rapporter beskrevet flowcytometri-baserede stamcelle isolation 15, 16. Alligevel protokollen præsenteres her tilvejebringer en optimeret fremgangsmåde, der sikrer høj renhed og levedygtighed af disse celler. Især kan in vitro dyrkning og udvidelse teknikker tidligere beskrevne være pænt kombineret med den protokol præsenteres her 15
Mange typer af flowcytometri sorteringsanlæg er tilgængelige på forskellige institutioner, og deres særlige instrumentationer kan være lidt anderledes. Ikke desto mindre er de generelle principper for cellesortering præsenteret i den beskrevne protokol. Generelt et lavere tryk og større dysestørrelse er absolut nødvendige, uafhængigt af de typer og specifikationer maskine. Endvidere kan anvendelsen af en passende sortering medium øge levedygtigheden og RNA'et kvaliteten af de sorterede celler, hvilket er en vigtig faktor, især for genekspressionsstudier. Sortering af progenitorceller, reducerer imidlertid i høj grad cellelevedygtighed, og udbyttet af celler efter sortering er relativt lav (for høj renhed slags 7-10,000 events / subpopulation, der skal samles 4-5 raske lever). Dette kunne være en begrænsende faktor for yderligere in vitro analyser. Vi foreslår magnetisk mikroperle-baserede isolation ivitro-assays, på grund af dens højere udbytte og cellelevedygtighed, og flowcytometri sortering til genekspression analyse, især når flere specificerede delmængde analyser og der er behov isoleringer.
Baseret på det faktum, at levedygtigheden af celler er stærkt reduceret efter flowcytometri sortering, har en automatiseret magnetisk mikroperle-baserede isolering af progenitorceller blevet udviklet og præsenteret her. Det giver mulighed for isolering af et større antal progenitorceller med høj renhed (kombinere flere lever). Endvidere er cellernes levedygtighed fastholdes, idet den nødvendige tid til isolering proces er stærkt reduceret. Mens lavere antal af stamceller kan udvides in vitro 1, 2, 15, 16, anbefales det at overveje, hvordan disse in vitro manipulationer kunne ændre de cellulære funktioner i stilken / ProgenMonitor celler beskrevet for andre mesenchymale og stromale cellepopulationer 17, 18.
Den største begrænsning af den præsenterede magnetiske mikroperle-baserede isolation er at CD133 + og gp38 + cellepopulationer repræsenterer heterogene celler. Yderligere overflademarkører kan være nødvendigt at identificere mindre cellepopulationer.
Forståelsen af, hvordan hepatiske stamceller og progenitorceller forholder sig til hinanden er langt fra afsluttet, trods gode undersøgelser af Lola Reid og andre 1, 8, 19. Således kunne nøje overvejelse af teknikker resulterer i højere udbytter og levedygtighed, som den her foreslåede, bidrage til at udvide analyserne af progenitordelmængder og forståelse af deres indbyrdes forbundne relationer.
Samlet set har vi beskrevet than detaljeret isolering og analyse af lever progenitordelmængder der for nylig blev skelnes 12. Desuden ved anvendelse af en hidtil ukendt enzym kombination, sjældne progenitorer kunne analyseres ved direkte målinger flowcytometri. Derudover protokollen viser, hvordan at berige progenitorceller med en høj renhed, ved anvendelse af enten cellesortering eller en automatiseret mikroperle-baseret teknik.
Fejlfinding:
Procentdelen af cellerester og døende celler er høje
Hvis der under fordøjelse (trin 2) afpipettering af leverprøverne er for barsk, procentdelen af døende celler i de enkelt-cellesuspension stiger. Hvis leveren skæres i større stykker end antydet, fordøjelsen er mindre effektiv og resulterer i mere celledød under fremstillingen.
Efter at have afsluttet proceduren i trin 5, renheden af prøverne er ikke tilstrækkeligt
Hvis percenlene ved cellerester og døende celler i enkeltcelle-suspension fremstillet i trin 2 er for høje, mikroperlerne binder uspecifikt, og derfor er renheden af isolation stærkt reduceret.
Lav celle nummer efter mikroperle-baserede rensning
For succes af den beskrevne protokol, er det vigtigt, at forholdet mellem celler til mikroperler er optimal, som foreslået i protokollen. Udnytte flere mikroperler reducerer renheden og nedsætter udbyttet og levedygtigheden af de isolerede celler. Hvis der anvendes andre end dem, der præsenteres i protokollen overflademarkører for stamcelle delmængde isolation, skal bestemmes det optimale forhold af celler til mikrokugler.
Magnetisk mikroperle baseret isolering af gp38 + CD133 - befolkning
Følg trin i afsnit 5. I trin 5.3 tilføje derudover 10 pi anti-CD133 + mikroperler, derefter følge trin 5, 6.2 og 6.3 som beskriverd.
Beregning absolutte celletal
Leveren vægt anvendes til at beregne, hvor mange celler af en bestemt delmængde er til stede per gram levervæv.
(% Af subpopulationen i levende celler (baseret på flowcytometri) / 100) x samlede levende celleantal isoleret fra leveren stykke = Z
(1 / vægt af lever stykke) x Z = celle nummer / g levervæv
Andre cellepopulationer, som kan isoleres med denne metode
Det er muligt at isolere de følgende leverceller ved anvendelse af denne fordøjelse protokol: CD45 + celler (eller subpopulationer af hæmatopoietiske celler, f.eks Kupffer-celler, dendritiske celler, T-celler, NK-celler, etc.) og LSECs. Fordøjelsen protokollen er ikke egnet til isolering af hepatocytter eller hepatiske stjerneformige celler. Disse celler er til stede ved relativt lave celleantal og de viser nedsat levedygtighed sammenlignet med other tilgængelige fremgangsmåder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Alexander von Humboldt Foundation Sofja Kovalevskaja Award til VLK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
- Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
- Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
- Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
- Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
- Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
- Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
- Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
- Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
- Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
- Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
- Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
- Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
- Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
- Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).
